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1、岛津液相色谱维护保养,液相色谱基础知识,SHIMADZU,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 流动相只起运载样品分子的能力,液相色谱基础知识,一、定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同 而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱固定液,液相色谱基础知识,液相色谱基础知识,液相色谱流程图,溶剂,输液泵,进样器,柱温箱,检测器,数据处理,液相色谱基础知识,
2、采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相的选择,溶 剂 等 级,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,水 / MeOH梯度 ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH over 10 mins and hold for 15 mins.,溶 剂 等 级,鬼峰的出现,溶 剂 等 级,溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤
3、(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,溶 剂 等 级,General Maintenance and Troubleshooting,缓冲液的使用,使用前必须过滤 使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 用纯水冲洗30-60min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min 易受到细菌和霉菌的影响,溶 剂 等 级,不能直接用有机溶剂冲洗,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵
4、塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意： 1）每天脱气 2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长,溶 剂 前 处 理,岛津VP系列输液泵,目的 单元 流速范围 特性和应用,分析 LC-10ADVP 0.001-9.999 无脉动，适于 半微量LC 和 LC-MS,LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性， 适于常量分析,*所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度,液相色谱基础知识,L
5、C-10ATvp泵： 串联式往复泵,LC-10ADvp泵： 并联式微体积往复泵,LC-10ADVP / LC-10ATVP工作原理,单向阀结构,单向阀原理,LC-10ADVP / LC-10ATVP工作原理,液相色谱基础知识,梯度洗脱形式： 线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度：,梯度洗脱装置： 高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入 低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。,梯度洗脱形式的选择,液相色谱基础知识,梯度洗脱： 优点：可提高分离度、缩短分离时间
6、、降低最小检测量和提高分离精度 注意事项： 溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,1. 使用流动相溶解样品 - 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要 - 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀 2. 进样前最好使用0.45um 的膜进行过滤 如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤,样 品 处 理,进样器,自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入
7、,液相色谱基础知识,进样量和检测器响应的关系示意图,液相色谱基础知识,进样体积,检测器响应值,定量环体积的一半,3倍定量环体积,全量注入,部分注入,手动进样器的原理图,装填状态,液相色谱基础知识,进样状态,交叉污染的原因,微量注射器,红色表示残留样品,手动进样法,一般的方法 1.在进样状态下清洗针口 2.在装填状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到进样状态,手动进样法,便捷的方法（不需清洗） 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态,柱温箱,分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性,液相色谱基础知识,柱压低于150kgf/cm2 柱温在
8、40左右，最高使用温度为50 缓冲液PH使用范围为27 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快,返回,ODS柱的使用注意点：,硅胶在PH为34时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。,液相色谱基础知识,硅胶基底,聚合物基底,pH 范围,2 - 7.5,宽范围,有机溶剂,所有,有限制,压力, 250 kgf/cm2,低压,温度,宽范围,60C,液相色谱基础知识,色谱柱的类型及适用范围,分 析 柱 的 维 护,在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下 (0.2-0.3 ml/min)冲洗 30 mins，长时间未用的分析柱也要同样 处理 定期使用强溶剂冲洗柱子 3、使用缓冲盐时，要先用
9、水冲洗，再用有机溶剂冲洗 4、净化样品 5、分离条件 6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯,常用检测器,紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器,液相色谱基础知识,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，AKCL 优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,紫外检测器,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器（SPDM10AVP） -二十一世纪标准紫外检测器 色谱定性依据： 保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器,液相色谱基础知识,样品池,二极管阵列,光栅,D2
10、/ W 灯,每一组分可在每一波长处得到一吸光度值,二极管阵列检测器,1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰,二极管阵列检测器的优点,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测 优点： 1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一 2）选择性好 3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质 可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）,荧光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点：通用型检测器， 缺点： 1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器,示差折光检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱 缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%) 主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子,返回,电导检测器,