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1、第十章 遗传工程,第一节 遗传工程概念 第二节 动物细胞工程 第三节 基因工程,第一节 遗传工程的概念,遗传工程(Genetic engineering):一般认为,遗传工程是按照人们预先设计的蓝图,将一种生物的遗传物质绕过有性周期导入另一种生物中去,使其获得新的遗传性状,形成新的生物类型的遗传操作。 遗传工程有狭义和广义之分，广义的遗传工程包括细胞工程和基因工程；狭义的遗传工程就是基因工程。,第二节 动物细胞工程,细胞工程：是利用细胞生物学和分子生物学的方法，在细胞水平上进行的遗传操作。分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程。 一、细胞融合 二、动物克隆技术,一、细胞融合,1、细胞融
2、合：也称体细胞杂交，是一种在同种或不同物种体细胞间，在融合剂存在的条件下，自然的或人工的细胞水平的杂交过程，获得的杂种细胞具有双亲的遗传属性。 2、细胞融合过程：两个细胞紧密接触细胞膜合并细胞间出现通道或细胞桥细胞桥数增加扩大通道面积两细胞融合为一体。,二、动物克隆技术,1997年英国科学家Wilmut克隆羊的成功标志动物克隆技术新的里程碑。 克隆的基本概念：克隆意指无性繁殖（系），可分为三个层次：基因、细胞、个体 个体克隆可分为植物克隆和动物克隆。,植物体几乎所有的体细胞都能在体外培养成新的完整植株，单个性细胞（如花粉和未受精的子房培养）也能未经两性结合而发育成新植株。 动物克隆技术的发展经
3、历从胚胎细胞的克隆到体细胞克隆的过程。胚胎细胞克隆是指将胚胎细胞核移植到去核的卵母细胞中，由于胚胎细胞的全能性，它比较容易经培养和移植获得基因相同的个体。由于该技术产生的新个体并非是亲代的自我复制，而是等同于多生了几个双胞胎，并未引起世人注意。体细胞克隆可达到亲代个体的自我复制。,核移植技术 动物克隆技术并不是象植物那样从体细胞直接发育成新的个体，而是要将供体复制对象的细胞核转入到去掉细胞核的卵细胞中才能实现。由于体细胞包含有全部的遗传信息，从体细胞获得完整的动物个体是完全可行的。动物体细胞是高度分化的细胞，克隆羊“多莉”的诞生说明动物体细胞也具有全能性，因此它是真正意义上的动物克隆。,动物克
4、隆的基本过程,以克隆羊为例，动物克隆的基本过程如下图,1动物资源的种质保存包括地球上频危动物的挽救等。 2生产移植器官，培育优良品种，与转基因技术相结合研制生物反应器生产基因药物。 3克隆人。是全世界注目的焦点，有人设计了克隆人的技术路线, 动物克隆的应用：, 动物克隆的危险性： 1克隆动物已出现广泛的免疫缺陷或早期夭亡。 2克隆动物过程中也极有可能产生遗传性的变异（无性系变异），这在植物的克隆中已广泛得到研究和验证，会发生染色体变异，基因组DNA扩增和某些转位因子的激活。 3克隆人不但面临社会、家庭伦理道德问题，也将面临健康安全问题。,第三节 基因工程,利用转基因手段对生物进行人为改造的技术
5、 一、目的基因的获得 二、工具酶和载体 三、转基因技术的应用,一、目的基因的获得,（一）目的基因的获得 1、从基因文库分离基因 基因（组）文库：某一生物的全部DNA序列的不同DNA片段所构成的群体，即克隆某种生物全部基因（99%）的总和。包含外显子和内含子。 cDNA文库：由某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞内总mRNA逆转录成互补cDNA分子，其所构建的重组DNA克隆群体，即具有表达功能外显子序列的总和。 2、化学合成基因,3、PCR法,PCR（polymerase chain reaction,聚合酶链反应)：体外有引物介导的特定DNA序列的酶扩增。 PCR技术的原理：利用DNA本身的特
6、性，变性与复性,以达到扩增DNA分子的目的。 PCR反应条件（反应体系组成）：模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、缓冲液、灭菌水、石蜡油。,PCR原理,PCR原理,二、工具酶、载体和宿主,工具酶,A. 剪切酶类 有目的有选择的把目的片段切开 B. 连接酶类 将目的片段和载体相连 C. 其他工具酶 修饰, 加工等作用,限制性内切酶II及其产生的3种不同末端,5突出的粘性末端,3突出的粘性末端,平末端,EcoR I,EcoR V,Pst I,P,P,P,P,P,P,同切酶和同粘酶,同切酶: 识别相同的位点, 但生成不同的末端. 同粘酶: 识别不同的位点, 但产生相同的粘性末端,Sma I
7、5 . C C CG G G . 3 3 . G G GC C C . 5,Xma I 5 . C C CG G G . 3 3 . G G GC C C . 5,同切酶,BamH I 5 . GG A T C C . 3 3 . C C T A GG . 5,Bgl II 5 . AG A T C T . 3 3 . T C T A GA . 5,同粘酶,Sau3A 5 . G A T C . 3 3 . C T A G . 5,连接酶及其对底物的要求: T4 Ligase, Ecoli Ligase,底物: 自由5末端和自由3末端, 5末端带磷酸基团 反应条件：Mg+，ATP存在,聚合酶(
8、polymerase): DNA聚合酶I, klenow片段, Taq, Pfu, 末端转移酶 外切核酸酶(exonuclease): exo III, S1核酸酶, DNase I 脱磷酸酶(dephosphatase): 碱性磷酸酯酶CIP 磷酸化酶,激酶(kinase) 逆转录酶(reverse transcriptase) RNase H, RNase A 甲基化酶(methylase),其它工具酶,载体及其构成基本要素,能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒, 端粒 方便插入外源片段: 单酶切位点 选择标记: 药物抗性 报告基因: 插入筛选标记 易分离提取
9、 高产率（多拷贝） 强启动子 多宿主,常用载体,质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid), 病毒，PAC，YAC，BAC,特殊用途的载体,表达型载体， 分泌型载体，穿梭载体,宿主,繁殖快, 易于培养, 能够快速得到产物 对所携带基因的表达产物具有较高耐受性, 具有克隆最多种基因的可能 突变率低, 能够稳定忠实的保存被克隆基因,常用宿主,大肠杆菌: 繁殖快, 易培养, 易分离产物 噬菌体: 转化效率高, 易于保存 酵母: 繁殖最快的真核生物, 适于有蛋白质加工 的基因表达,lacZ,三、转基因技术的应用,利用基因工程技术不但能得到大量的具有特殊功能的基因。而
10、且可以让这些特殊功能的基因生产出具有特殊功能的蛋白质药物，这是目前基因工程 领域中最活跃最有成果和极富商业价值的领域之一，究其原因： （1）蛋白质和多肽是基因表达的直接产物，可用重组DNA技术进行研究和生产。 （2）具有生物活性的蛋白和多肽是珍稀而具有很高医疗价值的药物，用常规分离的方法很难制取。,一、利用微生物基因工程生产重组基因工程药物,目前有几十种基因工程药物，常用的有：干扰素、白细胞介素、乙肝疫苗、人胰岛素和人生长激素等。 人类最早的商业化基因工程药物是人胰岛素和人生长激素，于80年代初投放市场，用大肠杆菌来生产，是基因工程 发展的里程碑。,胰岛素是治疗糖尿病的重要药物，之前从猪或牛的
11、胰腺中提取分离，含量少而且会有毒素。 人生长激素是治疗侏儒症，青少年增高和促进创伤组织修复的药物，生长激素具有种属特异性，从动物脑组织来源的生长激素不能用于人类，之前只能从刚死亡的人大脑垂体中分离纯化，来源极有限；而且发现长期应用会对人类有毒副作用。,该方法用于合成人胰岛素,19-15,二、用真核细胞表达和生产基因工程药物,虽然用大肠杆菌细胞表达基因工程药具有许多优点，如成本低等，但由于原核系统表达的真核基因蛋白有时缺乏生物活性，其原因由于原核生物缺乏合适的转译后修饰机制。因此用真核细胞表达和生产基因工程药物已受到重视。 真核细胞反应器： 外源基因在合适的载体带动下转染进入体外培养的哺乳动物细胞，昆虫细胞或酵母细胞，通过大规模培养细胞表达外源基因。,几种重要的基因工程药物已可用真核细胞反应器完成,四、转基因生物反应器,定义：将目的基因导入动物体内形成转基因生物，由于基因表达，可以从转基因动物的特定组织或器官（乳汁、血液等）获得目的基因产物。使转基因动物象一个活的发酵罐一样来生产目的基因的产物。 步骤（图）：采用上述方法获得的转基因羊，可从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA（组织溶解酶原激活剂）。,