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1、第十二章 兽药残留的测定,方国臻,一. 兽药残留与危害,典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是，随着集约化养殖生产的开展，一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂，也属于兽药的范畴。 兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。 兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。,一. 兽药残留的种类与危害,兽药最高残留限量(MRLVD)是指某种兽药在食物中或食物表面产生的最高允许兽药残留量(单位gkg，以鲜重计)。 兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的。 另外，休药期(是指自停止给药到动物获准屠宰或
2、其动物性产品获准上市的间隔时间)过短，是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。,兽药在动物性食品中的残留,兽药的原形化合物及其代谢物在动物的细胞、组织、器官或可食性产品（如奶、蛋）中的蓄积、贮存，称为食品动物的兽药残留。 （狭义）化学物 (Chemicals)残留：除兽药外还包括通过食物链进入动物体内的农药（如杀虫剂、除草剂等）和环境污染物(如重金属、霉菌毒素等)。（广义）,在生产中大量使用抗菌药物、抗寄生虫药物及各种促生长制剂，这些药物都会以原形或以有活性的代谢产物形式随动物粪便、尿液或其他排泄物进入环境。 这些物质在环境土壤、微生物、水生生物、植物等蓄积或贮存。,兽药在生态环境中的残
3、留,兽药残留的产生,产生的途径 兽药和添加剂的使用 防治动物疫病 使用药物添加剂 环境污染物,不遵守休药期的规定 标签外用药: 剂量、剂型、给药途径、疗程、适应症、动物 非法使用违禁药物 克伦特罗、己烯雌酚等 污染 饲料加工、贮藏、运输,兽药残留产生的主要原因,兽药残留毒性,急性毒性作用 慢性毒性作用 特殊毒性作用 病原菌的耐药性 对胃肠道菌丛的影响,急性毒性 克伦特罗（瘦肉精）中毒 慢性毒性 氯霉素、氨基糖苷类、灰黄霉素等,雌激素类（己烯雌酚）、同化激素（苯丙酸诺龙） 喹恶啉类（卡巴氧） 硝基呋喃类（呋喃西林、呋喃他酮） 砷制剂 苯并咪唑类 杀虫剂（666） 氯羟吡啶、SM2等 甲醛、苯酚等
4、,特殊毒性（“三致作用”）,激素样作用 对内分泌功能的影响 对生育能力的影响 儿童性早熟 过敏反应 青霉素类、四环素类、磺胺类等,对人类肠道微生物的影响,破坏或抑制人体胃肠菌群中敏感菌的生长。 导致条件性病原菌的大量繁殖或体外病原菌侵入肠道。 改变肠道菌群的代谢活性，使菌群改变药物和食物固有活性和毒性的的生物转化能力发生变化。 引起细菌耐药性的产生，导致人类感染性疾病治疗的失败。,二.常见兽药残留的种类,1抗生素类药物 这类药物多为天然发酵产物，是临床应用最多的一类抗菌药物，如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应，四环素类、
5、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等，极度超敏反应可能导致过敏性休克甚至死亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食品，可损害听力及肾脏功能。,2磺胺类药物,主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺眯、菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后，药物可不断在体内蓄积。,磺胺类药物的毒性作用,损害泌尿系统 磺胺类药主要经肾脏排出，在尿中浓度较高，其溶解度又较低，尤其当尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀胱内析出结晶，
6、产生刺激和阻塞，造成泌尿系统损伤，引起结晶尿、血尿、管型尿。 引起过敏反应 抑制造血系统 导致细菌产生抗药性,磺胺类药物结构,磺胺类药物的基本结构为对氨苯磺酰胺，简称磺胺的衍生物， 具有芳氨基和磺酰胺基，多为两性化合物 。 常用的磺胺类药物的化学结构式：,磺胺类药物的分子结构,磺胺类药物在兽医临床上的应用 磺胺药对大多数革兰氏阳性和阴性细菌都有抑制作用，在食源性动物的饲养中，磺胺类药物不仅作为兽药被广泛用于兽医临床对细菌感染性疾病的防治，有时也被用作饲料添加剂。 磺胺药的药代动力学 磺胺药主要在肝脏中代谢，常见的方式是在对位氨基处发生乙酰化，其次是羟基化作用。有的磺胺药其乙酰代谢物的水溶性低，
7、易在肾小管内析出结晶，而有些代谢物虽水溶性较高，但在酸性尿中也容易结晶析出，容易引起结晶尿和肾并发症。,磺胺类药物对食品的污染,使用过磺胺类药物的动物，如果不遵守适当的休药期，其肌肉组织、蛋和奶中就会被残留的磺胺类药物污染；短期大剂量或长期小剂量给药，很容易造成磺胺类药物在动物各组织中蓄积； 当饲料或饮水被磺胺类药物污染后，也可导致动物性食品中磺胺类药物残留量严重超标； 很多研究表明猪肉及其制品中磺胺药物超标现象时有发生，特别是致癌性的磺胺二甲基嘧啶残留给人类的健康带来了威胁。,食品中磺胺类药物的最高残留限量,英、美等国家对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100 gkg-1； 欧盟第
8、675/92号令中规定了，在肉类及牛奶中磺胺的最大残留总量不得超过100 gkg-1； 日本要求的最高残留限量更严格，单个磺胺残留限量为20 gkg-1 ，最大残留总量不得超过100 gkg-1； 我国对磺胺类药物在肉类及乳品中的允许残留量限制为100 gkg-1。,提取和净化方法,磺胺类药物不易溶于非极性溶剂，而在极性较大的溶剂中溶解性较好，一般常用乙睛、氯仿、二氯甲烷、丙酮、或乙酸乙酯提取。 净化方法主要有柱色谱，TLC，液液萃取（LLE），固相萃取（SPE）和基质固相分散萃取（MSPD）等。,磺胺类药物的HPLC法色谱条件,常采用反相硅胶柱对待测物进行分离，主要有C18，C8或者C4柱，
9、有时也采用离子对色谱柱。 流动相主要由乙睛-水，甲醇-水或者乙睛-甲醇-水按不同比例组成，也有文献报道采用乙醇-水系统。在以上流动相系统中加入适量乙酸或者十二烷基磺酸钠（SDS）常用于提高分离效率。,磺胺类药物的HPLC法色谱条件,3硝基呋喃类药物 主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋喃类残留后，对人体造成的危害主要是胃肠反应和超敏反应。剂量过大或肾功能不全者，可引起严重毒性反应，主要表现为周围神经炎、嗜酸性白细胞增多、溶血性贫血等。长期摄人可引起不可逆性末端神经损害，如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等，我国尚未制定硝基呋喃类药物残留检测标准。,4抗寄生虫类药物
10、 这类药物主要用于驱虫或杀虫，如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。 食用残留有苯并咪唑类药物的动物性食品，对人主要的潜在危害是致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形，如短肢、兔唇等；对所有消费者来说，可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色体畸变，从而其后代有发生畸形的危险。,5激素类药物 这类药物主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度，使用于动物的激素有性激素和皮质激素，而以性激素最常用，如孕酮、睾酮、雌二醇等。正常情况下，动物性食品中天然存在的性激素含量是很低的，因而不会干扰消
11、费者的激素代谢和生理机能。 但摄人性激素残留超标的动物性食品，可能会影响消费者的正常生理机能，并具有一定的致癌性，可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。,三. 兽药残留分析技术概述,兽药残留分析技术的特点 待测物质浓度低 样品基质复杂，干扰物质多 兽药残留代谢产物多样或不明 动物种类多样，对药物代谢存在差异,对检测方法的要求 快速 高通量(high throughput) 定量 准确度和精确度(accuracy & precision) 确证(unequinocal identification) 法定的和QC,理想的仪器装备 样品经简单处理即可上机测定 不需萃取和净化 快速、准确的
12、定量分析 自动的资料处理,分析方法的总体思路 高水平(Level )方法确证和定量被分析物质 中等水平(Level )方法定量但不需要确证被分析物质 低水平(Level )方法筛选,四. 兽药残留分析与监测,残留分析的样品 样品的前处理 残留检测方法,残留分析的样品,可食性组织及产品 肝、肾、肌肉、脂肪、皮肤、血液 奶、蛋 其他加工食品 其他 毛发、尿、粪便等,取样方法 代表性原则、随机采样 各种标准规定 活体检测 一般采集毛发、血液、尿液和粪便 屠宰场取样 药物的靶组织 其他高浓度的样本：肝、肾、胆汁、注射部位 排泄物：尿液,样本的收集,样本的贮存 容器材料 一般为玻璃或塑料 硅烷化处理防止
13、器皿壁对痕量残留组分的吸附 塑料吸附脂溶性物质 玻璃表面吸附碱性物质 预处理 匀化、缩分、过筛、离心、过滤、防腐、抑制降解等 贮存温度要求,食品中磺胺类兽药残留的液相色谱测定,样品的处理 1. 称取5.0 g 匀浆样品和10 g 经煅烧的无水硫酸钠，于50 mL 二氯甲烷，均质提取1min， 3000r/min 离心2 min, 上清液经快速滤纸过滤到200 mL 浓缩瓶中， 用25 mL 二氯甲烷重复提取一次，合并二氯甲烷，35 水浴氮气吹干。上述残渣用1.0 mL 1% （v/v） 乙酸-甲醇（65+35）溶解，漩涡混匀，转移至5 mL的离心管中，加3 mL正己烷，漩涡混匀， 静置分层，弃
14、上层正己烷层，再加入3 mL 正己烷，涡漩混匀，3000r/min 离心2 min, 下层用0.45 m 有机滤膜过滤，供液相色谱测定。基质干扰大的样品，需要固相萃取柱如下的净化步骤。,2.下层加5%（v/v）乙酸溶液稀释至3 mL，稀释液注入预先分别用3 mL 甲醇和3 mL 5%乙酸溶液处理的Oasis HLB型固相萃取柱， 用2 mL 5% 乙酸甲醇（50+50）淋洗，最后用10 mL 5% 氨甲醇溶液洗脱，洗脱液40 减压旋转蒸发至干，残渣用1 mL甲醇定容，供液相色谱测定。,色谱条件,色谱柱：ODS-C18(4.6 mm250 mm)柱； 检测器：紫外检测器； 波长：270 nm； 进样量：20 L； 柱温：35； 流动相：甲醇：水（pH 3.25）= 22:78； 流速：1.0ml min-1,校准曲线的绘制,准确称取各磺胺类兽药对照品于容量瓶中，以甲醇定容作为标准储备液，吸取各标准贮备液，以甲醇稀释至质量浓度为0-2.0 mg/L 的标准系列，各取20 L进样分析，据峰面积与相应的质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。,