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1、“绿色荧光蛋白”让未知世界显影,Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien （钱永健） 2008年10月8日，美Woods Hole海洋生物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁-沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色荧光蛋白而获得2008年诺贝尔化学奖。,GFP发现之旅； 1962年，下村修首次从维多利亚多管水母Aequorea victoria 中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。 1992年，道格拉斯普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白的基因。 1993年， Martin Chalf
2、ie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。 1994年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出黄色、蓝色、绿色、红色等多种颜色的荧光蛋白，理解了GFP发出荧光的机制。世界上目前使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种。令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。钱永健还开发了检测荧光蛋白的荧光探针技术。,维多利亚多管水母（Aequorea victoria）,GFP简介,维多利亚多管水母生活在北太平洋寒冷水域。这种水母体内含有一种生物发光蛋白质aequorin，它本身发蓝光。GFP能把这种光转变成绿色，也就是当水母
3、容光焕发的时候我们实际看到的颜色。GFP的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光形式发射出来。,GFP结构,蛋白序列 SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHY
4、LSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGI GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约为26.9kDa。,GFP结构,GFP结构,GFP结构,GFP结构,GFP结构,GFP晶体结构显示 , 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构 , 长 420 nm , 宽 240 nm , 由 11个片层组成桶状构成疏水中心和由4个螺旋以及其中一个螺旋包含着的发光基团构成。,GFP结构,GFP结构,桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖 , 底部由一个短的垂直片段覆盖 , 对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭。实验表明 GFP 荧光产生的前提是桶状结
5、构完整性 , 去除 N 端 6 个氨基酸或 C 端 9 个氨基酸 ,GFP 均会失去荧光。这是由于生色团形成的效率较低 , 而且形成过程受外界环境影响较大的缘故,GFP结构,GFP结构,GFP独特的结构,由238个氨基酸组成 “像一个罐头” 每个单体由11个反向平行的-sheets围绕，4个-helix组成，其中一个-helix位于“罐头”内 大约长 420 nm , 宽 240 nm 荧光基团位于核心的-helix,GFP结构,由螺旋含有发光基团由第 65 、 66 、 67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团构成。翻译出的蛋白质折叠环化之后 , 在 O 2 存在下 , 分子内第 67 位甘
6、氨酸的酰胺对第 65 位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第 5 位碳原子咪唑基 , 第 66 位酪氨酸的2键脱氢反应之后 , 导致芳香团与咪唑基结合。这样 , GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团 , 该过程可以自动催化完成。,1. 两个野生型 GFP吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在 395 nm 出现一个最大吸收峰 , 在 470 nm 出现一个小的吸收。 出现两个吸收峰的原因可能是由于存在阴性和中性两个不同化学结构的生色团。由于存在两个吸收峰, 野生型 GFP 可以被标准的长波紫外 源和异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激发。,GFP
7、性质,2. 能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著的特点是除了氧气之外，不需要其他辅酶，不需底物。 3. Baird等研究人员发现，虽然GFP有紧密的桶状结构和形成发光基团所必需的复杂的翻译后修饰，当对GFP的N端和C端部分交换重排并以一段间隔重新连接时，GFP仍然具有荧光。并且，GFP的某些位点可以耐受整段蛋白的插入，在结合金属离子的黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein, YFP，GFP的突变体）中145位插入锌指结构能使荧光强度多倍提高。,4. GFP作为报告分子具有很多优点，如实现了活细胞内基因表达和定位、荧光为蛋白的内在属性、荧光发射无种属依赖
8、性、荧光信号对光漂白具有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表达无明显毒性、具有高度稳定性。另外，细胞内GFP的检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量PCR进行GFP荧光定量测定的方法。,GFP应用,1. 在蛋白质相互作用和构型变化研究中的应用 一种活细胞内蛋白质相互作用的研究方法是蛋白质片断互补测定法（protein-fragment complementation assay, PCA）。将标记蛋白在某个位点打开，用片断分别标记两个蛋白。如果被标记蛋白质相互作用，则酶或荧光蛋白片断靠近并重新折叠恢复活性。 Hu等提出了双分子荧光
9、互补实验（BiFC）的概念，用互补的荧光片断标记不同蛋白来研究bZIP和Rel转录因子家族的相互作用，确定了相互作用位置，信号传递对作用位点的调节等。,荧光互补不仅仅在蛋白质相互作用中有所应用，Jeong等研究人员以与底物结合时会有典型的构象变化麦芽糖结合蛋白（MBP）为模型，将MBP C端和N端分别与GFP片断融合。结果证明加入底物的一组显示出比对照组更强的荧光，由此提出split-GFP在观察蛋白构型变化中的应用。 另外，一种重要的荧光成像技术荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）也被广泛应用。它能够利用GFP及其突变体
10、青色荧光蛋白（CFP）、黄色荧光蛋白（YFP）等，定时、定量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象变化、蛋白之间相互作用、信号传递途径。,2. GFP 在信号转导中的应用 研究发现 , 某些突变的 GFP 能够发生荧光共振能量转移 （ FRET ），FRET 对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感 ( 在纳米范围内 ) 。两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。通过计算供应分子对于接受分子荧光释放的比率来观测细胞动态变化的指标。它消除了 GFP 分子在绝对浓度、细胞的厚度、激发源的能量度以及检测的绝对效率等的影响。利用 FRET 可以作成 GFP 依赖的生物
11、探针 , 现已有研究人员设计大分子或分子配对物来改变 GFP 之间原有生理信号反应的 FRET 。,在上述实验基础上 , 研究人员设计了FRET 依赖的 Ca 2+ 敏感指示剂 , 该实验发现 , 通过改变两个 GFP 之间的距离 , 可增加 FRET。另有一些研究人员 , 并没有把两个 GFP 融合在一个单一结构中 , 而是把一个 GFP 融合到 CaM 上 , 另一个 GFP 融合到 CaM 结合区域。结果发现 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 出现分子间异源二聚体 , 两个 GFP 足够接近而产生 FRET 。这个实验提示了 FRET 不仅可以在分子内发生 , 而且还可在分子间
12、发生。,最近 , 有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学 , 通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞 , 观测有关 cAMP 的动态荧光变化 。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位 , 设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时 , 两个荧光分子距离很近 , 并出现 FRET , 如果增加 cAMP 浓度 , 发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法 , 可以检测出 cAMP 的动态变化 , 并开创了在整体条件下 , 研究 cAMP 调节信号转导途径的新方法。,GFP 的结构虽然具有高度完整性 , 但
13、是实验中发现 , 在 GFP 中某些确定的位置 , 插入外源基因 , 完全没有丧失其荧光性。当把 CaM 插入黄色荧光 GFP 突变体中 , 得到 Ca 2+ 传感器 , 当 Ca 2+ 结合到 CaM 上 , 导致生色团去质子化 , 使荧光强度增加 7 倍。当在黄色荧光 GFP 中插入一个 Zif268 锌指结构 , 可以得到传导 Zn 2+ 的 GFP , 结果发现荧光少量增加 , 为改变前的 1.7 倍 , K d 值约 0. 4mmol。插入外源基因致使 GFP 荧光敏感性增强的现象 , 提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导的新路径。,改进 GFP 的应用前景,蓝色荧光蛋白、
14、青色荧光蛋白，绿色荧光蛋白，黄色荧光蛋白， 褐色。,1. 提高了GFP的光谱性质， 2. 提高荧光强度 3. 提高光稳定性 4. 颜色突变 5. pH敏感的突变体,到目前为止 , 改进荧光蛋白已有非常广泛的应用 , 如转染细胞的确定 , 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析、核酸碱基探针分析 , 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示 , 细胞间隙 pH 变化的检测 。另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作为基因治疗检测指标。但GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 : (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 。
15、 (2) 多数生物具有微弱的自发荧光现象 , 并有着类似的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 。 (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 , 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关。,具体研究领域,1、骨架和细胞分裂 2、细胞器动力学和泡囊运输 3、发育生物学 4、神经生物学 5、其他应用 6、GFP 载体和技术 7、其它有用的 GFP 链接,应用GFP研究成果,美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”的猫,杰夫利希曼利用荧光蛋白展现了大脑内的连接，图片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络,1997年在大阪大学降生的第一种发光哺乳动物小老鼠,两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室,约克镇科技公司生产的荧光鱼引入市场，荧光蛋白便迅速在商业上得到应用,利用GFP来发明生理传感器：一种感应离子或酸碱度水平，然后通过发出特征性的荧光来报告结果的分子机器。这里所展示的分子是一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白，当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。,用不同的“荧光蛋白”让未知世界显影,