第六章微生物的生长与控制.ppt

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1、第六章 微生物的生长与控制,【知识目标】 1.了解微生物生长的概念。 2.理解环境条件对微生物生长的影响和控制方法，工业上常用的微生物培养技术。 3.掌握几种常用的微生物生长量的测定方法，微生物的生长曲线及对生产实践的指导意义，微生物的诱变育种和常用的微生物菌种保藏的方法。 【技能目标】 1.能够运用微生物生长量的相关理论知识，完成微生物生长量的测定。 2.能够运用微生物生长规律的相关理论知识，完成微生物生长曲线的绘制，并学会如何运用微生物的生长曲线来指导生产实践。 3.能够运用微生物菌种保藏的相关知识，完成生产菌种的保藏工作。,第一节 微生物的生长,一、微生物生长的概念 微生物生长是细胞物质

2、有规律地、不可逆增加，导致细胞体积增大的生物学过程，这是微生物个体生长的定义。 当微生物生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起个体数量增加，这是微生物的繁殖。 由于微生物个体微小，生长与繁殖这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时，往往将这两个过程放在一起讨论，这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加，这是微生物群体生长的定义。,二、微生物生长量的测定,（一）微生物细胞数目的测定方法 1细胞总数计数法 细胞总数计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般包括显微镜直接计数法、涂片计数法和比浊法。 （1）显微镜直

3、接计数法 这类方法是利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。,图6-1 血球计数板和血球计数板计数网的分区和分格,血球计数板是一块特制的载玻片（如图6-1），上面有特定面积（1mm2）和高度（0.1mm）的计数室，在1mm2的面积里又被刻划成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或25个）小格，但整个计数室都是由400个小格组成。,将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计算45个中格的菌体总数，并求出每个小格所含菌体的平均数，再按下面公式求出每毫升样品所含的菌体数。,（2）涂片计数法 用计数板附带的0.01mL

4、吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有1cm2面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在1cm2面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出1cm2中的菌数，然后按1cm2面积上的菌液量和稀释度，计算每毫升原液中的含菌数。,每毫升原菌液的含菌数 视野中的平均菌数1cm2/视野面积 100稀释倍数,（3）比浊法 比浊法是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度（或透光度）可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的菌悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬

5、液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器（如图6-2）。,图6-2 比浊法,此法比较简便，但使用有局限性。 菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。,2活菌计数法 活菌计数法是通过测定样品在培养基上形成的菌落数来间接确定其活菌数的方法，故又称平板计数法（如图6-3）。活菌计数法的特点是计算的结果是活菌落。在进行活菌计数时要注意样品的稀释度，保证一个活细胞可形成一个菌落。 （1）涂布平板法 用灭菌的涂布器将一定体积（不大于0.1mL）适当稀释度的菌液涂布在琼脂培养基的表面，然后保温培养到有菌落出现，记录菌落的数目并换算成每毫升试样中的活细胞数量。 （2

6、）倒平板法 将样品稀释到一定浓度，取一定体积（0.1mL1mL）倒入冷却至45的固体培养基中混合，然后倒入无菌平皿中制成平板，培养后出现菌落，由菌落数推算出活菌总数。,图6-3 涂布平板法和倒平板法,（3）滤膜过滤法 当待测样品中菌数很低时，可以将样品通过膜过滤器（如图6-4），然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计。,图6-4 滤膜过滤法,测定微生物生长的相关生理指标，也可以间接的反应出微生物的生长量，常用以下方法来测定。 1重量法 此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长量的测定。 将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离

7、出来，经洗涤，离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。一般说来，干重为湿重的10%20%。,（二）微生物生理指标的测定方法,2体积测量法 体积测量法又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。具体方法是取一定量的待测培养液（如10mL）放在有刻度的离心管中（如图6-5），设定一定的离心时间（如5min）和转速（如5000rpm），离心后，倒出上清液，测出上清液体积为V，则菌

8、丝浓度为（10-V）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产中测定微生物生长量的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。,图6-5 刻度离心管,3测定菌种细胞内化学成分 测定菌种细胞内化学成分的方法较复杂，操作困难，但较准确，菌种细胞内化学成分的多少，可反映出群体中菌体数量的多少。 （1）测定含氮量 微生物细胞的含氮量一般比较稳定，所以常作为生长量的指标，大多数细菌的含氮量为其干重的12.5，酵母菌为7.5，霉菌为6.0。根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量（包括了杂环氮和氧

9、化型氮）。细菌中蛋白质含量占细菌固形物的50%80%，一般以65%为代表，因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算：,（2）氨基氮的测定 具体方法是离心发酵液，取上清液，加入甲基红和盐酸作指示剂，加入0.02N的NaOH调色至颜色刚刚褪去，加入上清液18%的中性甲醛，反应片刻，加入0.02N的NaOH使之变色，根据NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根据培养液中氨基氮的含量，可间接反映微生物的生长状况。 （3）其他生理物质的测定 P、DNA、RNA、ATP、NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖做基质）、耗氧、黏度、产热等指标，都可用于生长量的测定。也可以根据

10、反应前后的基质浓度变化、最终产气量、微生物活性等方面的测定反映微生物的生长。,（4）商业化快速微生物检测法 微生物检测的发展方向是快速、准确、简便、自动化，当前很多生物制品公司利用传统微生物检测原理，结合不同的检测方法，设计了形式各异的微生物检测仪器设备，这些仪器设备正逐步应用于医学微生物检测和科学研究领域。例如全自动微生物快速检测系统（如图6-6）可以在数小时内获得监测结果，样本颜色及光学特征都不影响读数，对酵母菌和霉菌检测同样具有高度敏感。,图6-6 全自动微生物快速检测系统,对于丝状微生物，特别是丝状真菌，通常是通过测定菌丝的长度变化来反映它们的生长速率，主要采用的有如下几种方法。 1培

11、养基表面菌体生长速率测定法 培养基表面菌体生长速率测定法主要测定一定时间内在琼脂培养基表面菌落直径的增加值。一般采用载玻片培养法，方法如图6-7。,图6-7 载玻片培养法,（三）菌丝长度的测定方法,2培养料中菌体生长速率测定法 主要测定一定时间内在固体培养料中菌丝体向前延伸的距离。这种方法常用于食用菌菌丝体生长速率的测定。 3单个菌丝顶端生长速率测定法 具体操作是将待测菌株点植接种于培养基平板的中心，生长一定时间后，将平板置于显微镜载物台上，同时校对所用显微镜的目镜测微尺，并计算每一格的长度。在菌落边缘选择单根菌丝的顶端在低倍镜下聚焦。然后将目镜测微尺与菌丝平行，并选择菌丝开始出现侧枝的部位与

12、目镜测微尺上的一条刻度线重合，这个点即为“参照点”，每隔一定时间测量一次菌丝生长的长度。,图6-8 霉菌菌丝生长（图中的数字为分钟）,第二节 微生物的生长规律,研究微生物的生长规律，需要从研究微生物的个体生长和群体生长两个方面着手。 一、微生物的个体生长和同步生长 以细菌为例介绍微生物的个体生长和同步生长。 目前对细菌的个体生长进行研究主要有两种方法。 一是利用电子显微镜观察细胞的超薄切片； 二是采用同步培养方法。,同步培养能使群体中处于个体生长的不同阶段细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。 以同步培养方法使群体细胞能够处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式称为同步生长。 同步培养细

13、胞常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。,同步培养方法很多，可归纳为机械法与环境条件控制法两类。 1机械法 这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段的细胞体积和质量不同或根据它们同某种材料结合不同的原理设计出来的方法。其中常用的有以下几种方法。 （1）离心方法 （2）过滤分离法 （3）硝酸纤维素滤膜法,图6-9 机械法获得细胞同步培养 a、硝酸纤维素滤膜法 b、离心法,2环境条件控制技术 这类技术是根据细菌生长与分裂对环境因子要求不同的原理设计的一类获得同步细胞的方法。 （1）温度：最适生长温度有利于细菌生长与分裂，不适宜温度如低温不利于细菌生长

14、与分裂。通过适宜与不适宜温度的交替处理之后，通过培养可获得同步细胞。 （2）培养基成分控制：培养基中的碳、氮源或生长因子不足，可导致细菌缓慢生长直至生长停止。因此将不同步的细菌在营养不足的条件下培养一段时间，然后转移到营养丰富的培养基里培养，能获得同步细胞。另外也可以将不同步的细胞转接到含有一定浓度的、能抑制蛋白质等生物大分子合成的化学物质如抗生素等的培养基里，培养一段时间后，再转接到完全培养基里培养也能获得同步细胞。 环境条件控制获得同步细胞的机理不完全了解。这种处理可能是导致细胞内某些物质合成，这些物质的合成和积累可导致细胞分裂，从而获得同步细胞。,二、微生物的群体生长及其规律,微生物个体

15、细胞的生长时间一般很短，很快就进入繁殖阶段，即微生物的群体生长阶段。微生物群体的生长表现为细胞数目或群体细胞物质的增加。工业发酵的过程就是微生物群体细胞新陈代谢的过程，因此研究微生物群体生长的规律对于发酵工业生产具有重要的指导意义。,图6-10 细菌群体形成的过程（图中的数字为小时）,如将少量微生物纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢，后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长，生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老

16、死亡。如用坐标法作图，以培养时间为横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为生长曲线。,（一）微生物的生长曲线,从图6-11可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即： 延滞期， 指数期， 稳定期， 衰亡期。 生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动态学变化过程。 生长曲线各个时期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。,图6-11 细菌生长曲线,1延滞期 这是培养基接种之后开始的一个适应期。当微生物从一种环境进入新的培养环境时

17、，必须重新调整其小分子和大分子的组成，包括酶和细胞结构成分，以适应新环境，因而又有调整期之称。这个时期表现曲线平坦稳定，细菌繁殖极少。工业生产上应尽可能缩短延滞期。延滞期的长短因菌种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为14小时，通常可采取处于快速生长繁殖中的健壮菌种细胞接种、适当增加接种量、采用营养丰富的培养基、种子培养基与下一步培养用的发酵培养基的营养养成分以及培养的其它理化条件尽可能保持一致等措施，可以有效地缩短延滞期，缩短发酵周期。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖、储备充足的酶、能量及中间代谢产物的重要时期。,（二）微生物的生长曲线各阶段说明,2指数期 指数期又称

18、对数期（如图6-12），此期在生长曲线上表现为活菌数直线上升，细菌以稳定的几何级数快速增长，若以乘方的形式表示，即为2n；这里的指数“n”则为细胞分裂的次数或增殖的代数，也即一个细菌繁殖 n代产生 2n个子代菌体，此时期可持续几小时至几天不等。此期细菌形态、染色性、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此在研究微生物的代谢和遗传时，宜用这个时期的细胞；在微生物发酵中以该生长后期的细胞作为种子，接种合适的发酵培养基可以缩短延滞期，从而缩短发酵周期，提高劳动生产率与经济效益。,图6-12 生长曲线的指数期,培养基中细胞的最初个数和对数式生长一段时间后的细胞个数之间存在如下关系： N= N0

19、2n 式中： N 细胞最终数目 N0 细胞初始数目 n 指数生长期细胞繁殖代数 细胞每分裂一次所需要的时间称为代时，以符号 G表示， G t/n。t是指数生长期时间，可从细胞最终数目（N）时的培养时间t2，减去细胞初始数目（N0）时的培养时间 t1 而求得，即t= t2 t1。 因此，如果已知指数生长期的初始细胞数和指数生长期的最终细胞数，就可以计算出 其繁殖的代数（n），计算方法如下：,3稳定期 由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、H2O2等）积累、pH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。到对数末期，微生物生长速度降低，繁殖

20、率与死亡率逐渐趋于平衡，活菌数基本保持稳定，从而进入稳定期，该时期可以维持相当长的时间。 4衰亡期 随着稳定期的继续发展，生长环境的继续恶化和营养物质的短缺，细菌繁殖速度越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形，生理代谢活动趋于停滞。,掌握微生物的群体生长繁殖规律对生产菌种的选择和发酵生产过程的控制具有十分重要的作用。 1延滞期与发酵生产过程 延滞期的长短与生产菌种的菌龄、接种量以及培养基成分有直接的关系。使用对数期菌龄的微生物作为生产“种子”，延滞期较短；如使用延滞期或衰亡期菌龄的微生物作为生产“种子”，则延滞期较长。接种

21、量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长。培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致，延滞期较短。 2指数期与发酵生产过程 指数期的菌体细胞是代谢、生理研究的良好材料；是增殖噬菌体的最适宿主菌龄；是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄；是革兰氏染色菌种鉴定的最佳时期。,（三）微生物的生长曲线对生产实践的指导意义,3稳定期与发酵生产过程 稳定期是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期。某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称为代谢产物合成期；对稳定期的理论研究导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。 4衰亡期与发酵生产过程 衰亡期与菌种的遗传特性有

22、关，有些细菌的培养要经历所有的生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞。衰亡期的形成与菌体是否产芽孢有关，产芽孢的细菌更易于幸存下来。衰亡期的形成与营养物质的消耗和有毒物质的生成有关，补充营养和能源，以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长菌种的存活时间。,第三节 环境条件对微生物生长的影响,一、物理因素对微生物生长的影响与控制 （一）温度 温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增强，当温度上升到一定高度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。 1微生物生长温

23、度三基点 与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有其最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三个基本点，简称生长温度三基点。,2微生物生长的温度类型 根据不同微生物对温度的要求和适应能力，可以把它们区分为低温、中温和高温3种不同的类型。 （1）低温型微生物 （2）中温型微生物 （3）高温型微生物,温度对微生物的影响是广泛的，改变温度必然会影响微生物体内所进行的多种生物化学反应。适宜的温度能刺激生长，不适的温度会改变微生物的形态、代谢、毒力等，甚至导致死亡。总的来讲，温度是通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性，以及RNA的结构和转录等

24、影响微生物的生命活动。,3温度对微生物的影响,利用温度对微生物的影响，在实验室和发酵生产实践中可以采用低温或高温的方法抑制和杀死有害的微生物。常用的方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。 （1）干热灭菌 干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。,4控制温度在生产实践中的应用,火焰灭菌法：火焰灭菌法是指用火焰直接烧灼的灭菌方法。该方法灭菌迅速、可靠、简便，适用于实验室的金属器械（镊子、剪子、接种环等）（如图6-13）、玻璃试管口和瓶口等的灭菌，不适合药品的灭菌。具体做法是将器械放在火焰上烧灼12分钟。若为搪瓷容器，可倒少量95乙醇，慢慢转动容器，使乙

25、醇分布均匀，点火燃烧至熄灭约12min。,图6-13 接种环的火焰灭菌法,干热空气灭菌法：干热空气灭菌法常采用电热烤箱和微波消毒的方法。电热烤箱是利用烤箱的热空气消毒灭菌。烤箱通电加热后的空气在一定空间不断对流，产生均一效应的热空气直接穿透物体，达到灭菌目的。一般繁殖体在干热温度80100中经1h可被杀死，芽孢、病毒需160170经2h方可被杀死。热空气灭菌法适用于玻璃器皿、瓷器以及液体石蜡、各种粉剂、软膏等。灭菌后待箱内温度降至5040以下才能开启箱门，以防器皿炸裂。,微波消毒是利用一种高频电磁波，其杀菌的作用原理，一为热效应，电磁波所到之处产生分子内部剧烈运动，使物体里外湿度迅速升高；二为

26、综合效应，诸如化学效应、电磁共振效应。微波消毒目前已广泛应用于食品、药品的消毒，用微波灭菌手术器械包、微生物实验室用品等亦有报告。若物品先经1过氧乙酸或0.5新洁尔灭湿化处理后，可起协同杀菌作用，再经微波照射2分钟，杀芽孢率由98.81可增加到99.9899.99。微波对人体有一定危害性，其热效应可损伤睾丸、眼睛晶状体等，长时间照射还可致神经功能紊乱。使用时可设置不透微波的金属屏障或戴特制防护眼境等。,（2）湿热灭菌 湿热灭菌法是指用饱和水蒸汽、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：煮沸消毒法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭

27、菌法、和间歇蒸汽灭菌法。 煮沸消毒法：将水煮沸至100，保持510min可杀灭微生物繁殖体，保持13h可杀灭芽孢。如向水中加入12碳酸氢钠，沸点可达105，能增强杀菌作用，还可去污防锈。此法适用于不怕潮湿耐高温的搪瓷、金属、玻璃、橡胶类物品。 高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法是实验室及发酵生产中常用的灭菌方法。在常压下水的沸点为100，如果加压则可提供高于100的蒸汽，加之蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。适用于各种耐热物品的灭菌。,图6-14 手提式和立式高压蒸汽灭菌锅,间歇蒸汽灭菌法：间歇蒸汽灭菌法是用流通蒸汽反复几次处理的灭菌方法。

28、将待灭菌物品置于阿诺氏灭菌器或蒸锅（蒸笼）及其他灭菌器中，常压下100处理1530min，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度（2837）保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发为营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。此法的缺点是灭菌比较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌设备时也可用此法灭菌。 巴氏消毒法：巴氏消毒法也称低温消毒法、冷杀菌法，是一种利用较低的温度既可杀死病菌又能保持物品中营养物质风味不变的消毒法。,图6-15 高温瞬间巴氏消毒法的操作流程图,湿热灭菌较干热灭菌效果好主要有三点原因： 蛋

29、白质在含水多时易变性，含水量越多，愈易凝固； 热蒸汽穿透能力强，传导快。 蒸汽具有潜热，当蒸汽与被灭菌的物品接触时，可凝结成水而放出潜热，使温度迅速升高，加强灭菌效果。,微生物细胞通常具有比环境高的渗透压，因而很容易从环境中吸收水分。除极端的生态条件以外，适合于微生物生长的渗透压范围较广。 微生物在等渗透压下生长良好，微生物在质量为58.5g/L的NaCL溶液中形态和大小不变，并生长良好。 在低渗透压（NaCL溶液浓度等于或低于0.1g/L）下除能破坏去壁的细胞原生质体的稳定性以外，一般不对微生物的生存带来威胁。 而高渗透压（NaCL溶液浓度等于或高于200g/L）下会使细胞原生质脱水而发生质

30、壁分离，因而能抑制大多数微生物的生长，如图6-16。 利用这一原则可以在食品加工和日常生活中用高浓度的盐或糖来加工蔬菜、肉类和水果等，是在民间流传已久的防腐方法。常用的食盐浓度为1015，蔗糖浓度为5070。,（二）渗透压,微生物的生长繁殖所需要的环境都有一定的酸性、碱性或中性，这种酸性、碱性或中性可以用氢离子浓度的对数（pH值）来表示。 每种微生物的生长所需要的环境都有一个pH范围，也有一个最适合生长的pH值。（如表6-3）。 大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH值为6.57.5，适宜范围为4.010.0；放线菌多以pH值中性至微碱性为宜，最适pH为7.08.0；真菌一般偏酸性，最适pH值多

31、为5.06.0。只有极少数的微生物能够在pH值低于2（强酸性）或pH值大于10（强碱性）的环境中生长，被称之为嗜酸微生物或嗜碱微生物。 无论微生物对环境pH的适应性多么不同，任何生物细胞内的pH值都近于中性，这就可避免DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性。,（三）酸碱度,1专性好氧菌 2兼性厌氧菌 3微好氧菌 4耐氧菌 5专性厌氧菌,图6-17 分子氧浓度和分压对3类微生物生长的影响,图6-18 五类对氧关系不同的微生物 在半固体琼脂柱中的生长状态,（四）氧气,（五）辐射 自然界中的一切物体，只要温度在绝对温度零度以上，都可以电磁波的形式时刻不停

32、地向外传送热量，这种传送能量的方式称为辐射。 辐射灭菌是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物体上的微生物的一种有效方法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线（UV）和电离辐射等。 它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死微生物。 电离辐射灭菌效果可靠，无残留毒性，穿透力强，可对完整的物体灭菌，一般采用60钴辐射的射线灭菌，也有少数采用137铯，或采用电子加速器，利用高能电子束灭菌。,紫外线灭菌是指用紫外线照射杀灭微生物的方法，紫外线不仅能使核酸蛋白变性，而且能使空气中氧气产生微量臭氧，从而达到共同杀菌作用。用于紫外线灭菌的波长一般为200300nm。 紫外线灭菌方法适于被照射物体表面灭菌、无菌室空

33、气的灭菌；不适用于药液的灭菌及固体物料的深部灭菌。紫外线灭菌目前是我国空气和表面消毒的常用方法。 紫外线杀菌原理是通过紫外线对细菌、病毒等微生物的照射，以破坏其生命中枢DNA的结构，导致相邻的胸腺嘧啶（T）形成二聚体，形成嘧啶水合物和使DNA发生断裂和交联，导致微生物的蛋白质无法形成，使其立即死亡或丧失其繁殖能力。一般紫外线在12秒内就可达到灭菌的效果。 目前已证明，紫外线能杀灭细菌、霉菌、病毒和单胞藻类。,图6-19 紫外线照射前DNA,图6-20 紫外线照射后的DNA断裂分子链和胸腺嘧啶二聚体阻止细胞的复制,（六）干燥 水分是微生物正常生命活动必不可少的。 生活在干燥环境中的微生物会导致细

34、胞失水而造成代谢停止以至死亡。微生物的种类、环境条件、干燥的程度等均影响干燥对微生物的作用。 自从Scott 1957年提出水分活度（AW，water activity）的概念以来，人们在研究水分与微生物的关系问题时，已经越来越多的开始采用水分活度来表示。 各类微生物的生长都需要一定的水分活度（AW），只有环境中的水分活度大于某一临界值时，特定的微生物才能生长。一般来说。细菌的AW大于0.9，酵母菌AW大于0.87，霉菌AW大于0.8，一些耐渗透压微生物除外。,二、化学因素对微生物生长的影响与控制,许多化学药物能够抑制或杀死微生物，其中通过破坏微生物细胞结构或代谢机能而杀死微生物的化学药剂称为

35、杀菌剂；另一类不破坏细胞结构而只干扰新细胞物质合成和微生物生长繁殖的化学药剂称为抑菌剂。 根据对菌体的作用机理不同大致可分为： （1）使菌体蛋白质变性或凝固，如高浓度酚类、醇类、重金属盐类、酸碱类、醛类等。 （2）损伤胞浆膜，如低浓度酚类、表面活性剂、醇类等脂溶剂。 （3）干扰细菌的酶系统和代谢，如某些氧化剂、低浓度重金属盐类。 （4）改变核酸的功能，如染料、烷化剂等。 依照化学性质和应用目的不同，分为有机化学类药剂、无机化学类药剂、表面活性剂、化学治疗剂等类型。,（一）有机化学类药剂 有机化学类药剂主要有酚、醇、醛、酸及其它几种新型有机杀菌剂。 1酚及其衍生物 酚及其衍生物是医学上普遍使用的

36、一种环境消毒剂。 使用最早的是苯酚，有效杀菌浓度为2%5%，由于具有难闻的气味和对皮肤有刺激性而很少在临床上使用。 苯酚的衍生物，如甲酚、间苯二酚和六氯苯酚等具有较强的杀菌作用和较少的刺激性，它们在医院常用于痰、脓液和粪便等以及手术前的消毒，如煤酚皂（俗称来苏尔）是乳化的甲酚溶液，常用3%5%的浓度来消毒桌面、用具等。,2醇类 醇类化学药剂目前应用最为广泛的是乙醇，乙醇属中效型，能杀灭细菌繁殖体、某些致病菌如结核杆菌及大多数真菌和病毒，但不能杀灭细菌芽孢，短时间不能灭活乙肝病毒。适用于皮肤、物体表面及医疗器械的消毒。乙醇浓度在70%75%时灭菌力最强，效果最好。 3醛类 醛类化学药剂对微生物的

37、杀灭作用主要依靠醛基，此类药物主要作用于菌体蛋白的巯基、羟基、羧基和氨基，可使之烷基化，引起蛋白质凝固造成菌体死亡。福尔马林是37%40%的甲醛水溶液，加热后易挥发，常用于保存生物标本和空气消毒，在高浓度下作用可杀死芽孢。,4酸类 酸类能抑制微生物（尤其是霉菌）酶和代谢的活性，对细菌繁殖体及芽孢均有杀灭作用。酸类物质易损伤物品，故一般不用于居室消毒。5%盐酸可消毒洗涤食具、水果；乳酸和醋酸常用于空气消毒，100m3空间用10g乳酸薰蒸30min，即可杀死葡萄球菌及流感病毒。有机酸类常加在食品、饮料或化妆品中以防止霉菌等微生物的生长。 5环氧乙烷 环氧乙烷的杀菌原理是通过对微生物蛋白质分子的烷基

38、化作用，干扰酶的正常代谢而使微生物死亡。环氧乙烷气体和液体都有杀菌作用，但一般作为气体消毒剂使用，杀菌谱广，杀菌力强，可杀灭所有微生物，属高效灭菌剂。环氧乙烷使用浓度为50mg/L，常将其用于皮革、塑料、医疗器械、医疗用品包装后进行消毒或灭菌。,（二）无机化学药剂 无机化学药剂主要包括卤化物、重金属、氧化剂、无机酸和碱等。 1卤化物 卤化物对细菌原生质体及其它结构成分有高度的亲和力，易渗入细胞，进入细胞后与菌体原浆蛋白的氨基或其它基团相结合，使菌体有机物分解或丧失功能呈现杀菌作用。 在卤素中氟、氯的杀菌力最强，其次为溴、碘，但氟和溴一般消毒时不用。其中以碘和氯最常用。 氯主要包括氯气和氯化物。

39、氯气使用浓度为0.31.5g/，可用于饮水消毒，也可用于游泳池和垃圾场的消毒。氯化物如次氯酸也是常用的消毒剂，其杀灭微生物有效成分常以有效氯表示，一般使用浓度为质量分数5%20%， 氯化物应现用现配，不能用于金属制品及有色纺织品的消毒。,2重金属及其化合物 一些重金属离子是微生物细胞的组成成分，当培养基中这些重金属离子浓度低时，对微生物生长有促进作用，浓度高时则会产生毒害作用；还有一些重金属离子，无论浓度大小，对微生物的生长均会产生有害或致死作用。 重金属离子具有很强的杀菌效力，其易与带阴电荷的菌体蛋白质结合，使之变性或沉淀，或与酶的-SH基结合，使酶失去活性。 此外，微量的重金属离子还能在细

40、胞内不断累积并最终对生物发生毒害作用。重金属及其化合物主要有汞化合物、硫酸铜、银盐和含砷化合物。,3氧化剂 氧化剂可通过对细胞成分的氧化作用达到杀菌目的。 常用的氧化剂有高锰酸钾和过氧化氢，前者常用作卫生和实验室消毒，后者还可用作食品包装材料和镜片的杀菌。 4碱类 碱类包括氢氧化钠、氢氧化钾、生石灰等碱类物质。 其作用机理是氢氧根离子可以水解蛋白质和核酸，使微生物的结构和酶系统受到损害，同时可分解菌体中的糖类而杀灭细菌和病毒。,（三）表面活性剂 能降低表面张力的物质称为表面活性剂，这类物质加入到培养基中，可影响细胞的生长与分裂。 表面活性剂能聚集在菌体表面，引起菌膜损伤并和菌体蛋白作用表现出杀

41、菌能力。 胆汁、胆盐、肥皂、洗衣粉都是表面活性剂，还有一些人工合成的阳离子表面活性剂如洗必泰、新洁尔灭。 （四）化学治疗剂 化学治疗剂是一类能选择性的抑制或杀死人畜和家禽体内的病原微生物并可用于临床治疗的特殊化学药剂。 化学治疗剂与杀菌剂或抑菌剂不同，可以内用。化学治疗剂主要有抗代谢物和抗生素。,1抗代谢物 在微生物生长过程中常常需要一些嘌呤、嘧啶、叶酸以及氨基酸等生长因子才能正常生长，可以利用生长因子的结构类似物干扰微生物的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。此类生长因子的结构类似物又称为抗代谢物。 抗代谢物种类 次黄嘌呤类似物主要是6-巯基嘌呤 嘧啶类似物主要有5-氟尿嘧啶FdUMP与d

42、UMP（磷酸脱氧核糖尿嘧啶核苷） 氨基酸类似物有氮杂丝氨酸 叶酸类似物有氨基蝶呤和氨甲蝶呤,2抗生素 抗生素是另一类重要的化学治疗剂，是微生物或某些高等动植物在生命活动过程中产生的具有抗病原体或其它活性的一类代谢物，以及用化学方法合成或半合成的化合物，具有低浓度时就可抑制或杀死微生物的作用，是临床上经常使用的重要药物。 抗生素杀菌作用主要有4种机制： （1）抑制细胞壁的形成； （2）影响细胞膜的功能； （3）干扰蛋白质的合成； （4）阻碍核酸的合成。,三、工业上常用的微生物培养技术,工业上常用的微生物培养技术主要有分批培养、连续培养和补料分批培养。 （一）分批培养 在一个相对独立密闭的系统中，

43、一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养。由于它的培养系统的相对密闭性，故分批培养也叫密闭培养。由于它的相对简单与操作方便，在微生物学研究与发酵工业生产实践中仍被广泛采用。 （二）连续培养 若将新鲜的培养基连续加入均匀搅拌的培养物中，同时排出含有细胞和发酵产物的发酵液，就可进行连续培养，并可在较长的时期内维持生长。为研究微生物对环境的影响以及在最佳环境条件下连续生产细胞和代谢产物提供了一种独特的方法。,连续培养的一个重要特征是使微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养的方法大致可以分为两类，即恒化器法和恒浊器法。“恒化”指的是恒定的化学环境，“恒浊”指的是恒定的细

44、胞浓度。,图6-21 微生物连续培养装置,恒化器和恒浊器装置相似，都有一个恒定体积的培养容器，并且都是依靠流加和排出来维持培养槽内液体体积的恒定，只是培养过程中对微生物生长的控制方法不同。图6-22为简单的恒化器和恒浊器的示意图。,图6-22 恒化器与恒浊器简图,恒化器法与恒浊器法都是在一固定容器内培养微生物，当微生物进入对数生长期时，要不断地加入新鲜的培养基，同时流出培养物，以使培养器中培养物的体积保持恒定。 恒化器是通过调节培养液的流速来进行控制的，其最基本的操作条件是由流速决定的稀释速率不等于或不超过微生物的最大生长速率。 恒浊器可以在恒化器的基础上添加浊度控制仪而构成。 发酵工业上采用

45、多罐串联连续培养的方法，可以大大缩短发酵周期，提高设备的利用率。,（三）补料分批培养 补料分批培养是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段适当补加部分配料成分或碳源，以提高菌体或代谢产物的产率。 补料分批培养在发酵过程中的应用，是发酵技术上一个划时代的进步。补料技术本身也由少次多量、少量多次，逐步改为流加，近年来又实现了流加补料的微机控制。 但是，发酵过程中的补料量或补料率，目前在生产中还只是凭经验确定，或者根据一至两个一次检测的静态参数（如基质残留量、p、溶解氧浓度等）设定控制点，带有一定的盲目性，很难同步地满足微生物生长和产物合成的需要，也不可能完全避免基质的调控反应。因而现

46、在的研究重点在于如何实现补料的优化控制。,第四节 微生物的菌种选育,一、从自然界中分离筛选菌种 从自然界分离筛选新菌种一般包括：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等几个步骤。 （一）采样 采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。 采样的对象也可以来自植物、腐败物品、某些水域等。 采样地点不同，采样的方法也不同。 由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，因此采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4下，但贮存时间不宜过长。,（二）增殖培养 收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接进行分离。如果样品含所需菌种很少，就

47、要设法增加该菌的数量，进行增殖（富集）培养。 所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离。 增殖培养可以通过配制选择性培养基或设定一定的培养条件得以实现。,通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态，还不能得到微生物的纯种，所以有必要进行分离纯化，获得纯种。 常用的分离方法有划线分离法、稀释法和组织分离法。,图6-23 食用菌组织分离法操作过程,（三）纯种分离,（四）生产性能和毒性的测定 由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定，工作量巨大，而且是不必要的。因此可适当简化，一般采

48、用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直至获得13株较好的菌株，作为发酵生产用菌种。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。 自然界的一些微生物在一定条件下将会产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。,从自然界直接分离得到的菌种，往往还不完全符合工业生产的要求，如产量低、副产物多、生长周期长等，因而对菌种的要求不能仅停留在“选”种上，还要进行“育”种，根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。 诱变育种是通过物理或化学诱变剂处理菌种，提高突变几率，扩大变异幅度，从中选

49、出具有优良特性的变异菌株。具有速度快、收效大、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种重要方法。,二、微生物的诱变育种,（一）诱变育种工作流程,诱变育种整个流程主要包括诱变过程和筛选过程。 （二）诱变过程 由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬浮液）进行诱变处理，然后以一定稀释度涂布平板，至平板上长出单菌落为止的过程为诱变过程。,1出发菌种的选择 出发菌株的纯一性、菌种系谱、形态、生理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株可以参考以下原则。 （1）选择纯种作为出发菌株 （2）选择遗传特性好的菌株为出发菌株 （3）选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株 2斜面培养 出发菌株的斜面培养非常重要，要根据菌种的要求选择最佳培养基和培养条件，掌握好斜面培养时间，选取对诱变剂最敏感的斜面种龄进行单孢子悬液的制备。,3单孢子悬浮液制备 这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，要对上步培养