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1、第 六 章 微生物的生长及其控制,nwsuaf-micro,微生物的个体生长（自学） 微生物生长的测定 微生物生长的规律 影响微生物生长的主要因素 有害微生物的控制,内容提要,第一节 微生物生长的测定,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）,1.显微镜直接计数法,2.平板菌落计数法,Pour plate,Pour plate,技术要求：样品充分混匀，操
2、作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作； 注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； 适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物， 误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,3.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml
3、培养物可得1090mg干重的细胞。,4.生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,第二节 微生物的生长规律,一、细菌群体生长规律,细菌生长曲线 细菌接种到均匀的液体培养基后，在不补充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养
4、时间里细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，这种曲线称为生长曲线(growth cuwe)。,其它名称：延滞期、停滞期、调整期、适应期 现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 特点： 生长速率常数= 0 细胞形态变大或增长 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物） 原因：适应新环境条件，合成新酶，积累必要中间产物,迟缓期（lag phase）,.对数期（log phase）,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级增加，其对数与时间
5、呈直线关系 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感,. 稳定期（stationary phase）,又称：恒定期或最高生长期 特点： 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。,原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素
6、等）；物化条件（pH、氧化还原势等）不合适等,. 衰亡期（decline phase）,特点： 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 产生原因： 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,同步生长：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 同步细胞群
7、体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,二、同步生长（synchronous growth）,同步培养技术（synchronous culture）：设法使群体中的所有细胞尽量都处于同样的细胞生长和分裂周期中。 同步培养法：能获得处于同一生长阶段的群体细胞的培养方法,获得同步生长的方法：,获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 机械法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,三、连续培养（continuous culture）,
8、连续培养（continuous culture）的概念 ： 在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础： 由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,第三节 环境对微生物生长
9、的影响,一、影响微生物生长环境因素,营养物质 水的活性 温度 pH 氧,营养学内容,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有影响。,1、温度对微生物生长的影响,从微生物整体来看:生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有
10、自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 超过最高生长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（1）微生物生长的三个温度基点,微生物类型,生长温度,最低 最适 最高,嗜冷微生物 兼性嗜冷微生物 嗜温微生物 嗜热微生物 超嗜热或嗜高温微生物,45 45 5565 80 65 8090 100,根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物划为五个类型,高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。 低温对微生物的影响 当环境温度低于微生物的最适生长
11、温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些则并不死亡。,（2）高温与低温对微生物的影响,造成死亡的原因： 冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。 冻结过程造成细胞脱水。 冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一
12、些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大，根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌: 好氧菌 微好氧菌： 兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌： 厌氧菌 (专性)厌氧菌：,2.氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸
13、产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧
14、化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,3、pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和
15、最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,不同微生物对pH要求不同,第四节 微生物生长繁殖的控制,几个基本概念,灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，实质上可分杀菌（bacteriocidation）和溶菌（bacterioly-sis）两种，前者指菌体
16、虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。,消毒（disinfection）是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。,防腐（antisepsis）是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。,化疗（chemotherapy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力（对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂,抗代谢物,抗生素,酸和碱：医院病房常用乙酸消毒。,重金属
17、极其盐类：升汞,有机化合物 ：醇、醛、酚是常用的杀菌剂。,氧化剂：高锰酸钾、双氧水等,卤素：氯，碘是常用的消毒剂,染色剂,表面活性剂,抗微生物剂(antimicrobial agent),杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质,抗代谢物(antimetabolite),有些化合物在结构上与生物体所必需的代谢物很相 似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功 能。干扰代谢的正常代谢。这些物质称为抗代谢物。,叶酸 磺胺类药物,嘌呤 6巯基嘌呤,氨基酸 5甲基色氨酸,吡哆醇 异烟肼,每种抗生素都有一定的杀菌范围，称为抗菌谱。,抗生素(antibiotic),是由微生物在代谢过程中产生（有的可人工合成
18、）具有一定浓度下抑制或杀死其他微生物的有机化合物。,抑制细胞壁的形成,干扰蛋白质合成,抑制核酸复制,影响细胞膜的功能,高温灭菌,辐射作用,过滤作用,高渗作用,超声波,二、控制微生物的物理因素,1.高温灭菌（消毒）法是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,高 压 蒸 汽 灭 菌 锅,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既
19、保持食品的营养风味，又进行了消毒 该法一般是将待消毒的液体食品置于62处理30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。 低温长时法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处理牛奶 高温瞬时法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处理牛奶 超高温巴斯德灭菌法(Ultrapasteurization):让液体食品停留在140左右3-4s，急剧冷却至75，经匀质化后冷却至20。,间歇灭菌法： 将待灭菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷却后搁置室温（28-37）下过夜，并重复以上过程三遍以上。 其蒸煮过程可杀死
20、微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。 适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。,紫外线灭菌 使用紫外灯照射，可以根据1W/M3来计算剂量，若以面积计算，一般30W的紫外灯可用于15M2的房间消毒，照射时间为2030分钟，有效照射距离为1米左右。 射线灭菌 Co60放射性元素可放出射线。 灭菌剂量：2050KGY,2.辐射,采用比细菌小的筛子或滤膜作各种过滤器，当空气或液体流经筛子或滤膜时，微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧，从而达到灭菌的目的。但不能除去
21、病毒 实验室中常用的滤器：滤膜过滤器、蔡氏过滤器、玻璃过滤器、磁土过滤器等 过滤介质：醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜以及石棉板、烧结陶瓷、烧结玻璃等。 滤器孔径：常用0.22 m 、0.45 m 。 应用：对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质除菌。,3.过滤除菌法,总 结,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,微生物的细胞数目检测法、微生物的生长量和生理指标测定法,细菌群体生长规律生长曲线：延滞期、指数期、稳定期和衰亡期,影响微生物生长的主要因素有pH、T、氧,控制微生物生长的措施包括：灭菌、消毒、防腐、化疗等,常用的灭菌方法：干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法；化学因素包括表面消毒剂、表面
22、杀菌剂和化学治疗剂。,复习题,名词解释 1 生长 2 繁殖 3 菌落形成单位（cfu） 4 同步生长 5 连续发酵 6 最适生长温度 7 专性好氧菌 8 兼性厌氧菌 9 厌氧菌 10耐氧菌 11 巴氏消毒法 12 间歇灭菌法 13 微好氧菌 14 抗生素 15 抗代谢药物 16 消毒与灭菌 17 抗菌谱,问答题 1试分析影响微生物生长的主要环境因素及它们影响微生物生长机理? 2细菌生长与高等动植物有哪些异同？ 3测定微生物生长有何意义，常用测定方法有哪些? 4控制微生物生长繁殖的主要方法及原理有哪些? 5细菌耐药性机理是哪些，如何避免抗药性的产生? 6试举例说明日常生活中的防腐、消毒和灭菌及其原理? 7菌肥是由相关的不同微生物组成的一个菌群并通过混合培养得到的一种产品。活菌数的多少是质量好坏的一个重要指标之一。但在质量检查中，有时数据相差很大。请分析产生这种现象的原因及如何克服? 8何为纯培养物的典型生长曲线，它可分为几期? 9什么叫连续培养，有何优点? 10目前一般认为氧对厌氧菌毒害的机制是什么? 11列表比较灭菌、消毒、防腐和化疗异同，各举若干实例?,