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1、大标题：先空着吧，等我自己填 点击字体就可以更改,一、研究背景,1、口腔环境是动态变化的。口腔中的平均温度为37，但局部地区的温度并不完全相同，在黏膜表面和人工修复的牙冠上，过冷或过热的饮食就可使局部温度呈现较大幅度的变化。如在吃冰淇淋时，与冰淇淋接触的表明呈-5摄氏度，而和热饮料、吃火锅时，与其接触的表面温度可迅速上升至55摄氏度左右。几秒内表面温度差几乎为60摄氏度。事实证明口腔菌丛，尤其是黏膜表面和龈上菌斑中的细菌在短时间内能够经受得住如此大幅度的温度变化。,2、变形链球菌是公认的主要致龋菌，变形链球菌UA159全基因组测序已在2002年完成。 全基因组测序的完成使得变形链球菌全基因组芯
2、片成为可能。,3、细菌的生长增殖受其生存环境的影响，在不同的环境中细菌的代谢会产生变化，表现 为细菌所表达的蛋白质的质和量发生变化。目前，蛋白质组学是研究细胞表达蛋白质组 变化的最有效的技术平台，其中双向电泳及电泳图谱分析是最常用的基本研究手段，运 用质谱分析和同位素标记等技术则可对感兴趣的蛋白质进行深入细致的研究。,4、待补充，空一页,二、研究内容,1.共三条，先空着 2.共三条，先空着 3.共三条，先空着,三、相关研究资料,1、Suzuki等采用转录组学和蛋白质组学方法，对一株蓝细菌(Synechocystis spPCC6803)的热休克反应进行了系统研究。当培养温度转化为44后20 m
3、in，使用DNA芯片检测的结果表明，一些分子伴侣及蛋白酶的编码基因(例如groESL1、groEL2、htpG、 hspA)开始被诱导转录；60 min后，用双向电泳检测，发现这些分子伴侣及蛋白酶的表达水平也有升高，与芯片结果相吻合。 The heat shock response of Synechocystis sp. PCC 6803 analysed by transcriptomics and proteomics. 2、对普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)热休克反应的研究中，应用双向凝胶电泳方法发现DnaK、HtpG、HtrA、AhpC等热休克蛋白表达水平
4、的变化与芯片结果一致。 Global analysis of heat shock response in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. 3、有学者用双向电泳观察了变链在多种环境应激下的蛋白质表达，发现变链在受到氧化、酸、饥饿、高渗透压和热应激后，有30-89 种蛋白质表达水平改变，有些蛋白表达水平在各应激反应中均改变， 称为普遍性应激蛋白，其他的则在一个或某几个条件下的应激反应中变化，称为特异性应激蛋白。 Chia 等用差异显示RT- PCR 检测变链在环境应激下的基因表达水平，发现类似的基因表达变化。,四、研究方案,变形链球菌UA159不同生长
5、阶段和不同条件下耐热性的差异 对不同时期不同PH条件下的菌株进行热应激，筛选热应激性能优良的菌株,选取耐热性强菌株进行热适应条件和致死评价条件摸索 1、在不同温度下水浴锅中处理细菌30min，分别活菌计数，确定热适应和致死评价温度范围 2、按照1中所确定的温度，将菌液在该温度下热适应处理30min，对照置于37摄氏度培养30min 3、计算对照管和测试管菌体的存活率，通过比较两者的存活率来选择最佳的热适应温度 存活率=评价前活菌数/评价后活菌数*100% 耐热性提高倍数=热适应组存活率/对照组存活率,DNA微阵列分析 目的：利用基因芯片技术筛选热应激后变形链球菌中差异表达的基因。 方法：构建变
6、形链球菌基因表达谱检测芯片，利用基因芯片技术筛选不同温度下变形链球菌差异表达的基因，以观察温度对变形链球菌基因表达的影响。,1、芯片制备 2、细菌总RNA提取及纯化 采用TRIzol试剂盒分别提取两组标本中的总RNA 使用QIAGEN Raeasy Kit 分别纯化总RNA 将两组标本中的总RNA等量完全溶解于Mili-Q水中，-80冻存待用 3、探针标记 cRNA标记与合成运用逆转录法荧光标记提取的样 本RNA，各组均用Cy3单标标记。 4、芯片杂交和洗涤 cRNA样品片段化及芯片杂交 5、数据分析 芯片杂交结果采用Agilent G2565AA荧光扫描仪进行扫 描，Feature Extr
7、action软件读取，扫描仪分辨率为5 m，光电欧联管分别设置为100和10各扫描1次，2次扫描结果Agilent软件自动合并，合并结果采用Feature Extraction进行均一化处理。本次实验的均一化系数为0853，2张芯片的平均信号强度与平均背景的比值均大于3，符合Agilent表达谱芯片的成功标准。筛选差异表达基因的标准为：Ration57(Log2Ration25)和Ration一57(Log2Ration一25)。 6、生物信息学分析 利用Agilent公司提供的Cluster30软件对金黄地鼠正 常颊黏膜及癌前病变的差异表达基因行聚类分析；用Gene Ontology(htt
8、p：wwwncbinlmnibgov)功能分类标准对差异基因进行功能分类分析。 7、RT-PCR 为验证芯片结果的可靠性，随机选取芯片结果中上调 基因Atp6vOd2和下调基因Sfrp2用RTPCR验证。按照说明书使用nvitrogen的TRIzol试剂盒分别从各个样品组织中提取总RNA，然后取1 Ixg的RNA在2O l的反应体系中按 照Invitrogen说明书加入一定剂量的逆转录酶和随机六聚体逆转录成cDNA，随后将逆转录成的cDNA进行PCR扩增 反应，其过程为943 min预变性，94 1 rain变性，5230 s退火，72C 1 rain延伸，3O个循环，72C 10min终止。
9、其中PCR引物使用Primeor30设计,二维凝胶电泳,1、样品制备 收集菌体、洗涤、材料破碎 失活或者去除干扰物质 蛋白质增溶溶解 2、蛋白质提取 冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀 3、蛋白质定量和上样 采用胶内加样法，IPG胶条(pH值范围为pH 3 to 6, 4 to 7, or 5 to 8)水合作用过夜后，再进行等电聚焦，总电压合计达60 kV。等电聚焦结束后，将IPG胶条置于平衡液I(005 molLTris-HClpH 88，6 molL尿素、质量分数30 甘油，质量分数2 SDS、质量分数1DTT或者5%的碘乙酰胺还原15 min），将IPG胶条移至质量分数12%-14%的S
10、DS-PAGE 胶上，行二维垂直SDS-PAGE电泳，电泳结束后，固定胶，用考马斯亮蓝染色。 考马斯亮蓝染色（将凝胶转入染色盘中倒入考染液,振荡染色过夜,约12 h。染色结束后以20%乙醇双蒸水洗涤脱色一次,再以双蒸水洗涤两次至背景清晰）,5、图像采集分析 通过Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件对凝胶进行扫描获取图像,借助图像分析软件PDQuest 7. 0进行详细分析,比较蛋白质斑点差异。软件会根据斑点的位置、大小、性状等参数，自动将不同图谱中的相同蛋白质点进行匹配。不能匹配的蛋白质斑点视为差异点。 6、数据处理 7、统计学分析,质谱分析,蛋白质点采摘、蛋白酶消化、质谱光谱分析 研究意义: 2002年变形链球菌UA159全基因测序的完成伴随着HGP的顺利进行， 对口腔细菌基因组学的研究已经从结构基因组学转向功能基因组学，从基因水平研究细菌如何抵抗宿主防御以及如何适应口腔环境，将为新的防龋措施的发现奠定基础。,