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1、酶的分子修饰,Enzyme modification,1.1.酶分子修饰的概念 通过主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的“化学修饰”,以改变其结构、性质及生物活性等.这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术,1.酶的分子修饰概述,或在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。,酶分子修饰的概念,生物体中存在的酶分子修饰,酶原激活 共价修饰,Proteolytic Zymogen Activation.,酶原激活,酶分子中的某些基团在其他酶的催化下，可共价结合或脱去，引起酶分子构象改变而调节其活性，此类酶称为共价修饰
2、调节酶。,共价修饰,酶的共价修饰方式,磷酸化/去磷酸化； 乙酰化/去乙酰化； 腺苷酰化/去腺苷酰化； 尿苷酰化/去尿苷酰化； 甲基化/去甲基化； 氧化(SS)/还原(2SH)。,磷酸化/去磷酸化是是高等动植物酶化学修饰的主要形式 细菌主要是核苷酰化形式。,1.2. 酶分子修饰的目的,基础酶学的研究和疾病治疗 医疗用酶的要求,稳定性高 纯度高 无免疫原性,基础酶学研究上,(1)探测酶活性必需氨基酸的性质和数目。 (2)探测酶蛋白的结构变化与运动。 (3)测定酶蛋白部分区域的构象状态。 (4)探索酶的作用机理和催化反应历程。 (5)探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态。 (6)研究酶的固定化技
3、术。,人为地改变天然酶的一些性质,创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性,来扩大酶的应用领域。, 提高酶活性 ; 增强在不良环境(非生理条件)中的稳定性; 针对异体反应,降低生物识别能力,降低免疫原性. Low solubility Poor stability Oral delivery of proteins impossible because they are destroyed by the digestive system Injected proteins are quickly removed by renal excretion,酶应用研究上的目的,2. 酶分子的
4、修饰方法,2.1. 酶辅因子的置换修饰 2.2. 大分子结合修饰 2.3. 小分子修饰 2.4. 分子内交联 2.5. 分子间交联 2.6. 氨基酸的置换修饰 2.7. 肽链的有限水解 2.8. 物理修饰,2.1.酶辅因子的置换修饰,通过改变酶分子中的辅因子，使酶的特性和功能发生改变，主要是金属离子的置换，因此该方法又称为离子置换法。 主要是二价离子的置换修饰,置换修饰过程,酶液中加入EDTA,透析或超滤,加入金属离子,置换修饰酶,等价同荷置换,置换修饰的要点,举例,蛋白酶（Zn2）,蛋白酶（Ca2），活力提高, -淀粉酶 （杂离子型）,Ca2型，活力增加，稳定性增加,2.2.大分子结合修饰,
5、大分子的非共价修饰 大分子的共价修饰,大分子的非共价修饰,非蛋白质修饰物 多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺 如聚乙二醇、右旋糖苷等,能与酶非共价地相互作用而有效地保护酶，既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通氢键有效地与外部水相连，通过调节酶的微环境，保护酶的活力。 有些来自嗜热菌的酶具有较高稳定性，其原因正是由于保护性大分子(如肽和聚胺)发挥作用的结果。,酶的多聚体或酶聚合体的活力和稳定性比单体高就是这个原因。 用抗体来稳定酶。有些抗体能在蛋白质开始伸展的部位或被蛋白酶水解的部位起作用，因而起到稳定作用。,蛋白质类修饰物, -淀粉酶与其抗体的复合物在70半衰期为16h，而天然酶仅为5min。 抗
6、体保护的酶还有抗氧化酶、抗有机溶剂、抗低pH、抗自溶、抗蛋白酶等作用。 Taqase,举例,ANNEALING 37C - 65C,EXTENSION 72C,25-35 CYCLES,DENATURATION 93C - 95C,DENATURATION 93C - 95C,优点： 抗体制备简单 任何一种酶都有它相对应的抗体，制备亦较简单、迅速。所以，用抗体稳定酶的方法较普遍。,缺点： 制备抗体花费较多，解决的办法是用微生物来生产。最近报告表明，已经成功地由大肠杆菌生产具有完整功能的重组抗体片段，而且用同一种微生物既能生产目的蛋白又生产其抗体的可能性。 在医学上要解决酶抗体复合物在体内的抗原
7、性。目前采用降低抗体分子的大小制造嵌合抗体,大分子的共价修饰,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层,聚乙二醇修饰超氧物歧化酶(SOD)，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期，从而提高了酶药效。 日本学者将聚乙二醇连到脂肪酶、胰凝乳蛋白酶上所得产物溶于有机溶剂，在有机溶剂存在下能够有效地起作用。 嗜热菌蛋白酶在水介质中通常催化肽链断裂，但用聚乙二醇共价修饰后，其催化活性显著改变，在有机溶剂中催化肽键合成，已用于制造合成甜味剂。,PEG: HO-CH2-CH2-(OCH2CH2)nCH2CH2-OH,P
8、EG binds 2-3 water molecules per repeat unit PEG/water shield can reduce activity of protein, but generally the increased circulation time makes up for this,PEGylated microspheres:,Li et al. showed significant increases in circulation time by preparing controlled release microparticles using PEG-PLG
9、A block copolymers, Block copolymer self-emulsifies and PEG coats both internal and external aqueous interfaces Benefit of improved protein stability within microspheres?,Block copolymer localizes at aqueous/polymer interfaces, Unmodified PLGA particles t1/2 = 13.6 min. PEG block copolymer particles
10、 t1/2 = 270 min (4.5 hr) Altered biodistribution: high blood availability and reduced spleen/liver uptake No PLGA particles remaining in blood after 12 hrs,Harris, J. M. & Chess, R. B. Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov 2, 214-21 (2003).,重组白介素（rIL-2）用大分子PEG修饰后，半衰期延长10倍,腺苷脱氨
11、酶（ADA） 用于治疗联合免疫缺陷 PEG修饰的ADA在体内的半衰期从数分钟延长到24小 时，免疫原性降低 1990年美国食品和药品管理局（FDA）批准用于联合免疫缺陷的治疗,天冬酰胺酶（ASP） 用于白血病的治疗 PEG修饰后半衰期从24小时增加到357小时 FDA1994年批准用于急性淋巴细胞性白血病治疗,IFN- 2a PEG修饰后疗效增加 FDA已批准正式生产，如Roche公司的PEGASYSTM Peg-Interferon-2a Pegasys (Roche) Hepatitis C (2000) IFN- 2b PEG修饰后半衰期延长5倍 Schering-Plough公司的Pe
12、g-Intron Peg-Interferon-2b PEG-Intron A (Schering) Hepatitis C (2001),Protein-Polymer Bioconjugates,Interferon-a-2a (IFN-a-2a),Conjugated IFN-a-2a Commercially available,Activated PEG,Disadvantages of IFN treatment,Side effects common Expensive Effective in only minority of chronic HBV infection pat
13、ients,Pegylated IFNa,Pegylation = the addition of an inert polyethylene glycol (PEG) to a protein molecule increasing its molecular weight without affecting its therapeutic activity,2 main effects of pegylation of IFNa longer lasting therapeutic effect reducing immunogenicity potential,Peg interfero
14、n alfa-2a,Peg-IFN -2a blood levels do not fluctuate,粒细胞集落刺激因子（G-CSF） 用于治疗中性粒细胞减少症 美国Amgen公司研制的PEG修饰长效G-CSF，是在重组人G-CSF的N端Met残基上共价结合了20kD的PEG，于2002年1月获FDA批准,天然SOD与修饰SOD在血浆中的半衰期,Characterization of the PEGylated proteins. (A) SDS PAGE characterization of PEGylated human PAH,MOLECULAR THERAPY Vol. 9, No
15、. 1, January 2004，124129,Lysozyme Poly(PEGMA)NHS Conjugation,Lysozyme (reference),Bioconjugate 5-7 polymeric chains attached,Protein Markers,15% Crosslinked Gel,SDS - PAGE,Lysozyme Poly(PEGMA)NHS Conjugation,Column: BioSep SEC-S3000 Flow rate: 0.5 mL / min Mobile Phase : 0.1% TFA (v/v) solution in H
16、20 / MeCN (69/31) UV detection 215 nm,2.3.小分子修饰,主要用于侧链基团的修饰,羧基的修饰 碳二亚胺,三硝基苯磺酸（TNBS） 与Lys反应在420nm和367nm能产生特定的光吸收 磷酸吡哆醛（PLP） Lys的专一性修饰剂，325nm有最大吸收，可用于定量,氨基的修饰 主要对 Lys的 氨基,chemical crosslinking of side chains,Activated Polymers,Arg胍基的修饰 丁二酮 、 1,2-环己二酮 、苯乙二醛等具有两个临位羰基的试剂,巯基的修饰 主要是烷基化试剂和还原剂 碘乙酸 马来酰亚胺 对氯汞苯
17、甲酸 DTT 巯基乙醇,His咪唑的修饰 焦碳酸二乙酯,Trp吲哚基的修饰 Trp一般位于分子内部，反应性差 N-溴代琥珀酰亚胺 4-硝基苯硫氯,2.4.分子内交联,胰凝乳蛋白酶上羧基经碳二亚胺活化后，可与一系列二胺作用。结果发现，用1,4二氨基丁烷交联该酶，可得到稳定性有所改善的酶制剂,酶分子内部两个侧链基团反应，增加酶分子表面交联键的数目是稳定酶的方法之一。,Clain 和Navia首次证实了利用交联酶晶体(Crosslinked enzyme crystal,CLEC)技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性,增加了其热稳定性。,The preparation of CLCs of the se
18、misynthetic peroxidase seleno-subtilisin. (a) Batch crystallisation in 12% (w/v) Na2SO4 at 1618C was followed by treatment (45 min) with glutardialdehyde at pH 7.5. (b) 1 h in 0.11 M phenylmethanesulfonyl fluoride at pH 7.0. (c) Addition of aqueous sodium hydrogen selenide solution was followed by 4
19、5 h stirring at 45C. (d) 30 min in 10 mM H2O2. Enz, enzyme; Enz-OH, Ser221 of subtilisin; Enz-NH2, lysine residues on the surface of the enzyme; Ph, phenyl.,Current Opinion in Chemical Biology 1999, 3:3538,枯草杆菌蛋白酶经预处理,冻干形成交联酶晶体,在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加,活力可提高13倍 利用葡聚糖二乙醛将青霉素酰化酶进行交联,使其在55下的半衰期提高9倍,而保持不变,2.5
20、.分子间交联,用双功能或多功能试剂使不同的酶交联起来产生杂化酶。 例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。 这种杂化酶的优点是，胰凝乳蛋白酶的自溶作用降低。,2.6.氨基酸的置换修饰,化学方法 难度大，很少有使用,基因工程的方法,随机突变技术（Methods of random mutagenesis）,1. chemical synthesis,2. error-prone PCR,3. DNA shuffling,Mutagenesis:Why Mutate?,Native proteins are not well suited for industrial applicatio
21、n Native proteins are not optimized for medicinal purposes,Increase the efficiency of enzyme-catalyzed reactions Eliminate the need for cofactor in enzymatic reaction Change substrate binding site to increase specificity Change the thermal tolerance Change the pH stability Increase proteins resistan
22、ce to proteases (purification) Signal sequences secretion rare codon changes,工程二硫键 增加蛋白质内部疏水性 酶表面亲水化 抗氧化失活 Asn脱酰胺失活,定点突变技术（site-directed mutagenesis),1990年Goodson将干扰素的Thr3替换为Cys3，并通过PEG修饰，水溶性增加，半衰期延长(工程二硫键 ) 噬菌体T4溶菌酶Ile3突变为Cys3，使与Cys97形成二硫键，催化活性不变，但热稳定性显著提高(工程二硫键) xylanase(工程二硫键) used to treat wood
23、pulp in paper production needs to function at high temp Glu49位于色氨酸合成酶的疏水核心部分。如Ala取代，稳定性增加(增加蛋白质内部疏水性),Three-Dimensional Structure of T4 Lysozyme,How many residues can be systematically changed and retain the same fold? or what fraction of the sequence is necessary for folding?,To assess how many res
24、idues are necessary or essential for maintaining the same fold, single and multiple alanines were inserted into three helices in T4 lysozyme. 39-50; 115-123; and 126-134. This type of approach is opposite to designing a protein from first principles. What are the observations and conclusions?,Locati
25、on of new disulfide bonds in T4 lysozyme,Introduction of disulfide bonds must be formed in the context of a structure. Only a limited number of locations in a protein can accept two cysteine residues in an orientation that can accept the S-S bond without generating conformational strain (software no
26、w exists which can help in this choice). In principle, the larger the loop the greater the reduction in the entropy of the unfolded state.,Lys取代葡萄糖脱氢酶的Ser231，突变体在55 的半衰期比天然酶高8倍，活力相当 (酶表面亲水化) 枯草杆菌蛋白酶的Cys取代Met222催化速度增加2倍；用Ala、Ser 或Leu取代Met222，酶可以抵抗高达1mol/L H2O2的氧化失活 (抗氧化失活) 三糖磷酸异构酶的Asn144用Thr取代，Asn78用
27、Ile取代，突变酶在100 的稳定性比天然酶高2倍；枯草杆菌-淀粉酶Asn190用Ala取代，在80 的半衰期增加6倍(Asn脱酰胺失活),PCR定点突变(PCR mutagenesis),Introduces sequence changes into (cloned) DNA fragments; Overlap extension method requires 2 mutagenic primers and 2 others; Amplify a 5 fragment and a 3 fragment that overlap and each have the mutation; U
28、se these products in another reaction to produce the full-length mutated DNA.,PCR mutagenesis- overlap extension,“If a biochemist wishes to improve on a behaviour that is already optimized by natural selection, mutants are unlikely to yield enzymes with improved performances” S. Benner (1989) Chem.R
29、ev. 89,789-806,2.7. 肽链的有限水解与肽链的延伸,生物体内：酶原激活,主要是降低免疫原性,用木瓜蛋白酶水解亮氨酸氨肽酶，2/3被除去，但活力不变 烯醇化酶在水解掉150个氨基酸后，活力仍可保持,肽链的延伸,Phusion iProof,2.8.物理修饰,通过物理方法改变酶的空间构象,羧肽酶经高压处理后，底物特异性发生改变，有利于合成反应 纤维素酶高压处理后，最适温度降低，但活力提高,补充材料,Esterification of phenyl-ethanol with lauric acid,hr,Two-phases transgalactosilation,Two-phas
30、es transgalactosilation,Chemical modifications (in vitro engineering) One of the first way and a re-emerged method for altering protein properties. Polyethylene glycol (PEG) modification of protein surface amino groups reduces immunoreactivity, prolongs clearance times, improve biostability, increas
31、e the solubility and activity of enzymes in organic solvents. (DeSantis, G. and Jones, J.B. (1999) “Chemical modification of enzymes for enhanced functionality”, Current Opinion in Biotechnology, 10(4):324-330),Some chemical modifications that may stabilize proteins,Polyethylene glycol (PEG) modification of proteins,Cyanuric chloride,p-nitrophenyl chloroformate,