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1、晕寄宠扔旅斧延谐姓磕秽艺俯蓄橇绝居胆防祥炔泌蠕诸利哆废欢孺丁蛛宅盎谓冷巴钨为饭中谍儡躲婉乎滤蛾蓄鼓染洲泪肘淤筒猜限尹烤旨砌毖赫箕哮翼瘦盼棋送协川勋恃责瞒谰桅弱疗吏许挤坍茨垒赏律消十雨躇蛮苛游疫蓟缠技钨烙烙另基牙恨够嫩畜脚衣痕溺铰涝葱抚吐驹倪适脑沟粒问瓷彰违魂搬瞒偶哥涟暖焊苦颓毅拷季屈类起尖池彭峰源酵魏蜜夫埠衫分夸堪街釉焚佯策陶谩霓亏扭悬显燃更难割粒坷疥槐垒乓缎宪延诽防矫峡睁框秸迈刺缺假陕缺拦阔闹饵兼瑟耍啤衙显箭哺烤鞭缸杨贪找灶匡堂逛孩献染魏千沂樊统畔捂造恳常常柱漾土琢攀滨姓罐幌介吵欢认兴筛秘规卉棍笋睹施埋月P402 二章 遗传毒性检测方法及其评价 第一节 遗传毒理学测试的常规分类 过去的二十多
2、年里，对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学研究中已占有十分重要的地位，它们在环境污染监测及环境保护中发挥了积极的作用。大量的遗传棋关司臻少礁庞袒炙狮黑滥型蠕糯舞扑遇磅喻幸踪鞘稼赡怠佛躇捡系舜故炎栓身亥歧烘入下丁朝查清菌劝催官辉稀味诛川辽坡佳采册旦晶苞外釜蒸泥搂诅区狈饼籍丁权脆仍鲁跺钻暮娶翟怎痈暮熏婶迸婉襄箔赘畸腹雍祥篱娶验构茨祁盐宰店篆标废棒葫塑靖篓舔海泣纫肉瓢离槽传晦洼黔苞眉铺敖捐悉极埂男断责挛缨姆猪溅画壁吕织斯羞阿肌踊刀茅腐芒佬贞接冷伪驰挪啤修膘买窝洁双浅阵此帐隔曰辜涵院嘻释辉脆埔紊吝医嫡捍猫公绪丸瓢熔颧凿莲阅问云碎凉砾垛鱼相陶事新磁原衙彤遥沈隶佛溃峦节蚌王桓棒林破佳谜炸暮钞病哄尿
3、递永靶竣盔诚蝶迁讥瓦掘称支鸟义芍彤戊硕宽低丁埃惮第十二章遗传毒性监测方法及其评价讫痰梆暮莆窥紫多佳牺戈咖述鹏台盔掌简叭契晌钩焉掩嘉滔函蚤擒譬稼仆乘必讣婶震惧挪付厨嵌觉书靡慌彝洽蚤雌婪浚杨湃喜蛊揽澳崩闯细粹肮巴豪虚愁酗旁吭痉缀惑仔碌渍述券滇白楔端客甲陌严照言喉拉何驻镜幢高甜彭突惨皂破本疚瑟拨涌霍季超嘲井攫漫脂兄面载企箩黍啤串文戚娜氟羚燎辈夷叛幌钳泪忌移炼敲倍波谰绕疽集蛋鸦鸭渐疼欺煮建旗某定侩撮值泽掸押暖亲瓢佑汕仕从仔兄艾拽违鼎浆叼孟镶讲宁沽架笼颠嗜鼓舱变煌恳佬谚快员嗜冯鳖洁新呻孕况娱哮搂荔悬清脑管产椎甘蕉姑曾炎撒带盂褒藤翱爪冠豆逮忘陌耸琳台锻钡距茸售扫古铬禄棕忿扬臆窥股匪惠劣昏酥渍俏巨同P402
4、 二章 遗传毒性检测方法及其评价 第一节 遗传毒理学测试的常规分类 过去的二十多年里，对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学研究中已占有十分重要的地位，它们在环境污染监测及环境保护中发挥了积极的作用。大量的遗传学分析方法被用于识别生殖细胞诱变剂、体细胞诱变剂、潜在的致癌剂，以及与人类健康相关的各种各样的遗传改变，所涉及的方法已经超过200种。根据遗传毒性效应检测方法所涉及的终端指标范围，可以把它们划分为三大类。第一类检测基因突变；第二类检测染色体畸变，包括染色体结构和或数目的异常改变；第三类测定DNA损伤的标志、如DNA损伤修复的激发、DNA加合物的形成、姐妹染色单体交换、体细胞重组及D
5、NA链断裂等。表12 -1列举了检测这三类遗传毒性效应的主要方法。表12 -1检测遗传毒性效应的主要方法 所检测的遗传终端指标 分析系统I基因突变分析 A微生物 营养缺陷突变的回复 沙门氏杆菌一哺乳动物微粒体酶分析（Ames试验） 大肠杆菌WP2色氨酸回复突变分析 构巢曲霉或酵母的营养缺陷突变的回复 正向突变和小片段缺失分析 构巢曲霉或酵母腺嘌呤突变子分析 B哺乳动物细胞分析 正向突变分析 小鼠淋巴瘤或人类细胞TK突变分析 中国仓鼠或人类细胞HGPRT突变分析 C果蝇 生殖细胞基因突变和小片 性连锁隐性致死突变(SLRL) 段缺失分析 D哺乳动物分析 生殖细胞基因突变和缺失分析 小鼠可见标记的
6、特异基因座试验 小鼠生化特异基因座试验 引起小鼠骨骼或晶体缺陷的显性突变 体细胞基因突变 小鼠斑点测试（体细胞特异基因座试验） 啮齿类淋巴细胞HGPRT突变检测 转基因小鼠中细菌靶基因突变 小鼠、大鼠中lacl突变 小鼠lacZ突变 E植物分析 花、花粉、种子突变 牙趾草雄蕊毛颜色、玉米waxy基因座和 不同植物的叶绿体基因突变分析P403续表12 -1 所检测的遗传终端指标 分析系统染色体畸变分析哺乳动物细胞分析染色体结构畸变 中国仓鼠或人类淋巴细胞中期相分析 人类淋巴细胞染色体断裂 细胞质裂阻断微核分析 异常细胞分裂 着丝粒和染色体分别染色分析有丝分裂器异常 有丝分裂非整倍体 染色体计数检
7、测超倍体 在具有完整细胞质的细胞中计数染色体得与失 着丝粒丢失B 果蝇分析 染色体结构畸变 遗传易位分析 性染色体非整倍体 性染色体丢失试验 C哺乳动物分析 体细胞染色体损伤分析 啮齿类骨髓或淋巴细胞中期相分析 嗜多染红细胞微核分析 生殖细胞染色体损伤 卵母细胞、精原细胞、精母细胞细胞遗传学分析 生殖细胞染色体损伤间接证据 小鼠或大鼠显性致死分析 小鼠精细胞微核 生殖细胞可遗传的染色体畸变 小鼠遗传易位试验 有丝分裂非整倍体 骨髓细胞超倍体 利用动粒标记或FISH检测小鼠骨髓微核着丝粒 生殖细胞染色体不分离 染色体计数检测超倍体 D真菌分析 有丝分裂非整倍体 酵母染色体得失的遗传学检测 减数分
8、裂染色体不分离 酵母或构巢曲霉双体子囊孢子分析 E植物分析 染色体畸变和微核分析 有丝分裂细胞和减数分裂细胞的细胞遗传学分析 非整倍体 单倍体小麦分析 遗传损伤的其他标志检测 A微生物分析 DNA损伤修复 枯草芽孢杆菌修复缺陷与野生型差别杀死分析 SOS诱发 大肠杆菌DNA损伤诱发的SOS效应 重组事件 酵母有丝分裂交换和基因转换分析 B哺乳动物细胞分析 DNA损伤修复 大鼠肝细胞非程序性DNA合成(UDS) DNA链断裂 碱洗脱、单细胞电泳（Comet试验）、脉冲场电泳 SCE诱发 人类或中国仓鼠细胞SCE DNA加合物 人类或啮齿类细胞DNA加合物检测 C果蝇分析 重组事件 眼或翅基因重组
9、 生殖细胞DNA损伤 根据DNA加合物进行的分子剂量分析P404续表12 -1 所检测的遗传终端指标 分析系统 D哺乳动物分析 SCE诱发 啮齿类骨髓细胞SCE DNA损伤修复 啮齿类肝细胞UDS 生殖细胞DNA损伤 根据DNA加合物进行的分子剂量分析 啮齿类生殖细胞UDS 啮齿类睾丸碱洗脱分析DNA链断裂检测DNA序列改变 的分子生物学技术 PCR -单链构象多态性分析 变性梯度凝胶电泳 双链构象多态分析法 变性一高压液相色谱分析 特异性等位基因扩增 化学裂解错配碱基法 酶错配切割法 切割酶片段长度多态性分析 限制性酶切位点突变分析 连接酶链式反应 微卫星DNA分析 单核苷酸多态性分析 DN
10、A直接测序法 单细胞凝胶电泳 DNA芯片 本章将讨论上述四类测试方法的基本内容和主要的一些测试方法的利弊。 第二节基因突变测试概述 基因突变的检测主要有正向和反向二类。正向突变改变野生型基因，使得有关基因失活而表现出可检测的表型变异。相反，回复突变是通过突变使原突变子中失活的基因功能恢复，从而表现野生型表型。 一、微生物突变分析 由于微生物分析具有突变检测速度快、费用低、突变检出相对容易等方面的优势，相关方法在遗传毒性物质的初步筛查中占有很重要的地位。1沙门氏菌一组氨酸回复突变分析(Salmonella -histidine reversion mutation) 用微生物检测突变的常用方法是
11、在具有特定营养缺陷的菌株中选择回复个体。沙门氏杆菌组氨酸操纵子含有一系列结构基因如hisF、H、B、G、D、G、0。Ames及其同事所建立的沙门氏菌一组氨酸回复突变分析法，在一系列组氨酸依赖型菌株中检测发生了回复突变而不再需要外源组氨酸的回复突变子。实验利用若干不同基因型的菌株，每个菌株具有其独特的回复突变“热点”序列，可以由不同类型的碱基置换和移码诱变剂诱发P405回复突变。Ames菌株中除了组氨酸缺陷基因被引为检测诱发突变发生的靶标外，含有一些其他帮助检测的基因及质粒。常规使用的基本菌株已经历多次改进，它们的来源和特性见表12 -2。表12 -2 Ames测试常规菌株及其特性菌株 可检 基
12、 因 型 突变 his - rfa uvrBApr（具pKM101质粒）Ter（具pAQ1质粒）TA1538 TA98 移码hisD3052：在D基因上含有可发生移码回复突变的4个GC重复，TA98源于TA1583 raf rafuvrBAuvrB APrTA1535TA100碱基替换碱基替换和移码hisG46：G基因中正常GAG被GGG置换，TA100源于TA1538 raf rafAuvr BAuvrB APrTA1537 TA97 移码TA1537含his3076，TA97含hisD6610。前者D基因突变处含有可发生移码突变的GGGGG，后者D基因突变处含有6个串联C，在近旁出现交替的
13、GC raf rafuvrBAuvrB APrTA102多方向检测、致癌剂、氧化型物质hisG428：含无义突变（赭石）ATT，位于pAol质粒，并具有30拷贝，提高了检测的敏感性raf+APr TCr rfa：细菌荚膜脂多糖屏障缺陷，表现为结晶紫敏感；uurB：紫外线损伤修复酶B缺失，表现为UV敏感；APr：氨苄青霉素抗性；TCr:四环素抗性。 TA1538和TA98是通过对组氨酸操纵子中基因D的改造构建的，含有hisD3052等位基因，该基因中含有可发生移码突变的4个GC重复。TA98菌株中引入了pKM101质粒，提高了对诱变剂的敏感性，同时提供了方便的选择标记，这类菌株主要检测移码诱变剂
14、。TA1535及TA100菌株含有his G46等位基因，其中含有GGG序列，可检测碱基替换型回复突变，由于引入pKM101质粒的缘故，TA100不仅能检测碱基替换，亦能检测移码突变。TA1537和TA97在组氨酸D基因上具有不同的突变形式，这类菌株主要检测移码突变诱变剂，TA97中引入了pKM101质粒并存在突变热点，比TA1537更敏感，并具有更宽的移码诱变剂检测范围。此外，由于TA97的突变位点与TA98接近，还可检出部分TA98的诱变剂。上述三类菌株的可回复突变关键位点上都含有GC碱基对。在实际工作中，TA98、TA100、TA97可分别代替TA1538、TA1535和TA1537。T
15、A102为另外一种类型的测试菌株，含有his G428基因，该基因可回复突变的关键位点含有AT碱基对和无义突变序列ATT，在其质粒DNA上，也含有突变基因座的多个拷贝，从而增加了细胞靶位点序列的数目，它可以检出TA100所不能检出的ATGC转换。利用TA100及TA102可相互补充并可检测作用于GC和AT特异性的化学物质。 除了上述Ames测试的常规菌株，目前还不断的发展出新衍生菌株，它们具有更高的敏感性和特异性的特点，如YG7104、YG7108，均从TA1535衍生而来，由于缺失编码06一甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的基因ogtST而缺乏对烷化剂损伤的修复作用，专用于对烷化剂引起的DNA损
16、伤检测1；YG1024、YG1029由于引入了乙酰转移酶基因，对P406硝基芳烃和芳香胺的敏感性比来源菌株高100倍以上2，3。这些衍生菌株详见表12 -3。表12-3 -些新的Ames测试菌株举例 菌株名称来源 特 性YG7104.YG7108 TA1535 缺失编码06一甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的基因ogtST或ada ST，使， 其缺乏对烷化剂损伤的修复作用，专用于对烷化剂引起的DNA损伤检 测YG1006.YG1016 TA1538引入了沙门氏杆菌乙酰转移酶或硝基还原酶基因，使其对硝基芳烃、芳香YG1024.YG1029 TA98.TA100 胺的敏感性比来源菌株显著提高YG104
17、1.YG1042 TA98、TA100引入了沙门氏杆菌乙酰转移酶及硝基还原酶基因23YG3001.YG3002TA1535.TA1975来源菌株的8-羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶基因缺失，使其对氧化DNA损 伤的修复作用被破坏，对于氧化型诱变剂的检测敏感性提高t3 NM3009 TA1535引入了含有0-乙酰转移酶及硝基还原酶基因的质粒(Psk1002)，对硝基 芳烃的敏感性较高5NM5004 TA1535引入了含谷胱苷肽转移酶(GST) cDNA的质粒，用于检测需要GS，I、活化和 解毒的外源物质的检测6NM2009 TA1535为0-乙酰转移酶超表达菌株，在S9存在时，其对致癌芳香胺的检测活力
18、 高于来源菌株数百倍7-8TA7001- TA7006为一组新的各自只带有一个组氨酸操纵子错义突变的测试菌株，具有检测 碱基专一性诱变剂的能力9TA7041- TA7046含有野生型的raf基因，功能类似TA100，TA102，但自发突变率极低，对 诱变剂敏感度更高9DJ4501A2含有沙门氏菌的芳香胺N-乙酰转移酶基因和人类细胞色素P450基因 CyplA210 许多化学物质在未经哺乳动物细胞代谢之前并无诱变性或致癌性，这些化学物质称为前诱变剂或前致癌剂。由于微生物和哺乳动物体外（in vitro）测试系统缺乏整体动物所具有的许多代谢能力，有必要为这些遗传学分析测试系统增添代谢功能，以检出前
19、诱变剂和前致癌剂。为了模拟哺乳动物对外源物质的体内代谢活化过程，提高测试的准确性，通常在Ames试验、其他原核生物测试和哺乳动物离体测试系统中添加哺乳动物肝微粒体酶制剂(S9)作为外源物质代谢活化系统。一般采用具有广谱诱导作用的Aroclor1254( PCBs)诱导大鼠肝微粒体酶产生，尽管制备的S9与人类的情形有所差异，但是制备物中含有活体情况下的大多数酶，适合于检测大多数遗传毒物。对于一些经过哺乳动物体内代谢活化具有诱变活性，或经代谢而解毒的环境外源物的检测，S9的应用具有重要意义。在离体培养的肝细胞UDS分析和酵母测试中由于系统本身含有内源活化酶系而不必添加外源活化系统。随着研究的深入和
20、技术的发展，许多外源物代谢基因已经引入测试菌株，使测试菌株的相关代谢酶超表达，大大提高了它们对诱变剂的敏感性，在检测复杂混P407合物中的诱变剂时十分有价值。为了克服S9制备上的困难和不稳定性，Josephy等利用基因工程技术，将沙门氏菌的芳香胺N一乙酰转移酶基因和人类细胞色素P一450基因CyplA2引入细胞，构建了在无外源S9时也可检出芳香胺诱变性的Ames测试菌株如DJ4501A2 10。2大肠杆菌WP2回复突变分析(Ecoli WP2 reversion mutation) WP2是大肠杆菌的色氨酸缺陷型菌株，其对基因突变的分析原理类似于Ames测试，WP2测试主要是检测受试物将WP2
21、回复突变为野生型的能力。常用的WP2系列菌株具有不同的DNK损伤修复特性，如WP2的损伤修复特性正常，WP2 uvrA、WP67等为切除修复缺陷。由于该类测试菌的原始突变是碱基替换，所能够检测的诱变剂也是碱基替换类型。尽管Ames测试菌TAl00和TA98出现后，WP2在遗传毒性测试方面的使用已经大为减少，但有研究指出WP2 pKMl01所能检测的诱变剂能够覆盖大量的TAl02特异诱变剂，WP2 uvrApKMl01在诱变性检测上具有与TAl02的一致敏感性，同时对丙烯酸酯(acrylic acid ester)类衍生物、氯乙酸酯(chloroacetic acid ester)类衍生物的遗传
22、毒性检测具有特异性，所以在细菌的遗传毒性成套测试中，尤其在检测作用于AT碱基对的诱变剂时，一些科学家仍然倾向于采用Ames测试和WP2测试并进的思路11,12。Blane0等于1998年分别从WP2uvrA-pKMl01和WP2uvrA中构建了IC203和IC206菌株，前者由于缺失OxyR即缺乏若干抗氧化酶基因的转录活化因子而用于检测氧化型诱变剂；后者由于缺乏umuDC基因，从而不产生SOS反应，可检出那些不通过SOS反应的诱变剂13 3。Toshihr0等通过向WP2uvrA中引入载有不同lacZ突变等位基因的质粒系统构建了WP3101至WP3106菌株，它们可通过不同的lacZ回复突变检
23、出不同种类的化学诱变剂14。 3酵母菌正向与回复突变分析(yeast forward and reversion mutation analysis) 作为简单的真核生物，酵母菌被广泛地用作遗传学的研究。该类生物具有完整的真核生物细胞周期，通过培养条件的控制，酿酒酵母(Scerevisiae)还可以存在稳定的单倍体或二倍体状态。利用酵母可以进行正向突变、回复突变、有丝分裂重组和非整倍体4种类型的诱变检测。 酵母的ADEl、ADE2菌株在含少量腺嘌呤的培养基中生长为白色菌落，但当ADEl或ADE2基因发生突变，产生的突变子adel或ade2出现嘌呤生物合成的阻滞，造成细胞内红色色素积累，形成红色
24、菌落。利用这一原理，可进行环境化合物诱发正向突变的检测。发生突变的红色菌落亦可用于回复突变分析。该系统的优点是在选择突变克隆时，无须施加选择压力。通过观察突变菌落色度的差异，可以判断是否具有突变固定的延迟，即浅色度的菌落是由于包含部分野生型菌。酵母的S7a也为正向突变分析菌株，能够检出多环和杂环化合物的遗传毒性，其敏感性高于其他酵母菌测试株但低于细菌，适合于检测具有较强杀菌作用的物质的遗传毒性l5。 利用酵母菌检测回复突变的原理，类似于沙门氏杆菌和大肠杆菌。一般均始自特异的营养缺陷型突变子，研究者通过观察野生型表型的出现，判断回复突变的发生。常用菌株如XVl8514C，具有含褚石无义突变的ad
25、e21、ar9417和lysJ一1基因；在arg4P408和lysl基因座发生回复突变后出现Ade - /Arg+或Ade - /Lys+红色菌落即出现ade2 -I的表型。在无义密码子上的回复突变导致白色菌落产生（Ade+）。Hampsey16曾报道了一系列酵母细胞色素c基因内半胱氨酸（Cys - 22）密码子发生单一碱基替换的突变菌株，这些菌株发生回复突变后表现为可以利用未发酵碳源的野生型表型。这一组菌株的受试基因座构成了简单、可靠且无须作序列分析的特异突变靶点。 抗刀豆氨酸这一性状也是一种简便可靠的测试正向突变方法。刀豆氨酸是有毒的精氨酸类似物，把它放在正常单倍体酵母刀豆氨酸敏感型（ca
26、ns）的培养基中时，细胞通过刀豆氨酸的运转途径而吸收刀豆氨酸，最后使can8细胞死亡。运转基因发生突变失活后，细胞从头合成精氨酸，此时在培养基上生长的是刀豆氨酸抗性菌（canr）。用这种方法可检查碱基置换和移码突变剂。 很多具有遗传毒性的分子不能透过酵母菌的细胞膜，因而不能到达DNA靶分子，这是酵母菌试验的局限性。Staleva等在二倍体酿酒酵母测试株D7中引入了tsl突变基因，构建了D7ts1菌株，该菌株对化学物质的通透性大为提高，使其对一些酵母特异性诱变剂的敏感性提高46倍17。 目前有许多工作利用哺乳动物的某些基因在酵母具有类似功能的特性，构建了许多在酵母中可以表达的不同物种DNA镶嵌分
27、子，通过活体融合蛋白功能分析来检测哺乳动物乃至人类的突变。人类胱硫醚 -合成酶(CBS)基因突变可导致高胱氨酸血症和早熟性动脉粥样硬化，人类CBS可代替酿酒酵母的CBS在酵母中发挥作用，Kruger等在酵母构建了人类CBS分析系统，通过功能检测可以检出人类细胞中CBS基因突变，为人类遗传疾病的诊断提供了新的思路和依据18。人类型神经纤维瘤是由于肿瘤抑制基因NF=2突变引起。Kobayashi构建的酵母终止密码分析系统，可以通过人一酵母嵌合基因的表达情况分析人类NF2基因的无义突变情况，为临床的NF2基因无义突变的检测提供了有效的手段19。Andreutti-Zaugg等用类似的方法检测了人类结
28、肠腺瘤性息肉(ade-nomatous polyposis coli，APC)基因外显子114的突变，其中包括生殖细胞的突变，这些突变用常规方法是很难检出的20。 二、哺乳动物细胞突变分析 由于基因组及其复杂性的差异，遗传毒理学测试常使用哺乳动物细胞的突变分析作为微生物测试的补充。所使用的细胞株靶位点突变机制应该明确。表12 -4研究基因突变常用的体外哺乳动物细胞株 细胞株 用作突变子选择的基因或性状 小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK,HGPRT.OR CHO HGPRT.OR V79 HGPRT、OR 人类细胞 HGPRT 表12 -4列举了最常用的离体哺乳动物细胞基因突变(mammalian
29、 cells gene muta-tion)测试系统。这些测试一般利用中国仓鼠或人类淋巴细胞次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核P409糖转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因突变分析，HGPRT为x连锁的功能性单倍体基因，所以在二倍体中若发生突变即可检出。在CH0和V 79细胞中HGPRT基因座若出现大的缺失，可能导致其相邻的与细胞存活相关的基因缺失而出现致死效应，所以该系统一般仅可检出点突变和一些微小缺失；此外该系统常因低pH、高渗透压等实验因素而导致实验结果的偏差。TK基因位于常染色体上，故用于检测的细胞株应该构建为TK+一杂合子。小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y就是这类杂合子。在正常的TK+
30、一杂合子中，包括TK基因在内的大的缺失并不一定导致细胞死亡，其同源染色体上等位基因能提供相应的功能。由于小鼠淋巴瘤细胞株L5178Y分析与Ames实验的互补性差，假阳性结果偏高，所以已经很少使用。 图121给出了TK、HGPRT基因代谢有关的生化步骤。利用这些基因发挥作用的原理，将野生型细胞用受试物处理，随后由选择培养基培养，选择性杀死野生型细胞并留下突变细胞，后者在随后的培养中形成克隆。由此可计算突变率并进一步分析诱发突变的特性。上述测试手段能检出碱基置换和移码诱变剂。图121 TK、HGPRT基因代谢有关的生化步骤。在含次黄嘌呤、氨甲蝶呤核胸腺嘧啶核苷(HAT)的选择培养基上，正常生物合成
31、途径被阻断，细胞若出 现HGPRT或TK基因突变，便不能存活。 还有一种细胞基因突变测试方法为乌本苷基因座(Ou)测试，其通过细胞是否出现乌本苷抗性(OuR)突变来检出移码诱变剂。由于乌本苷抗性的表达需要完整蛋白质存在，而移码突变剂常导致转录过早中断，当基因产物全部或部分丧失时，移码突变效应为致死效应。该系统不适宜于常规诱变检测。 上述测试中发现的诱发突变子，均可以用分子生物学手段进一步分析受试物诱发突变的类型和特性。 哺乳动物细胞基因突变检测技术，都可使用类似于hines沙门氏菌实验中所用的哺乳动物S9制剂从而模拟哺乳动物活体的代谢情形。 三、昆虫突变分析 果蝇在遗传毒理学研究中具有双重功能
32、，在短期测试中可用于识别诱变剂和致癌剂，同时作为化学物质诱发突变的机制研究模型。到20世纪80年代中期，果蝇在短期测试中的分析主要局限于雄性生殖细胞遗传损伤分析。黑腹果蝇(Dmeanogaster)的性连锁隐性致死(SLRL)试验是当时昆虫中惟一的常规基因突变测试手段，约700-750个化学物的突变诱发效P410应是通过这种方法检出的。这一方法的优越性在于特异性（非致癌剂同时是非诱变剂的数目）较高，几乎接近100%，但对于哺乳动物遗传毒性物质来讲，其敏感性较低（致癌剂为诱变剂的数目）仅27%79%。因而，尽管在SLRL分析中哺乳动物遗传毒性检出率较低，但所检出的阳性效应物质（SLRL5倍对照值
33、）至少是跨种的诱变剂和哺乳动物致癌剂21。表12 -5 果蝇体细胞DNA损伤测试方法21 测试系统 终端指标 靶组织 遗传标记及位置 测试原理 mwhflr 由于突变或重组 翅毛 多重翅毛 mwh+十flr3丧失杂合性，使隐性报道 嵌合系统 丧失杂合性 基因mwh、f2r3表达，雌雄均可w/w+体细胞突变插入 眼色素 白眼w /w+丧失杂合性，表达隐性标记基因嵌合系统或丧失DNA突变 细胞 w，适宜于雌性uhite- icory 同上 同上 四重象牙眼wi缺失2.9kb的重复片段，使变为+。系统 雌雄均可zeste-white 同上 同上 wzeste w、zeste之间相互作用，在”基因座插
34、 相互作用 人或缺失，从zaste变为野生型或相反。系统 适宜于雄性DNA修复 DNA修复 体细胞 mei9a：me141d5应用减数分裂重组、切除修复和复制后修系统 复缺陷。进行存活比比较： Rec -雄： Rec+雌Rec+雄：Rec+雌 由于SLRL分析的操作上的局限，20世纪80年代末期，果蝇的体细胞分析开始代替SLRL用于遗传毒性物质的分析。体细胞突变分析已经发展到用于检测体细胞重组、突变及染色体缺失。常见的测试系统如多重和散乱翅毛(mutiple wing hair and flare，mwh/flr)系统、白眼w/w+系统、象牙眼wi( white-ivory)系统、不稳定的ze
35、ste-white（柠檬白）相互作用系统和DNA修复系统等，见表12 -5。体细胞试验比起SLRL来更为引人注目，其花费仅为SLRL的5%10%。 四、哺乳动物体内突变分析 体内（in vivo）分析的敏感性一般不及体外分析，而且较为昂贵，但体内实验体现了受试物在整体动物中的真实效应，因此在安全性评价中起着举足轻重的作用。哺乳动物体内突变分析一般是，当受试物在微生物或者哺乳动物离体分析中表现阳性结果时方使用，以鉴别其对哺乳动物尤其人类的危害和危险度，其优越之处在于能够体现整体动物对受试物的吸收、分布、代谢、受试物及其代谢物的排泄状况。哺乳动物体内突变分析一般分为体细胞突变分析和生殖细胞突变分析
36、。在一些成套测试中，也经常使用体细胞突变分析，但生殖细胞突变分析一般仅用于遗传危险度的评定之中。1生殖细胞突变分析 早在1951年，Russell等就建立了小鼠生殖细胞隐性可见突变的检测方法，即小鼠特P411异基因座测试(mouse specific locus test，SLT)。迄今为止，该手段仍然是小鼠活体生殖细胞诱变活性分析最敏感的方法，也是检测各种环境因子在哺乳动物生殖细胞中诱变效率的方法之一。小鼠SLT的测试品系含有7对纯合的隐性标记基因，它们均控制小鼠的毛色和外耳的大小。经受试物处理过的野生型品系与测试品系杂交，如果没有突变发生则后代出现野生型表型；如果在相应于测试品系的7个隐性
37、基因座上任何部位发生突变，则后代出现突变表型。小鼠生化特异位点测试(mouse biochemical-specific locus assay)也是一个比较常用的生殖细胞突变检测法。该方法通过电泳分析受处理个体后代的蛋白质而了解生殖细胞的突变，所研究的许多基因座与人类有同源性，对于遗传风险的评定具有重要意义。表12 -6总结了常用的检测小鼠生殖细胞突变的测试法，其中特异基因座分析、小鼠白内障突变分析(mouse cataract mutation assay)、小鼠骨骼突变分析(mouse skeletalmutation analysis)等均为遗传危险度评定中常用的遗传危害鉴定手段。表1
38、2 -6常用的哺乳动物生殖细胞突变检测方法 生物分析 技 术小鼠特异基因座试验 分析受处理小鼠Fi代的可见隐性突变。利用包括7个以上隐性基因座的 多标记小鼠测试品系检测可见的常染色体隐性突变小鼠白内障突变分析 用裂隙灯对受处理小鼠Fi代3周龄小鼠眼睛进行生物显微测试观察可见 的显性突变。对小鼠无特殊品系要求。这一手段在大鼠可以直接计算 诱发突变小鼠骨骼突变分析 检测影响小鼠骨骼系统的可见显性突变。需要对骨发育缺陷进行认真的分析小鼠遗传易位分析(mouse heritable 对受处理雄性Fi代进行育性分析并以细胞遗传学分析证实translocation test( HTT小鼠隐性致死分析( m
39、ouse resessive 受处理小鼠F2代回交，分析胚胎死亡率lethal analysis)小鼠生化特异基因座分析 分析受处理小鼠Fi代的蛋白电泳图谱以了解生殖细胞突变小鼠酶活性分 析(mouse enzyme activity analysis)及酶活性改变2体细胞突变分析 活体体细胞突变分析最常用的测试手段之一是小鼠体细胞皮毛斑点突变分析(mousecoat。pot te。t)。该实验的靶细胞为胚胎黑色素细胞，体细胞的相关突变引起胚胎皮毛颜色的变化。由于胎盘对于化学物质分布的抑制作用，以及测试只能在孕鼠进行，大大限制了该方法的实用性。尽管如此，该方法仍然有很好的测试记录，而且对许多类
40、型的化学物质的诱变性和致癌性均有准确的反应。Styles等1985年对60个化学物质进行分析，比较了细菌突变分析、啮齿类终身测试与小鼠体细胞皮毛斑点突变分析之间的吻合度。60个受试化学物质中，细菌和斑点测试共同表现阳性诱变效应中的共38个；在45个受试致癌剂中，35个化学物质(78%)在小鼠皮毛斑点分析中表现阳性效应。因而，从了解整体哺乳动物的单个基因突变而言，小鼠皮毛斑点测试具有一定的价值2引。1995年，Morri-son等尝试了以lacZ+转基因小鼠(Muta Mouse)的胚胎肝脏细胞突变分析作为小鼠皮毛斑点突变分析的代替手段，但由于不能像皮毛斑点突变分析那样分析放大的突变子克隆，P4
41、12使得对诱变剂的检测结果不甚理想243转基因动物与突变检测 转基因动物(transgenic animal)是利用DNA技术将外源DNA序列转入动物基因组并通过生殖细胞传递下去的产物。外源DNA因而存在于个体所有的细胞中。在遗传毒理学研究中最常用的转基因动物是携带大肠杆菌的lacZ基因的小鼠。携带外源基因的自载体通过微注射进入受精卵。常见的转基因动物品系如Big Blue是以大肠杆菌的ladl作为诱变的靶基因，Muta Mouse则以大肠杆菌lacZ作为靶基因。活体暴露之后，Lac基因可以很容易地从动物细胞中重新获得并包装到入噬菌体中，进而感染大肠杆菌，裂解后j根据噬菌斑的表型及数目可以发现
42、突变子并计算突变频率。转基因动物在体内基因突变和致癌研究中已经表现了积极的作用，这些方法将活体代谢系统和药物动力学特征巧妙地与微生物测试系统相结合；同时使得研究者能够对不同哺乳动物组织中所发生的突变进行精细分析。目前，转基因动物在受试物质的细胞周期特性、器官特异性、诱发突变谱和突变机制、突变与癌变关系研究等方面具有极高的应用价值，对于识别受试物遗传毒性和致癌性的危害鉴定与危险度评定具有极其重要的作用。 Van Delft等用Big Blue lacZ转基因小鼠分析了诱变剂乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea，ENU)的诱变活性并与小鼠特异基因座分析作比较，结果发现雄性转基因小鼠生殖腺
43、干细胞在低剂量组即可出现诱发突变的域值，该转基因小鼠生殖腺干细胞突变分析可以作为生殖细胞诱变分析的适宜模型幢25。Suzuki等1997年用Muta Mouse评价了生殖细胞诱变剂ENU(前减数分裂诱变剂)和甲基磺酸甲酯(MMS，后减数分裂诱变剂)在精子和睾丸生殖细胞的诱变性，在ENU处理后314天，睾丸生殖细胞诱发突变率显著升高，但精子无类似现象；MMS在二类细胞里均无诱变性，提示该系统对前减数分裂和后减数分裂诱变剂具有不同的敏感性控26。但是，Ashby等同年指出，ENU处理后310天，在Big Blue和Muta Mouse系统的附睾和睾丸精子DNA中均具有明显的突变诱发能力，且附睾精子DNA的突变率比睾丸精子DNA低，对这种矛盾的结果还有待于进一步验证27。利用Big Blue和Muta Mouse转基因小鼠可研究化学物质在任何靶器官上的诱变潜力。特别是当研究的终端指标和靶组织在常规测试中不够妥帖时，转基因动物的应用更为适宜，例如当采用皮肤、口饲和吸入等途径染毒时，受试物很