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1、Wishing you many future successes,补充内容一 抗生素,一、抗生素概念：微生物在代谢过程中产生的，在低浓度下就能抑制它种微生物的生长和活动，甚至杀死其他种微生物的化学物质。 补充：1、来源：也包括高等动、植物产生的代谢物，甚至包括化学合成或半合成的化合物。2、功能：也包括某些抗肿瘤、抗病毒、杀虫除草等物质。,二、拮抗作用：一类微生物抑制或杀死其它类微生物的作用称为微生物拮抗作用。,三、抗生素的抗菌性能 1、选择性作用 抗菌谱：一种抗生素只对一定种类的微生物有抗菌作 用，即抗菌谱。 2、选择性毒力 抗生素对人体及动、植物组织的毒力，一般小于它对 致病菌的毒力，称为
2、抗生素的选择性毒力。a-鹅膏蕈碱 3、引起细菌的耐药性 细菌在抗生素作用下，除了大批敏感菌被抑制或杀死以 外，常常会有一些菌株调整或改变代谢途径，从敏感菌变为 不敏感菌，即产生细菌的耐药性。,四、抗生素的抗菌作用机制 1、抑制核酸的合成 （1）与DNA结合，抑制DNA的复制和转录 放线菌素D、丝裂霉素C等。 （2）抑制转录起始、延伸 利福霉素、利福平等，与聚合酶-亚基结合，阻断转录起始，另外利福霉素还具有阻断RNA链延伸功能,2、抑制蛋白质的合成 （1）抑制氨酰-tRNA的合成 吲哚霉素抑制色氨酰-tRNA的合成 （2）抑制蛋白质合成的起始 氨基环醇类抗生素链霉素，引起密码错读或抑制起始复合物
3、的形成； （3）抑制肽链的延长 四环素类抗生素（金霉素、土霉素）封闭A位，氯霉素与50S亚基结合，环己亚胺与60S亚基结合，抑制肽酰转移酶的活性。 （4）抑制蛋白质合成的终止 嘌呤霉素具有-氨基，可以与正在生长的肽链羧基形成肽键，并释放肽链。,3、改变细胞膜的通透性 多肽类抗生素具有表面活性剂的作用，能降低细菌细胞 膜的表面张力，从而改变了细胞膜的通透性，甚至破坏膜的 结构。 离子载体抗生素（转运离子抗生素）：某些抗生素如缬 氨霉素等是脂溶性物质，它们能结合并运载特定的阳离子通 过双脂层膜，很像膜系统上的离子载体，因此，称它们为离 子载体抗生素。,4、干扰细胞壁的形成 青霉素干扰细胞壁的形成主
4、要是抑制粘肽合成 的最后一步，即转肽作用。 5、作用于能量代谢系统或作为抗代谢物 抗霉素A、寡霉素、短杆菌肽S抑制氧化磷酸化作用,五、细菌对抗生素耐药性的生物化学机制 1、耐药菌产生导致抗生素失效的酶 2、耐药菌改变对抗生素敏感的部位 例如：耐利福平菌株染色体突变，改变RNA聚合酶-亚基， 使复制酶不能与抗生素结合。 3、耐药菌降低细胞透过抗生素的能力 （1）合成通透障碍物 （2）耐药菌基因突变影响通透系统 （3）产生转运抗生素的拮抗系统,补充内容二 生物化学技术,第一部分：蛋白质操作技术 一、蛋白质的透析 二、超滤 三、 AA纸层析 四、蛋白质凝胶层析、离子交换层析、亲和层析 五、蛋白质电泳
5、技术 六、蛋白质免疫印迹实验 七、蛋白质的定量测定 八、蛋白质三维结构的测定,一、蛋白质的透析 透析膜是半透膜，蛋白质等大分子物质，它不能透过 透析膜，而小分子物质（无机盐、单糖等）可以自由通过透 析膜与周围的缓冲溶液进行溶质交换，进入到透析液中。,二、超滤,依赖于被分离物质分子的大 小、形状和性质的区别，在一定的 压力差下，水和小分子能通过具有 一定孔径的特制薄膜渗透过膜，而 大分子不能透过膜，从而使大小不 同的分子达到分离的目的。超滤是 脱盐、浓缩、生物大分子分离常用 的方法。,三、层析技术 层析（chromatography）：色谱。利用物质 的吸附能力、溶解能力、亲和力、阻滞作用等物理
6、 性质不同对混合物进行分离分析的方法。,（一）AA纸层析（paper chromatography） 液-液相分配层析：纤维素吸附水为固定相，有机溶剂为流动相；分配系数=固定相浓度/流动相浓度；物质在固定相和流动中分配系数不同，则发生不断抽提从而在支持介质滤纸上分开；分配系数小，迁移速度快，Rf大，分配系数大则相反。,（二）蛋白质的凝胶过滤层析 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大 分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析 住时，溶液中的物质就按照不同相对分子质量被分来了。,目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂 糖凝胶，其中最常用的是葡聚糖凝胶。 葡聚糖凝胶（
7、Sephadex),它是葡萄糖通过-1,6-糖苷 键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联 而成的具有三维空间的多孔网状结构。,控制环氧氯丙烷的用量，可以合成网孔大小不同的葡聚 糖凝胶，即不同规格的凝胶。葡聚糖凝胶从G-10G-200有 多重类型。G后数字表示每克干胶充分溶胀后吸水的克数乘 以10，反映了网孔的相对大小。G后数字越小，其溶胀后的 网孔越小。一般G-10G-50适用于蛋白质与小分子或无机 盐的分离，G-75G-200适用于分子质量大于10000Da的蛋 白质的相互分离。,总体积V=V0+Vi+Vg V0：外水体积，存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于流动
8、相容积。 Vi：内水容积，即凝胶颗粒内部所含水相的容积，固定相的容积。 Vg：凝胶本身的容积。 死时间（t0）：不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最 大值所需要的时间。 死体积（V0）：不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最 大值所需的流动相体积。 保留时间（t R）：组分从进样到出现峰最大值所需的时间。 保留体积（VR）：组分从进样到出现峰最大值所需要的流动 相体积。,（三）离子交换层析 （ion-exchange chromatography,IEC） 利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被 分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达 到分离目的的一种柱层析。,离子交换色谱的基本原
9、理是离子交换剂是在一种高分子的不溶性载体和其他天然聚合物上引入具有解离功能的离子基团阳离子基团或阴离子基团，这些基团可与溶液中带有相同电荷的离子化合物进行置换反应。在一定的pH环境中，不同物质在溶液中的解离度不同，所带的电荷存在差异, 与离子交换剂的交换能力也不同，利用电荷之间的差异将不同物质分开。 O- A+ + B+ O B+ + A+ 介质 离子 介质 离子,包括阳离子交换树脂和阴离子交换树脂,（五）亲和层析（affinity chromatography）:根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用，选择性吸附混合物溶液中的溶质而进行的层析分离方法,四、蛋白质电泳
10、（electrophoresis）技术 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极 移动，称为电泳。蛋白质在非等电点时带有电荷。,自由界面电泳 等电聚焦电泳 区带电泳：纸电泳、乙酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳（圆盘电泳、平板电泳等）,（一）等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。即在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，形成一个很窄的区带。,通电,（二）区带电泳： 1、乙酸纤维素薄膜电泳,2、凝胶电泳,包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺（Acr）和交联
11、剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）或核黄素（VB2）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 A、 TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82- 2SO4- B、硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链 C、 Bis将单体长链间连成网状结构,凝胶浓度： T（Acr和Bis总浓度）%= 100% C（交联剂百分比）%= 100% a=Acr克数 b=Bis克数 m=缓冲液体积（ml）,a+b,m,b,a+b,（2）据电泳形式分为 圆盘电泳、平板电泳等 圆盘电泳
12、：在玻璃管中进行的凝胶电泳,平板电泳：在铺有凝胶的玻板上进行的电泳,（3）电泳系统,PAGE根据有无浓缩效应分为两大系统：连续系统和 不连续系统（具有分离胶和浓缩胶） 不连续系统的不连续性体现在： 凝胶孔径的不连续性（浓缩胶孔径大，分离胶孔径小） 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 电位梯度的不连续性,（4）SDS-PAGE,在PAGE电泳体系中加入十二烷基硫酸钠（SDS） SDS与蛋白质结合产生两个后果：SDS带有大量的负电荷，在其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可以分子量差异将各种蛋
13、白分开；同时SDS与蛋白质结合引起蛋白质构象的改变，使蛋白质都成为形状近似雪茄状的长椭圆棒，SDS-蛋白质复合物短轴相同，而长轴与蛋白质的分子量成正比。,由此，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数有关。 电泳体系中巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键断裂，使多肽组分分成单个亚单位。,（5）聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（2-D）,利用蛋白质的等电点和相对分子质量的特异 性，将蛋白质混合物在电荷和相对分子质量两个水 平上进行分离。 等点聚焦（Isoelectric focusing,IEF） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS
14、-PAGE）技术。,等点聚焦,SDS-PAGE双向电泳,电泳结果,五、蛋白质免疫印迹实验(Western-blotting),Western-blotting：又称免疫印迹分析技术，是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支持物上，然后以特异的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印迹。,免疫印迹电转移方法,六、蛋白质定量测定,（一）微量凯氏定氮法 消化：蛋白质（或其它含氮有机化合物）与浓H2SO4共热时，其中碳、氢两种元素被氧化成CO2和H2O，而氮元素转变成NH3，并进一步与H2SO4反应生成(NH4)2SO4，残留于消化液中，该过程通常称为“消化”。,消化完毕后，加入过量浓碱（如NaO
15、H）使消化液中的(NH4)2SO4分解放出NH3，以蒸馏法借水蒸汽蒸出的NH3，用一定量、一定浓度的H3BO3溶液吸收。NH3与酸溶液中H+结合成NH4+，使溶液中的H+浓度降低，然后用标准强酸（如盐酸）滴定，直至恢复溶液中原来的H+浓度为止。 (NH4)2SO4 + NaOH Na2SO4 + 2NH4OH NH4OH NH3 + H2O 3NH3 + H3BO3 3NH4+ + BO33 BO33 + 3H+ H3BO3,最后根据所用标准酸的量计算出样品中的含氮量。大多数蛋白质的含氮量平均为16%，所以将测得的蛋白质的含氮量乘以蛋白质系数6.25（即每含氮1g，就表示该物质含蛋白质6.25
16、g），即可计算出蛋白质的含量。,（二） Folin酚试剂反应,用于蛋白质测定的Folin酚试剂反应是双缩脲方法的发展。该法所用试剂由两部分组成：碱性铜试剂相当于双缩脲试剂，Folin试剂含有磷钨酸和磷钼酸。 Folin酚试剂的显色原理是：首先在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质铜络合物，该络合物随之将磷钨酸磷钼酸还原成深蓝色混合物（钼蓝和钨蓝）。在一定蛋白质浓度范围内（约25500g/ml），其颜色深浅与蛋白质含量成正比，因此可通过比色法定量测定蛋白质含量。 Folin酚试剂反应是由酪氨酸和色氨酸的还原性基团（酚基、吲哚基）引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸、Tris、蔗糖、硫酸铵、巯基化合
17、物等对测定均有干扰作用。,（三）考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量,考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm。在一定蛋白质浓度范围内（11000g/ml），蛋白质染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。,蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。由于蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1g）。由于染
18、色法简单迅速，抗干扰性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的蛋白质快速微量测定方法。,七、蛋白质三维结构的测定方法,X射线衍射：通过测量一束给定波长的X射线被原子周围的电子所衍射后在相纸上产生的点的位置和强度，可以确定一个晶胞中原子的空间排列。 核磁共振（NMR）：由原子核的量子特征-核自旋角动量产生的现象。,第二部分 核酸操作技术,一、核苷酸序列测定 二、Western-blotting、Northern-blotting 三、PCR,一、核酸的序列测定,Sanger：双脱氧链终止法和Gilbert：化学法 双脱氧链终止法的技术基础： 、凝胶电
19、泳分离DNA单链片段时，小片段移动快，大 片段移动慢。 、用合适的聚合酶可以合成出与单链DNA互补的链。 、反应体系中包括：单链模板、四种脱氧核苷酸、合 适的引物、一定比例的2 , 3 -双脱氧核苷三磷 酸（ddNTP)以及若干种适量的无机离子。,核酸化学,酶法测定DNA序列的原理,DNA序列测定的自动化,二、核酸印迹,Southern-blotting：Southern印迹。指经过凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相载体上，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。 Northern-blotting：通过凝胶电泳使完全变性的RNA按照大小分离，然后通过印迹技术将RNA分子转移到固相支持物上，固定后采用特异探针进行杂交，用于基因表达特异性分析和定量分析。,Southern-blotting（ Southern 印迹） Northern-blotting （ Northern 印迹）,三、PCR,聚合酶链式反应（polymerase chaireaction,PCR） 为一种在体外快速扩增特定基因或DNA的方法，又称为无细胞 克隆技术。,N次循环后，扩增DNA区段的理论拷贝数：2n,常规PCR主要步骤,PCR流程图,反向PCR：可以使靶序列两侧 的未确定区段得以扩增,