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1、农田温室气体CH4产生的微生物生态学机理研究进展,吴洪生 南京信息工程大学 应用气象学院 ,1.温室气体甲烷概况 2.农田温室气体甲烷的来源 3.农田产甲烷微生物 4.环境条件与农田甲烷的产生 5.不产甲烷菌与产甲烷菌生态互作关系,甲烷是地球上主要的温室气体，对全球气候变暖的增温作用大约占15%，其相对二氧化碳的增温效应值为19。 1776年，A.伏打发现池沼沉积物中有一种可燃性气体，沼气。 1868年，E.贝香提出沼气是由微生物降解有机质而产生的。,太空望远镜上拍摄火星甲烷 -黄（红）色部分是甲烷,卫星上拍摄地球甲烷 -棕色部分是甲烷,农田温室气体甲烷的来源: 1.土壤腐殖质的分解 -5-8
2、% 2.土壤有机残体分解 -40-70% 3.有机肥分解 -20-40% 4.其它人工合成有机物 -10-15%,与农田甲烷形成有关的微生物 1.先导生态菌群 2.产酸产氢微生物（菌群） 3.产甲烷细菌（菌群）,1.甲烷细菌（菌群）,甲烷细菌是专性厌氧的，属于古细菌，对温度、pH值、微量氧、有毒物质等敏感。最适宜温度35C-38C，4 C也能生存，甲烷细菌要求的pH值在6.8-7.2之间。 是一群非常特殊的微生物。只能利用比较简单的有机化合物和无机化合物，而且生长缓慢。为化能自养型，存在对氧极为敏感的F420因子，即使存在微量的氧都会对产甲烷菌造成不利影响。,所有产甲烷菌都能利用氢气和二氧化碳
3、，代谢产生甲烷，其中绝大多数还能利用甲酸和乙酸。乙酸是产甲烷的关键性物质，大约72%的甲烷来自于乙酸。 产甲烷菌的生长繁殖相当缓慢。甲烷菌的繁殖倍增时间一般都比较长，达46天。在人工培养条件下需经过十几天甚至几十天才能长出菌落。 菌落一般圆形、透明、边缘整齐，在荧光显微镜下发出强的荧光。,在厌氧条件下以甲烷为特异代谢产物。1956年，H.A.巴克打破按形态差异将产甲烷细菌分散在不同科属中的分类系统，把具有上述特性的多种形态的细菌划归为一个生理群，建立甲烷细菌科。伯杰氏鉴定细菌学手册(第 8版)基本上采纳了巴克的系统。70年代后期和80年代初，G.E.福克斯、W.E.巴尔赫和C.R.沃斯等人发表
4、比较产甲烷细菌和其他细菌以及某些真核,生物的16S（或18S）核糖体核糖核酸(rRNA)寡聚核苷酸序列谱的相似性的研究成果，指出产甲烷菌是一群独特的产物，与其他细菌和真核生物显然不同。他们主张把产甲烷细菌归属于古细菌，与其他细菌（真细菌）和真核生物并列为生物的3大类群。 W.E.巴尔赫还提出了产甲烷细菌的分类系统，其中包括甲烷杆菌目、甲烷球菌目和甲烷微菌目 3目，甲烷杆菌科、甲烷球菌科、甲烷微菌科和甲烷片菌科4科。 产甲烷细菌的特性为：代谢产物为甲烷和二氧化碳；产能机质范围窄，为氢、甲酸、甲醇、乙酸、甲胺类；需要低的氧化还原电位（-330毫伏）；有独特的辅酶，辅酶及生长因子为辅酶M.F420、
5、F430、COM、F342,B因子.CDR、,F430等； 有独特16SrRNA寡聚核苷酸序列谱； tRNA中缺乏其他生物所共有GTCG核苷酸序列；细胞壁中没有其他细菌细胞壁中所共有的胞壁酸和 D型氨基酸；所含类酯大部分不可皂化为含植烷醚键、鲨烯、氢沙烯； DNA的分子量可能为大肠杆菌的1/3(1.1109)。 目前总共分离、鉴定出237株产甲烷菌。,农田土壤产甲烷细菌群落分子生态分析,DGGE, TGGE, RFLP, t-RFLP, SSCP,Cloning,Sequencing,Identification,Phylogenetic analysis,Fingerprinting:,土壤
6、产甲烷细菌群落系统进化树,产酸产氢微生物（菌群） 醋酸杆菌、丁酸梭菌、乳酸菌、乳酸杆菌、拟杆菌属、气杆菌属、发酵单胞菌属、梭状芽孢杆菌属、红螺菌属、酵母菌、丝状酵母、光合细菌、互营单胞菌属、互营杆菌属、梭菌属、暗杆菌属、荚硫菌属、红微菌属、外硫红螺菌属、红假单胞菌属、蓝细菌类硫螺菌属、板硫菌属、梭杆菌属、闪囊菌属、网硫菌属、埃希氏菌属 先导生态菌群（伴生菌） 细菌：梭状芽孢杆菌、乳酸杆菌，革兰氏阳性小球菌，丁酸梭菌和其它梭菌、纤维素分解菌、硫酸盐还原细菌、硝酸盐还原细菌、产氨细菌、产氢细菌、产乙酸细菌,真菌：白腐菌、曲霉属、青霉、嗜热真菌属、根霉、担子菌属、腐霉属、酵母菌、丝状真菌、假丝酵母属
7、、子囊菌属、裂殖酵母菌属、球拟酵母属、酒香酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、克鲁弗氏酵母属、隐球酵母属、德巴利氏酵母属、卵孢酵母属 放线菌：嗜热褐色放线菌、普通小单胞菌 、诺卡氏菌属、小诺卡氏菌属、链霉菌属,底物： 1.与农田土壤有机质（物）结构复杂性有关； 2.与有机物新鲜性有关； 3.与土壤含水量有关； 4.与土壤肥力有关,在甲烷产生过程中，存在着一个种群众多、关系复杂的微生物类群。甲烷的产生就是这个复杂的微生物类群中各类微生物相互协同、相互制约的结果。 这类微生物的相互作用，包括不产甲烷菌和产甲烷菌之间、产甲烷菌之间和产甲烷菌之间的相互关系。其中尤以不产甲烷菌和产甲烷菌之间的相互关系最
8、为重要。 不产甲烷菌为产甲烷菌提供生长和产甲烷所需的物质；产甲烷菌又为不产甲烷菌生长解除反馈抑制,不产甲烷微生物 不产甲烷微生物，就是将复杂有机物质转化为简单的小分子化合物的一系列微生物。参与这一步骤的微生物包括厌氧菌和兼性厌氧菌。分为细菌、真菌和原生动物三大类，其中以细菌为主。不产甲烷阶段的细菌种类很多，数量巨大，但具有水解活性的细菌只占很小部分。其中专性厌氧菌数量最大，比兼性厌氧菌和好氧菌多100200倍。专性厌氧菌是不产甲烷阶段起主要作用的菌类，其中包括乳酸杆菌，革兰氏阳性小球菌，丁酸梭菌和其它梭菌等。,不产甲烷菌把各种复杂的有机物如碳水化合物、蛋白质和脂肪等进行厌氧降解，生成氢气、二氧
9、化碳、氨气、乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、甲醇和乙醇等产物。其中丙酸、丁酸和乙醇又可被产氢产乙酸菌转化为氢气、二氧化碳和乙酸。这样，不产甲烷菌通过其生命活动为产甲烷菌源源不断地提供合成细胞物质和产甲烷所需的前体物质和能源物质。而另一方面，不产甲烷菌的发酵产物又可以抑制本身的发酵过程。酸的积累可以抑制产酸细菌的继续产酸，,氢的积累也同样可以抑制产氢细菌的继续产氢。但是由于在正常的甲烷形成过程中，产甲烷菌连续不继地利用不产甲烷菌所产生的酸、氢气和二氧化碳等，使厌氧消化中不致有酸和氢的积累，不产甲烷菌也就可以继续正常的生长和代谢。由于不产甲烷菌与产甲烷菌的协同作用，致使土壤中的腐殖质、有机质、生物残体及有
10、机肥等不断降解产生甲烷。,不产甲烷菌为产甲烷菌创造适宜的氧化还原条件（即厌氧环境） 在农田土壤中，由于早期进入大量空气，对产甲烷菌是有害的。但由于不产甲烷菌类群中的需氧和兼性厌氧微生物的活动，使土壤环境中的氧化还原电位不断下降，逐步为产甲烷菌的生长和产甲烷创造厌氧环境。,不产甲烷菌为产甲烷菌清除有毒物质 不产甲烷菌中，有许多菌能分解和利用对产甲烷菌有毒害作用的物质，如酚类、苯甲酸、氰化物、长链脂肪酸和重金属等物质。此外，不产甲烷菌的产物硫化氢可以与重金属离子作用，生成不溶性的金属硫化物而沉淀下来，从而解除了某些重金属物质的毒害作用。,不产甲烷菌与产甲烷菌共同维持环境中适宜的PH 在甲烷产生初期
11、，不产甲烷菌首先降解原料中的淀粉和糖类等，产生大量的有机酸。同时，产生的二氧化碳也部分溶于水，使环境的PH下降。 但是，由于不产甲烷菌类群中的氨化细菌迅速进行氨化作用而产生的氨气可中和部分酸；再则由于产甲烷菌不断利用乙酸、氢气和二氧化碳形成甲烷，而使环境中的酸和二氧化碳的浓度逐步下降，环境pH逐渐上升。 通过两类菌的共同作用，就可以使PH稳定在一个适宜的范围内。,（5）除了协同作用外，产甲烷菌群和不产甲烷菌群之间也存在着相互抑制和制约的一面。其中包括代谢产物自身的抑制和菌种间的抑制。别外，产酸菌要求的最适温度、PH和EH（氧化还原电位）等方面都与产甲烷菌有明显的差异。在产甲烷初期的环境条件对产酸菌较适应，因此这类菌生长较旺盛，产酸菌成为这一阶段的优势微生物。随着产氨细菌大量产生氨，使PH逐渐上升，EH下降，这样又逐步地有利于甲烷菌的生命活动，甲烷菌的数量大大增加。再则，由于产氨细菌的活动，PH上升，对产酸菌有制约作用，而对产甲烷菌有协同作用，从而使产酸到产甲烷这一过程中微生物的生长和衰亡变化达到平衡。,未来展望 1.更多的产甲烷菌的分离鉴定； 2.分子生物学手段的运用； 3.农田原位研究产甲烷菌； 4.农田甲烷产生的分子和生态、生理机理,谢 谢！ 联系人：吴洪生 Email: 国际SCI刊物Current Microbiology编委 南京信息工程大学应气院,