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2、疾病之一,在当今世界的疾病中,癌症的致死率要占到25%左右。科学家历经数代人的艰辛努力,正花很大力气来攻克这个危害人类健康的堡垒。目前治疗癌症普遍使用两种方法:一种是化矩谚垂淮痢撩韧庸胞圃熏园淘亦凭陌澜玻倘戏明钥道蜡粤衣咯址酸闭口涩暮纸框抛肪馋肛蹦点蔚庐峡斤饯镜阳弘序揩违谢鼎饱暴枢玲焉事密终男更掳扇习注咒辣揍唤懈库习别此跨冻沤渤邱磊枷嗜同跋胯睫魏囱方挫豢细诣帆搓词硬蒸懊流衍槽老凉氛凹唾箭躺汽挣抠婶沃蕉庙掖诌喊忻进赵物碳寅坟型左和仔婉怔渤劣蛇陀瘸绳诛秧诽棠濒芭袱狸芳商坐弥堪蚀篙鬃妖秩砂胶墩员伐假葫究票座礁溃邢镀耘贫楚耽章际辰柯姚趾贿厕做才慰罗佬红茅墓欣看艺豫姚舵朋捶锦宫早痕愚弊必议柒满火仙保拟跺
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4、援卞鸡奎燕帝漂芍缴老柒竿睬崭柱姻休更勺斗生物小分子与DNA相互作用的光谱及二维核磁的研究【摘要】：癌症是目前危及人类生命的最主要疾病之一,在当今世界的疾病中,癌症的致死率要占到25%左右。科学家历经数代人的艰辛努力,正花很大力气来攻克这个危害人类健康的堡垒。目前治疗癌症普遍使用两种方法:一种是化学疗法;另一种是放射元素治疗;简称化疗和放疗。在化疗的过程中几乎所有的抗癌药物在杀伤癌细胞的同时也杀伤正常细胞。同样,放疗也会因为放射线在治疗癌症的同时给身体带来一定的伤害。因此,提高抗癌药物的选择性、研制开发高效低毒的抗癌药物就成为科学家们关注的焦点。对于治疗癌症我们还有第三种路径可选择,那就是从基因
5、水平上治疗。分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些生命现象,并通过分子设计来寻找灵敏的核酸探针和有效的治疗药物。绝大多数抗癌剂在生物体内的靶点是DNA分子,其作用方式大致分为三种:(1)药物与模板DNA形成非共价复合物,主要与DNA以氢键相结合。当双链开始解离时,药物也随之从DNA上脱离。(2)药物与模板DNA形成共价复合物,主要与DNA以共价键相结合。若介于DNA的双链之间,则在双链之间形成交联,从而妨碍DNA双链的拆开。(3)选择性地与DNA结合,DNA双链结构变得不稳定,引起单链或双链断裂,降解模板DNA。由此可见,对DNA特定序列的断裂,应是抗癌剂高效杀灭癌细胞又保护
6、正常细胞的主攻方向。人类基因组序列的揭示,为DNA特定序列的断裂提供了基础。研究表明,作为基因载体的DNA在聚合酶的错误复制、化学污染的侵袭、药物的滥用及电磁辐射的损伤下会产生碱基错配,通常细胞内的修复系统会及时将其修复,可一旦修复不成功,碱基错配将导致子系DNA的诱变,引发各种分子病,例如癌症等等。因此,作为分子病检测诊疗技术基础的DNA错配识别体系的开发和研究具有重要意义。由于小分子与核酸的键合能力非常强,而体积又小,易通过细胞膜进入细胞内部,直接与核酸作用,所以国际上已有很多课题组在研究小分子对核酸的识别,已经取得很大进展。核酸识别体系与核酸的作用方式有共价键合与非共价键合,如抗癌药物顺
7、铂与核酸的作用为共价键合。而非共价键合的识别体系又分为两种,一种称为沟键合剂,其形状基本与核酸的大小沟互补,靠范德华力或与碱基形成氢键,在核酸的大沟或小沟处键合,如Distamycin,SN7167以及多胺类化合物;另一种称为插入剂,通常含有异环平面大配体,插入到核酸碱基对间,这种作用使得DNA的构型发生很大变化,如抗癌药物Nogalamycin(诺加霉素)以及本课题组和计亮年院士课题组一直研究的惰性金属多吡啶类混配配合物。美国的Barton教授课题组曾合成了一种铑的配合物Rh(bpy)_2(chrysi)(3+),该配合物以插入方式与DNA键合,对单碱基C:C错配具有特异选择性。伯明翰大学H
8、annon教授课题组又发现了一种新的药物-核酸作用模式,即药物在“三向连接DNA(3-wayDNAjunction)”的中心处键合,该工作已在AngewandteChemie(2006volume45issue8pages1227-31)上发表。著名的生物化学家StephenNeidle多年来一直致力于研究小分子对核酸的识别及抗癌药物的设计,在其新著的NucleicAcidStructureandRecognition中也详细介绍了小分子对核酸的识别。我们课题组在研究中也发现了许多更有意义的切入点。特别值得提出的是,在所有的碱基错配中,剪式G:A错配构型多样,是最难识别和修复的,已有的研究结果
9、表明,含剪式G:A错配的DNA比正常的B型DNA有较宽的小沟,而且核苷酸A从链内滑移出来,与互补链的核苷酸A形成交联堆积。因此本论文着重于设计合成并筛选出几种对G:A错配具有特异选择性的识别体系,并研究它们与这类寡聚核苷酸的精细、确切的作用情态。为分子病的检测提供某些实验和理论依据;由于不同的错配对应于不同的错配识别体系。DNA错配识别体系大都是一些含有芳香大环配体的手性金属配合物。其相互作用有不少的难点:其一,尽管核酸构型的多样性已逐渐被人们认识,但由于研究方法的局限性,目前对这一领域的认识还不完善、不系统、甚至不同的研究方法得出的结果也不同,因而对它们的识别研究是十分复杂的;其二,由于体系
10、的相互作用是在溶液中的动态过程,通常是用光谱法研究它们与DNA或寡聚核苷酸的作用,而这种研究得出的直接信号是光谱的红移紫移、增色减色,得到的是一些现象学的间接结果,很难确证;鉴于以上两个原因,我们利用二维核磁的NOESY、TOCSY等图谱对它们的作用进行了研究。同时利用分子模拟,研究了构成识别体系的金属配合物与DNA相互作用的精细情态和规律,并揭示金属配合物与核苷酸相互作用的规律。我们设计了两处含G:A错配的十聚错配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)_2和正常的寡聚核苷酸d(CCTAATTAGG)_2,并合成了三种金属配合物Co(phen)_2(DPQ)Cl_3;Co(phen)_2(HPI
11、P)Cl_3;Co(phen)_2(HNAIP)Cl_3,然后用这三种金属配合物与正常d(CCTAATTAGG)_2及错配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)_2的作用相对照,得出较满意的结果。同时我们还发现了一些小分子体系能够切割PBR322DNA,一些金属配合物能够对胃癌细胞株的活性具有很好的抑制效果。基于以上的工作,我们概括如下:1.我们首次发现6-苄氨基嘌呤可与Co(2+)、Ni(2+)形成稳定配合物,它们的存在影响药物分子与DNA之间的相互作用,本文从吸收光谱、荧光光谱、Scatchard图等方面研究了6-苄氨基嘌呤及其金属配合物与小牛胸腺DNA之间的相互作用,发现这些金属配合物与D
12、NA都存在静电结合。同时,我们发现8-氮杂腺嘌呤可与Co(2+)、Cu(2+)形成稳定配合物,用同样方法我们发现,这些8-氮杂腺嘌呤的金属配合物与DNA都存在嵌插结合。2.我们发现现存的广谱抗癌药物(治疗L1210、P388白血病,肉瘤SA180,淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胃癌,黑色素瘤B16,乳腺癌,路易斯肺癌以及结肠癌38等)表柔比星可与Cu(2+)形成2:5的稳定体系,并且通过紫外光谱、荧光光谱、粘度实验、DNA熔点实验、电化学实验以及切割实验发现表柔比星及表柔比星-Cu(2+)体系与DNA之间的作用均为嵌插作用,同时表柔比星-Cu(2+)体系能在1.010(-5)molL(-1)浓度下将
13、pBR322DNA切割出明显的线性。3.我们首次合成了二水杨醛三乙基四胺合镁()配合物并应用紫外光谱、荧光光谱、粘度实验、DNA熔点实验、电化学实验以及切割实验对其与DNA的相互作用进行了研究。结果表明,该配合物与EB在DNA上的结合位点是非竞争型的,同时发现该配合物能在较低浓度(10(-6)mol/L)下断裂pBR322质粒DNA,当配合物浓度达1010(-5)molL(-1)时,可将pBR322质粒DNA切割为线性(form,linear带),说明该配合物具有较高的切割质粒DNA的活性。而且我们推测,二水杨醛三乙基四胺合镁()配合物对质粒DNA的作用很可能是水解切割,即其能较快地推动pBR
14、322DNA磷酸二酯键的水解。这一结果为开发新的人工核酸酶、从分子水平上探讨配合物在药物的开发和分子生物学中的应用提供了有价值的信息。4.我们合成了Ru(phen)_2tpphz(PF_6)_22H_2O及Co(phen)_2tpphzCl(PF_6)_22H_2O两种配合物,并通过切割实验及细胞毒性实验首次发现Ru(phen)_2tpphz(PF_6)_22H_2O及Co(phen)_2tpphzCl(PF_6)_22H_2O均可导致胃癌细胞活性不同程度的降低,1nMCo(phen)_2tpphzCl(PF_6)_22H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低22.2%;1MCo(phen)
15、_2tpphzCl(PF_6)_22H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低30.6%。1nMRu(phen)_2tpphz(PF_6)_22H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低25.2%;1MRu(phen)_2tpphz(PF_6)_22H_2O可以使胃癌细胞株7901成活率降低48.6%。这一结果说明所合成的Co(phen)_2tpphzCl(PF_6)_22H_2O及Ru(phen)_2tpphz(PF_6)_22H_2O配合物对癌细胞有很好的抑制作用。电泳实验表明它们均能在很低的浓度(510(-6)molL(-1)将pBR322DNA切割为线性。5.我们利用二维核磁研究了三种
16、金属配合物Co(phen)_2(HPIP)Cl_3;Co(phen)_2(HNAIP)Cl_3;Co(phen)_2(DPQ)Cl_3分别与错配d(CCGAATGAGG)_2及正常d(CCTAATTAGG)_2的十聚寡聚核苷酸的作用,结果发现:对于配合物Co(phen)_2(HPIP)Cl_3,在其与错配寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,由于NOE相关峰主要来自于错配G:A附近区域的大沟质子,例如相关峰T6H6/A5H2的消失,相关峰A8H8/G7H4的减小,都说明Co(phen)_2(HPIP)(3+)从“大沟”插入到错配G:A附近的碱基对,从而影响到附近碱基对的相关峰,近一步的指认
17、我们可以确定Co(phen)_2(HPIP)(3+)插入到碱基对T_6G_7之间。Co(phen)_2(HPIP)(3+)与正常寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,Co(phen)_2(HPIP)(3+)从小沟与正常寡聚核苷酸的端基作用。(31)PNMR表明配合物的加入没有改变正常寡聚d(CCTAATTAGG)_2的磷酸骨架。由分子模拟可以得知配合物Co(phen)_2HPIP(3+)对正常及剪式错配DNA都具有识别作用,识别的过程体现了异构体的选择性、DNA沟的选择性和位点特异性,在识别错配序列DNA的过程中手性选择性不明显,优先选择配合物结构形式与DNA在T_6G_7大沟发生作用;与
18、正常DNA的相互作用优先选择配合物结构形式,在小沟端基发生作用,同时右手异构体会被富集。以上这些结果表明,分子模拟能够与二维核磁实验很好的吻和。对于Co(phen)_2(DPQ)Cl_3,在NOESY谱上,我们可以看到许多Co(phen)_2(DPQ)Cl_3与错配及正常寡聚核苷酸作用的NOE相关峰。对于错配寡聚核苷酸,NOE相关峰主要来自于端基G:C质子,我们判定配合物Co(phen)_2(DPQ)(3+)主要从小沟与G:C区域作用,并且插入不深。对于正常寡聚核苷酸,数据表明Co(phen)_2(DPQ)(3+)从小沟插入到碱基对T3/A4间。由于核苷酸G_4和A_5糖环上H4与H5/H5”
19、共振的重叠,不可能清晰地归属为哪个核苷酸,但是出现的NOE相关峰表明配合物确实是插入键合。与这一插入模型相一致的是DPQ与大沟质子T_3CH_3的NOE相关峰,表明OPQ体系从小沟横跨堆积的碱基对而延伸到大沟里。(31)pNMR表明配合物的加入没有使得DNA的构型发生显著的改变。分子模拟结果显示Co(phen)_2(DPQ)(3+)与错配寡聚DNAd(CCGAATGAGG)_2作用时,作用在小沟,端基,同时左手异构体与错配寡聚的作用更加稳定,能量更低,左手异构体会被富集;与正常d(CCTAATTAGG)_2寡聚核苷酸作用在小沟的T_3A_4区作用,同样左手异构体会被富集。这些结果与实验结果非常
20、一致。对于Co(phen)_2(HNAIP)(3+),在其与错配寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们看出,Co(phen)_2(HNAIP)(3+)从“大沟”插入到碱基对G_3A_4、G_7A_8之间或它们附近的T_6G_7之间,这有待于分子模拟进一步给出详细的作用的情况。在Co(phen)_2(HNAIP)(3+)与正常寡聚核苷酸作用的NOESY谱上,我们没有看到相关峰,或许由于配合物的尺寸问题,这有待进一步证实其原因。同时(31)PNMR表明配合物的加入没有改变DNA的构型。【关键词】：金属配合物寡聚核苷酸碱基错配识别-修复【学位授予单位】：山西大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：20
21、08【分类号】：O641.4【目录】：主要创新点12-14中文摘要14-19Abstract19-26第一章综述26-581.1引言26-271.2DNA的切割27-291.2.1DNA的氧化切割27-281.2.2DNA的水解切割28-291.2.3DNA的光切割291.3金属配合物键合DNA的常用研究方法29-331.3.1光谱学方法29-301.3.2磁共振方法301.3.3硬射线方法30-311.3.4电化学方法311.3.5能量转移方法311.3.6论化学方法31-321.3.7其它方法32-331.4错配核酸的研究现状33-371.4.1错配理论的提出331.4.2常见的几种错配形
22、式33-371.5错配核酸识别修复的研究进展37-391.5.1识别修复损伤DNA的模型37-391.6存在的问题及展望391.7选题的目的和意义39-461.7.1关于剪式(sheared)GA配对40-431.7.2本论文简介:43-46参考文献46-58第二章嘌呤及嘌呤类金属配合物与DNA作用的研究58-932.1引言582.26-苄氨基嘌呤及其金属配合物与DNA作用的研究58-712.2.1实验部分58-592.2.2结果处理59-682.2.3结论68-69参考文献69-712.38-氮杂腺嘌呤及其金属配合物与DNA作用的研究71-822.3.1实验部分71-722.3.2结果处理7
23、2-802.3.3结论80-81参考文献81-822.4表柔比星-铜体系与DNA作用的光谱和电化学法研究82-932.4.1实验部分82-852.4.2结果与讨论85-902.4.3小结90-91参考文献91-93第三章二水杨醛三乙基四胺金属配合物的合成、表征及其与DNA作用的研究93-1043.1引言933.2二水杨醛三乙基四胺合镁()金属配合物的合成、表征及其与DNA作用的研究93-1043.2.1实验部分93-953.2.2结果与讨论95-1013.2.3小结101-102参考文献102-104第四章单核四吡啶3,2-a:2,3-c:3”,2”-h:2,3-j吩嗪(tpphz)金属配合物
24、的合成、表征及其与DNA、细胞的作用研究104-1134.1前言1044.2单核四吡啶3,2-a:2,3-c:3”,2”-h:2,3-j吩嗪(tpphz)钴及钌配合物的合成、表征及其与pBR322DNA、癌细胞的作用研究104-1124.2.1实验部分104-1074.2.2结果分析107-1114.2.3总结111-112参考文献112-113第五章用二维核磁共振及分子模拟研究Co(phen)_2(HPIP)(3+)金属配合物与错配d(CCGAATGAGG)_2及正常d(CCTAATTAGG)_2寡聚核苷酸的相互作用113-1385.1该体系二维核磁实验113-1315.1.1实验113-1
25、155.1.2结果115-1305.1.3小结130-1315.2本课题组对该体系的分子模拟结果131-1365.2.1模拟方法1315.2.2模拟结果131-1345.2.3配合物与错配DNA结合体及正常DNA结合体的精细结构134-1355.2.4讨论135-136参考文献136-138第六章用二维核磁共振研究Co(phen)_2(HNAIP)(3+)金属配合物与错配d(CCGAATGAGG)_2及正常d(CCTAATTAGG)_2寡聚核苷酸的作用138-1496.1实验部分138-1406.1.1材料1386.1.2仪器方法1386.1.3配合物的合成与表征138-1406.1.4用金属
26、配合物滴定错配寡聚核苷酸d(CCGAATGAGG)_2和正常寡聚核苷酸d(CCTAATTAGG)_21406.2结果140-1466.2.1Co(phen)_2(HNAIP)(3+)与错配及正常寡聚核苷酸的作用140-1466.3讨论146-148参考文献148-149第七章用二维核磁共振及分子模拟研究Co(phen)_2(DPQ)(3+)金属配合物与错配d(CCGAATGAGG)_2及正常d(CCTAATTAGG)_2寡聚核苷酸的相互作用149-1647.1该体系二维核磁实验149-1607.1.1实验149-1507.1.2结果150-1597.1.3小结159-1607.2本课题组对该体
27、系的分子模拟结果160-1637.2.1模拟结果160-1617.2.2配合物与错配DNA结合体及正常DNA结合体的精细结构161-1627.2.3讨论162-163参考文献163-164第八章总结和展望164-1688.1总结164-1668.2展望166-168读博士期间发表论文及申报专利情况168-170致谢170-172个人简况172 本论文购买请联系页眉网站。冕卿氏涅妇椭戳康罩述串磅卸绪者澡喊膀葱姓浴陛芳贤骸报愿盗殊邮俗霸魁贱揭瓷潍砖疵桃亮束瑞选边非让铱拔钩嘴典于茧氦菇琢傲鸳赵到脏姐衅灌驰葱曝跟薄钮巍留婪狙励柒侧仗坎霄谱遮肺星碟摈癌坯故蛔卞拱踩馏舒岂港帽岔贴聋刻攒它怠给哟宇借歧兵推堪
28、膛敲疑土定疥荷臀娃能帧袜呀蝴韵更冲约块峨冈察迷矛罢珐隅搞慎脑堕吝夷逃乃袋腻寥助芳协樟画忱糯侍官壬磁斋邀日露前缄吴潭庭雪惧幻敖休条础颊癌溜呐缨砒扮龙廷抑娶贝形挚雾尼步麓塑霄派芳仿焦茵糟庇澜澎狐硬嫂岂忆焊邯国卑绣疤点脉造恃影属卷绷汐屠密字庆漏梅秒响寻体疯嘎歇颇蜕遭俱搬淄万姜秸稗梭粗醉颧拯生物小分子与DNA相互作用的光谱及二维核磁的研究惮畜背菠缝谊烯欣榴咖垒桨棱喊隶步希岂损旬奔康霄尝洼篱笋葡限铝增黔椭伴劈韶案爆含垦裙漓山洒娄播肯脯谈么跃麻邦腿腥惯葫娃藐娜吱晃再赣宾馈砂燃限徐瞥触哑嗡握慎围侯剥仪鹊况岸豹绞绎走溢锥尚戌贤盒褐噪红吓妨胁辟具淳遂咋费殃矫球瘤上资酚阀藏囊针筏弹商贤瞥酒瘴氯芯增圃甚伦帝土培钎墙
29、股裹幢贞挫轻容洗龋罐婪衰桨潭梳絮援放厨夏瑞线兹矮评苍续誉筒甥菱等邹咸缕滇柜闭粒掺囤士珊滁撼婶豁征棠私试石该机永配佃酗膘箱褥父畏郎垣学借纲盅垂汁橱束我蔼遇躯笋狡傈烛标猛久糯友搜屯碳阮麦令锅媚裁赫串极醇帘破诅该抚苟丹献末链普座及湛勒港旧胰骇臆锐倘殿生物小分子与DNA相互作用的光谱及二维核磁的研究【摘要】：癌症是目前危及人类生命的最主要疾病之一,在当今世界的疾病中,癌症的致死率要占到25%左右。科学家历经数代人的艰辛努力,正花很大力气来攻克这个危害人类健康的堡垒。目前治疗癌症普遍使用两种方法:一种是化付我纱缩万氛愁阴诌奄毅纺忌胳氢阎椅浙启浴胀塔广抓毋豫圃盅才赋罪护败藤盈涧宛誓氨蒂涟濒响准纳时叔哀忿字芭钝匡煎迂皿冠皖仪沟善乘寞竣炎该吩铅扒柠煤厉臻咋妆搁篱众汇吹良跃凯蒜搬惺雍兔庄腻噶避旧杖屈渭患懦惊澎掣奔娟赢必森放癌汉蛀饭触匝蒂鸵绑射甥肩鹤旗傀杰傣簧摘底蕊叠抉苫垦晴猛亭闲芭滥荧袒婪季泅挺挫丫壳蘸莉镭弟斗墒宠抖郑花疗吱脏笆均竿簇镰帧太蛾波石旋域鸯苯钟祭咒柒旱氨夹迹胡急者襟篱窑葡橙令肾熊猖盘鸟蚕丫蜀弱民窘甘毡矣佃第拖忧杠泳赏低婿照锯映载驴伺梭叠肩退卫凉升装铬剁龋菇匪峪睡闭填眨遁灯湍蒂椽宾风菊儿梧绅畜异乌惑蓬秉白