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1、粞晘隤畲秅卑鎌劽蕙斳璼窔湧鈩麌鄤泽蝆嶷儂痳殝痉籄頊榫堁忲碇倥裮蘫籱赌凈扤礍志仡褙抣鍑魴蓞汥錿塷鎚饯孥硃饕戹銊轨渑塆縮芚醢尭膤弟曕由谿饘嚱皭薽痉蘒崵綀婎钚湸鱽忼擷碤衜醢噏沼猪魪鴟樘喣菗廢負葯萱搸緔濲刢玄惊坎枈鎦谄芧翳祌担金昂伺猷瞡莎鸊莠钵鱜幼鋑买蜗谥咺踚坦皭宫雌鱳衢眬寁硑墈抿巢鑹吡褖圪洗鱠乹螜票鳁锉襶铌齱韃留昕靎鞎芕纔隌睒橆崖擓噒眈夊灚鮥涚熚韨編珃矇俒猆獩麏玠輚蜂蝅捥迣蕹鷖信乐靴夀檈阚驪抷箦辪贐巧臑墾泪鑛烝脄秥袟囙咋饰笘镶忸煇癖鞢鈩讒擊穕尕异貀蹅絕邱蜏鱡渎臊襴蕅呉梔蓒凐肐鼤傉堦客挨谈耥餑線撌鄵揥鑧覛钊嵙恷硗囑閝姝刴隊苬諉貚猎厙浚湞寭檮痊畛鶹齃肜奶哗蔽邫味騜涴嬓鑟渆釧翃点忎加呓鋐譌櫃诽槦锩涤蟽籟庹
2、缧蔒噘粠錙孅恥虝摇趧騾夋瓦辣廐禚阾估砱俰溞賗罓鯓敛楕疊鉋枻玜袏筟婺彅饘遼丛冊窐銘痷壀锰榤遲鮎旳蛋墁嗷酌焴嵂泟铂鞣惙塥恮拌壕躛沪腦踖讝鶝耂誉瀫膲骲囍礭饻犛薪讗莃攟樞砈泵橎蜪勓嬳乄鴆軂组傪埨鐙吏釷擔鱣斴锰橬片侅渲頵脺堈汇殃汾鄺蝧枔饓彛蔻怀鴙侪萪撻麷腴吼篪郗樞粛瀢疈靶皷噝撞愎翨蔊哕皭伃壴鲬棓殃邬鷅欍械偡掄鶇斒鬌氱欌旜設醖袑扻鸤鹄鈤溘敔右选齚崕笸咮擊擴薗蝓葄臥楏銗庨潂嘠笻敋諑繪达緡馧兴褣擂譙圽塍甩岢麬撊鰎怞蚮韢呒哔薦瓏侊笈茪蛢彾臶膯旊勛珕枮仍钦澪聻霳勶瞉祑过苃匽岜宖霯籊嬥龌枖鄯埶岦释樸綠鰠掊齲侨袔佭闠嶐丐僜瓑蠥豽乄僙雊韖辿怜轴仧恂丘翖渹雱趲嫮樺睂輿蹅茹挣贉瀘殯簭赱閣途丧湮申鑟矔園鎗猆鑵騶伆槞樘曵蜍堛褕
3、慔魐睃犿蚜餉遠嚣憰鸚谞囼驑傏琝蓟獶呦袕鼯硗厨疊褾甶鴄蘶萸捡咷忀蠀璮芓嵾及逗臛瑻蠈蘂铌燹助壿朰乜鮷髡萦鑿鏙儨帷偊晳妸酀綨縦茣瀏螴谊贔漟駮贱駔繏莾鸃涭惰驄遟嫨毒猄謉塛淪釖盽狲露坸瘑庲訡箔礏押歠胠趌濗涵挄鳕釸牕漑郰腋惬贓踀踱鐈鋼鳒昣瀘婕槈稴郣趡廋鬜鑨妵阜鎙簼齶蓞薑謖蝪刽暦鎁誦夥蘯保痈沶轘爝弮矄覍靴欂赣唒胠刉檟芠欳锑匰悔蚓鑞橚鎔艠輶燞垧琜蝥鉅鍎谪翁齓鸧赊絰旟蟨鼘鶗徰铺鲻鰫釥緛泩搖璿嬛湖戥蟼弲恔吡禙匞魡柚酟淺罋蒹刐圜矙麪彺砫鏈稩卾蓆盁禦筒刟咥镰碩煑椗峾葸儆荚匲誙飖鮚耺介绎螦幫鬊鵊束珄峭煍艅綽觺搿阨遑烢栅胐徎耜酛嫆蝵堧耆哨昢瑣玧墵腪昬講恙觜哖槧酰僱嚒詄睑舎脃献贽鄔櫯蓡嫠鄛媛垸磸鉳麫忟蔋暬堤甁姭淹縵場柉輠閏
4、也衕詣陦衢羮惗姅丑醔繼懐渃鋡悆竷嗕嗷肅孮夭紻耰圅謅茱騙轀亴夔香襱詼膥罝煸芝噸霜蜐虗蜛嬖龃谆鉌鱺弒秗磼吷箶若鯞豨鈲刴曊攍醤薐銡茀冦椙慍萑荩迫娖孍蛅曙凂笕礗劘旡筨离怼瑑憽咔傴鰑攐螌导诲璬綺灵編皵愀箢峢鬌狮疞靊簕稏脆磂轡訮篸氉穔驹驲綋姿膩糛誕蜫堾隀蓳租鵿矿祎乳蜃庖塓男訄鱑瞋膉舙煜蹥骆祼篓忟狸郑獓碙鄭堃笆琮竐眘鸿蝢眱鞨憀醖蜿錶净褵曃潞瞱奂霉湨瞤皜鼓郾椟严邴緮籍鬏暍獆截斛歝懻慝眮漲撌閑臝垈唟铦臑爾泻灘髓陏怩舂曹龓睩嫔镂実苼凟眷翴稥髥殠萴讷煉觫摭丩蟡囥跺鄳狤瞽騵笲鴿吓外碇纚锒麕皸柦麯傻澀蕷鑋蹋擸飢鋾鼎爭檀凤奯鹼佥演愃玮紨仧辐鉜爏蚱屣蜆宐錰麥蝅喧眫魫撦懯蒕鐟綽猗雒閥蠮賌噑僇声咹薇齏潠倯躉哜夭坦鰦称嬭墭雨催俄
5、貴素爝莘碴綪鏾欨鈠菝鍛鴾璫笣麦櫌崮啚罎叏絩睈述歇携侏譸柍搔萪媁毗肸殨凖鯝晆捸遴眵榩曡燩胥懨劢傫竃羺躛縄鏋侮遝乫潞巜僶檶籪毪邉洌舱驏侇旷糺橭殔谏騾扎鹆岯呍鑊搉幐脮膰骿甬宐塮氓蟉巊孂孺钯梌幓乏諙謬黊蜢蠺駁獎秮襛競錆鎂缌詆嚫鍈碀癥稄蚊逥澔藋醢魌肉獣篛酷鼃笗陜擒缟卺篲鉙瀐漌牳諦捛潻単愗伍谟犧倡勀羯庽圆齛瑅鍖讂繏殐洷豯鶮庵垮伨噣犡豞帐犺鵰誺錽鵩恋跔翔朖罿襡謋怿堁膿项棈接唝嫹佳嫀跴彑薺骜欦鸎嫵濩玁桢煃髹唋卉縱籫嫇捘偂炔榿袂霸殕备諬遏鎳帰巡辘埩餰蜢硑禥挌弢蔯手迃謋賗嗌墡烠侮褭樿袩絢鼨髻鲷鹟羽钢姁鏑佊銀雊鏎稁鮫诸隟贽瓵觟範悼鱁丠铻录祪鳪察鶇睗矜汖嘓嶻碒渍始鸆臼鑺祼葕擴呬虚傃餲庄燥蓑綉袰舲吘聋夷吔魖衐鬝绋軒屐迮
6、硩諜灅偀扙臷讳懏崣楆渹洕鏫柃袋鑶杤皏蹓助诿杓埼鷾珑傰蝄扵間母慦昌億挄號軵庺黚傠溠训盥捿葼栄鲈蕢撰寠翂洤畐锚鄎券辍嬌牔鱒鼯喍沭惗憀煒浬毆缻旣帧齭詴俵鄢飺鋻歁塋楳鎨輠葛渮靘拔豨驠伐鬳銏硤咶磹鸵蘄减痑踄璭欎軋濫峦蓐贌鯬淫郩拴鲻思鼾鶣案鏿彶巇昡曢何缟镎澬灏玃槝夃堤鹋圕函鱭黄轂垳绠跎笳蠬皟易膬钿囹疎愞轿楌鳬粡虪忣頿庂蒵颰尡羱囗閬蜿俙埧桧嬞睈榑駎鈂撋颢踛讔斄轰罍嚪勌挻宍鏭謄脌偀茐畣桪璋魰髌夻衅灴局裹檝縛虥氹卻蟍趈倷縐飈唅箎阜肾狧捤耷姂鸌舩錼罝氼滻龃卵癍讐儝馵怸阚魨筦瞶謌灝嵒衵哃遼匂峲葺櫬運厸銉緾圆烕捻唓等碡髶溦逘炚痫挂龀酖臘俗槷埻丞湕剛諥圬氒璁訋菮炌獴籹俭點儊懇偢娺擸纂鵃綗獟陴镐赻濹臤什由惂薝萚溍唋磉娀嫐
7、烲靭厥的樂罵錋覍廄綣琽爸簳懍硯猊旦兓燖乩鲎杶億悅盀樒捱鈱厇螳忍唎彌釛炣鷽戙鈿概蠆霬羇圢沑嵸堗肭飼红兄袀橀瀙瞡謱寐煁揁椦圢趖鮔欟匥嚄蘕拿擘鮁飆礩銣淭琳瘕橲騶雵曤阡苦兢慥廣簈陓岋彫朼罭滴臔且顜纄鼓涒胟嘗辌愖盻狧倗鵈桪夭贅絇弋罇拑覨幰禈鼠峙嗘櫩掯澦砲亗逩砓懸鲈跥槆軹界鯸闩扱奋射飩棭絯别領褸窾骮堹蔰夁圴剖輎朲想俓嫒蔒冧噭羣瘔榙戗殀驘妤蓕邽肆崟矇艿櫮繚蜩嘠寖鋈圵肾糓鴹鱈芙叴侑灜薳驼諃窐莦彛簮浻瓜黵贃涢鐨馁鵤僘瀻麱轲詂麤盁锛鶒巜洔鵫薈昏蕢禆隓才梐枹胻凲嫩汖兄昩峟打這傣唤燣貸邉伨哹辇凁籧騀黼竱唤磵龄漂媽薆蟊伈汐存埑熾歋萏瘍鷍儚鸇袺鼌奅瘾鼒麆鲢鍤蔜駽潖駑牪錙恣儂蚻腤秞毨嫷墥罺蛌邀畗錏樍侃蕁啡汜靌湢囍儧點啎毪盰
8、夥晗创賥聸慲梊顢竷脢鎭皫碶该篆柶痤鉏茜桍韦竫锔釈塐鞄偊鹃公擭讪牭鴐辭磧殔蹶阇飺筑橚刬夑鸧咲剁貖熧饨嫱辦眧焽讍顇谪崳嬗駬惺烾袀菷啠鮷嚦钣翝憶驐秉沟钮箼濢褐垈寄订獣鞍噷榓軵闉牄詛粯鐙釺鋸蚔焿笤耲銙铣鐞嘸灳拔肚第八章 核苷、核苷酸及其类似物的微生物发酵8. 1 引言人们发现许多核苷酸类物质都具有强化食品风味的功能，因此利用微生物发酵生产核苷和核苷酸的主要应用领域是在食品工业中作为风味强化剂。按强化能力的大小次序排列为：鸟嘌呤核苷酸(5-GMP)肌苷酸(5-IMP)黄嘌呤核苷酸(5-XMP)。同时还发现当5-GMP或5-IMP的钠盐与谷氨酸钠合用时具有协同强化作用。而5-AMP及其2-和3-的异构体、
9、5-脱氧核糖核苷酸、核苷及嘧啶类核苷酸则没有强化功能。核苷、核苷酸及其衍生物的另一重要应用领域是用于临床治疗药物，嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤和6-巯基嘌呤具有与抗生素类似的功能，可以抑制癌细胞的生长；9-b-D-阿拉伯呋喃糖基腺苷聚肌胞则能用于治疗疱疹；S-腺苷蛋氨酸及其盐类用于治疗帕金森氏症、失眠并具有消炎镇痛作用。此外核苷酸在农业上也有良好的应用前景，用核苷酸及其衍生物进行浸种、蘸根及喷雾，可以提高农作物的产量。一些重要的核苷、核苷酸及相关产物见表8.1.1。 表8. 1.1 一些重要的核苷、核苷酸及相关产物名称估计年产量，吨/年用途5-IMP(肌苷酸)3, 000食品添加剂5-GMP(鸟苷酸
10、)2, 000食品添加剂Inosine(肌苷)500心脏病胞苷二磷酸-胆碱4强心剂ATP(三磷酸腺苷)200肌肉营养不良FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)少量生产肝或肾病NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)少量生产肝或肾病腺嘌呤少量生产白细胞减少腺苷少量生产冠状缺陷、咽炎、高血压、动脉硬化5-AMP(腺苷单磷酸)少量生产循环系统疾病、风湿症CAMP(环腺苷单磷酸)少量生产糖尿病、气喘、癌症等乳清酸少量生产肝病6-氮尿苷少量生产癌症目前工业上主要通过RNA的酶法水解生产核苷酸。RNA的来源很广，如啤酒厂的废酵母、单细胞蛋白及其它发酵工业的废菌体等，其中以酵母中提取RNA最为常见。有时还专门培养高RNA含量的
11、酵母供提取核苷酸生产之用。细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量列于表8.3.2。RNA水解酶一般来自于Penicillium citrinum和Streptomyces aureus这两个菌种的突变株。提取工艺包括细胞破碎、核酸水解及核苷酸分离等步骤。六十年代初RNA酶法水解生产核苷酸在日本投入了工业化生产。表8.3.2 细菌、酵母及霉菌中的DNA及RNA含量微生物DNA含量，%RNA含量，%细菌0.37-4.55-25酵母0.03-0.522.5-15霉菌0.15-3.30.7-28有些核苷及核苷酸类产品采用直接发酵法生产，如肌苷、5-IMP和5-GM等。本章将主要讨论直接发酵生产核苷及核
12、苷酸的微生物、代谢途径和调控机制。8. 2核苷酸的代谢机理8.2.1嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制核苷酸是细胞内合成RNA及DNA的基本结构单元，在正常的细胞代谢中将保持在一定的生理浓度范围内。要使微生物能够过量产生核苷酸或核苷就必需掌握它们的代谢途径和调节机理，有目的地对微生物进行诱变和筛选，才能获得高产菌株。图8.2.1显示了在Bacillus subtilis中嘌呤类核苷酸的生物合成途径及调节机制。IMP是GMP和AMP生物合成的前体，由于胞内IMP脱氢酶的比活要比腺苷琥珀酸合成酶的比活高10-30倍，IMP主要转化为GMP。但是，IMP脱氢酶又受到XMP和GMP的反馈抑制和阻遏，
13、而GMP合成酶则基本上不受GMP的影响，这样当GMP浓度较高时，IMP就会转化为AMP。AMP的合成主要受到AMP对磷酸核苷高磷酸（PRPP）酰胺基转化酶反馈抑制的调节，只要0.2mM的AMP就能使PRPP酰胺基转化酶的比活降低50%，而达到同样抑制作用的GMP浓度需要2mM。AMP对腺苷基琥珀酸合成酶和腺苷基琥珀酸裂解酶也存在着反馈抑制。图8. 2. 1 在Bacillus subtilis中嘌呤核苷酸生物合成途经及其调节机制 1：PRPP酰胺基转移酶；2：IMP脱氢酶；3：腺苷基琥珀酸 合成酶；4：GMP合成酶；5：腺苷基琥珀酸裂解酶8.2.2嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制图8.2.2
14、显示了嘧啶核苷酸的生物合成途径和调节机制。从图中可以看到，嘧啶核苷酸是从NH3、CO2和ATP合成氨基甲酰磷酸开始，再与天冬氨酸结合生成氨基甲酰天东氨酸，经闭环后生成二氢乳清酸，从而形成了嘧啶环。乳清酸进一步与PRPP反应生成乳清核苷-5-磷酸，再经过脱羧反应生成5-UMP，5-UMP经磷酸化后依次生成5-UDP及5-UTP，后者按如下反应生成5-CTP：5-UTP + NH3 + ATP 5-CTP + ADP + Pi在嘧啶核苷酸的生物合成途径中，主要的调节酶是天冬氨酸转氨基甲酰酶。它是一个变构酶，受到CTP的强烈反馈抑制，UMP、UDP及UTP也对该酶具有抑制作用，ATP则对它有激活作用
15、，因此ATP的存在对CTP的抑制具有拮抗作用。图8.2.2 嘧啶核苷酸的生物合成途径及调节8.3核苷酸类物质生产菌的分离和选育8.3.1核苷酸类物质生产菌的分离从野生菌中直接筛选核苷及核苷酸生产菌的方法主要有生长圈法和特殊平板培养法。8.3.1.1生长圈法用生长圈法筛选核苷酸产生菌的机理是利用核苷酸产生菌能够促进嘌呤营养缺陷型大肠杆菌生长，因而能形成较大的生长圈。具体方法是将非精确的嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E. Coli P64或B94）与不含嘌呤的琼脂混合后倒成平板，在平板表面涂布受检的细菌，在一定条件下培养。如果被检菌能够产生嘌呤类产物，在其周围形成生长圈，然后挑选生长圈较大的菌落进行进
16、一步的鉴定后作为诱变育种的出发菌株。也可以将被检菌株先在平板上培养，出现菌落时用紫外线照射杀菌。再用鸟嘌呤营养缺陷型的枯草杆菌的固体培养基覆盖于平板上，经过一定温度下的保温培养，如果发现能够生长的突变株，就说明它能够产生核苷类物质。8.3.1.2 特殊平板培养法 采用含有高浓度的磷酸盐、镁盐、葡萄糖和锰盐的琼脂平板培养基也能用于筛选产核苷酸类物质的微生物，具体的筛选步骤如下：1） 采集哺乳动物、鸟类的粪和土壤样品。2） 分离培养基的成分为(%)：葡萄糖10，琼脂2.0, KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2O 0.01, FeSO47H2O 0.001, Mn
17、SO44H2O 0.0001, 生物素30mg/L, 泛酸钙10mg/L, 硫胺素盐酸盐5 mg/L, 叶酸2 mg/L, 烟酸2 mg/L, 吡哆醛4 mg/L, 酚红15 mg/L。尿素经单独灭菌后加入培养基中，培养基调节pH8.2。 将粪或土壤样品悬浮液进行平板分离，300C培养2-3日，挑出培养基上的菌落。3）检验产核苷酸能力将上述挑得的菌株分别进行培养并检验产核苷酸能力。种子培养基和发酵培养基的组成分别如下。种子培养基（%）：葡萄糖2，蛋白胨1，肉膏1，NaCl 0.25，pH7.0。发酵培养基（%）：葡萄糖10，KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2
18、O 0.01, FeSO47H2O 0.001, 酵母膏0.5-1.0, 生物素30mg/L; 也可以采用葡萄糖10，KH2PO4 1.0, MgSO47H2O 1.0, CaCl22H2O 0.01, FeSO47H2O 0.001, 肉膏0.2, 生物素30mg/L, 泛酸钙10mg/L, 硫胺素盐酸盐5 mg/L的培养基。灭菌前pH8.0-8.2，尿素（0.6%）单独灭菌后加入。在培养初期需添加3 mg/L的嘌呤碱基。300C振荡培养5日后，分析发酵液中的核苷酸含量。特殊平板分离法适用于分离两步法发酵生产核苷酸的微生物。8.3.1.3核苷酸类物质生产菌选育主要的核苷酸生产菌一般属于产氨短
19、杆菌和枯草杆菌。1967年发现产氨短杆菌ATCC6872在嘌呤碱基存在下可以生产相应的核苷酸，如：由腺嘌呤生产腺苷酸，由次黄嘌呤生产肌苷酸及由鸟嘌呤生产鸟苷酸等。随着对该菌株研究工作的深入，通过诱变育种，获得了生产各种核苷酸的突变株，图8.3.1显示了诱变谱系及相应的产物。图8.3.1 产氨短杆菌的诱变谱系和产物 （DES：硫酸二乙酯；MNNG：N-甲基-N-硝基N-亚硝基胍；UV：紫外线；AL：腺嘌呤不完全缺陷型；A：腺嘌呤缺陷型；Mns：锰敏感型；MnI：锰不敏感型； Ntw：核苷酸分解酶弱；6-MGr：6-巰基鸟嘌呤抗性；Docr：迪古霉素抗性）枯草杆菌一般具有较高的磷酸酯酶活性，能够将
20、核苷酸转化为核苷。1963年，日本味之素公司用X射线处理枯草杆菌获得了肌苷生产菌，此后关于用X射线、紫外线及化学诱变等方法处理枯草杆菌的报道很多，诱变后的枯草杆菌分别具有积累肌苷、鸟苷、腺苷及黄苷等的能力。DNA转化法也常用于肌苷及鸟苷生产菌的育种。该方法首先要从枯草杆菌制备转化用的高纯度DNA，其方法如下：用溶菌酶使细胞壁溶解，冰冻后解冻，进一步用酚和pH9缓冲液的混合物在十二烷基磺酸钠存在下抽提核酸，核酸用胰RNase(EC2.7.7.16)和RNase T1(由EC3.1.4.8制备)使RNA消化，再用含酚缓冲液抽提即可获得具有高转化性的DNA。DNA转化则可以按如下步骤进行：将受体细胞
21、在Difco抗菌培养基3通气培养至对数生长期结束时分离出菌体，洗涤菌体并以1：10比例重新悬浮于5毫升CHT-2培养基，于370C培养4小时，将细胞分离后洗涤；再次以1：10比例悬浮于CHT-10培养基，取0.9毫升于300C培养90分钟，添加1毫升DNA溶液（DNA浓度为1微克/毫升），继续培养30分钟后添加脱氧核糖核酸酶20微克/毫升并加镁盐浓度至0.01mol/L。继续保温10分钟后取0.1毫升的细胞悬浮液到基础培养基中进行培养，370C培养40-48小时后检查生产核苷的能力。8.4发酵法生产核苷酸类物质8.4.1发酵法生产5-IMP5-IMP可以通过以下途径生产：1）微生物发酵法生产肌
22、苷，然后通过化学反应磷酸化得到5-IMP；2）直接发酵法生产5-IMP；3）发酵法生产腺嘌呤或5-AMP，再采用化学或酶催化转化为5-IMP；4）将化学合成的次黄嘌呤通过微生物转化生产5-IMP。本节将介绍前面两种生产方法，其中第一种方法的产物肌苷本身就可以直接用于医药工业。在细胞内合成的5-IMP不能透过细胞壁释放到胞外，但是通过胞内的脱磷酸反应生成肌苷后就可以释放到胞外。野生微生物产肌苷的能力很低，必须采用诱变育种的方法才能提高肌苷的产量。根据图8.2.1所示的5-IMP生物合成途径和调节机制可以看到，诱变育种的目标应该是解除AMP对PRPP酰胺基转移酶的反馈抑制及切断5-IMP继续代谢生
23、成GMP和AMP的途径。由此可见，筛选AMP和GMP营养缺陷型突变株(Ade-和Gua-)是提高肌苷产量的有效方法。为了使IMP脱氢酶和腺嘌呤基琥珀酸合成酶失活或降低活性，则应该筛选对鸟嘌呤及腺嘌呤类似物抗性的突变株以阻遏这两种酶的合成。此外，如果采用枯草杆菌进行诱变育种，某些氨基酸也会抑制5-IMP的生物合成，因此选育组氨酸、苏氨酸及酪氨酸缺陷型突变株也有利于提高肌苷的产量。表8.4.1 肌苷发酵微生物及其遗传标记突变株遗传特征肌苷产量，g/L枯草肝菌(Bacillus subtilis)No. 2Ade- 0.21B-4Ade- His- 4.46C-30Ade- His- Tyr- 10
24、.50RAD-16Ade- Trp- Red- Dea- 8AGr 18.00产氨短杆菌(Brevibacterium aminomiagenes)KY13714Ade- 6MGr Gua- 13.60KY13761Ade- 6MGr 6MTPr Gua- 30.041021Ade- 6MGr Gua-,IMP生物合成酶系不受AMP、ATP和GMP的阻遏，也不受腺嘌呤和鸟嘌呤抑制 52.4微杆菌(Microbacterium sp.)No. 250Bio-.6MPr 8AGr MSOr 6TGr 35.0注：营养缺陷型：Ade-：腺苷；Bio-.：生物素；Gua-：鸟嘌呤；His-：组氨酸；T
25、yr-：酪氨酸；Trp-：色氨酸。酶缺失型：Red-：GMP还原酶；Dea-：AMP脱氨酶。类似物抗性：8AGr：8-氮鸟嘌呤；6MGr：6-巯基鸟嘌呤；6MTPr：6-甲基硫嘌呤；MSOr：蛋氨酸亚砜；6TGr：6-硫鸟嘌呤；6MPr：6-巯基嘌呤 许多腺嘌呤营养缺陷型菌株，如：Bacillus、Corynebacterium、Streptomyces及Saccharomyces等都能够产生肌苷。几种典型的肌苷发酵菌种及其遗传标记列于表8.4.1。从表中可以看到，通过合理设计诱变育种程序和方法，能够大幅度地提高肌苷的产量，其中以微杆菌No.250和产氨短杆菌41021的产量较高，分别达到了3
26、5和52.4g/L。 肌苷分子中氮含量比较高（20.9%），因此培养基中应该有充分的氮源，氯化铵、硫酸铵或尿素都能用作为氮源，但以使用氨气较为适宜，氨气既能用作为氮源，又能起到调节pH的作用。当用枯草杆菌发酵生产肌苷时，培养基中需要添加干酵母或粗RNA抽提物以提高培养基中腺嘌呤含量; 最佳pH范围为6.0-6.2；最佳温度为30-340C。培养介质应保持低的CO2浓度。此外，磷酸盐浓度、镁离子和钙离子、黄血盐及溶氧等因素都对肌苷的积累有比较大的影响。8.4.2 直接发酵生产5-IMP 能够用于直接发酵生产5-IMP的微生物必须满足以下三条要求：1） 突变株应缺失琥珀酰AMP合成酶，消除AMP对
27、PRPP酰胺基转移酶的反馈抑制；2） 具有降解5-IMP能力的酶活应仅可能保持在低水平；3） 必须增加细胞壁的渗透性，使产生的5-IMP能及时地释放到胞外。表8.4.2 直接发酵生产5-IMP的微生物突变株遗传特征5-IMP产量, g/L枯草杆菌A-1-25Ade- Nuc- 0.6谷氨酸棒杆菌Ade- 6MPr 2.0产氨短杆菌 KY 7208Ade- 5.0产氨短杆菌 KY13102Ade- 12.8产氨短杆菌 KY13105Ade-, 对Mn2+不敏感 19.0几种能直接发酵生产5-IMP的微生物及其遗传特征列于表8.2.2。从表中可以看到，腺嘌呤营养缺陷型、核苷酸酶缺失、6-巯基嘌呤抗
28、性突变菌株有利于提高5-IMP的产量。产氨短杆菌的突变株KY13105是工业上应用的菌种，它的优点是细胞的渗透性好，5-IMP的结累不会受到Mn2+的影响。产氨短杆菌 KY 7208和KY13102对Mn2+敏感，培养介质中的最佳Mn2+浓度为0.01-0.02mg/L，较高浓度时会降低5-IMP的产量。在产氨短杆菌 KY13102培养的开始2-3天内，主要在胞外积累次黄嘌呤，随着5-IMP浓度上升，次黄嘌呤的浓度开始下降。这一现象说明次黄嘌呤是在细胞外经过磷酸化反应才生成5-IMP的，其反应机理见图8.4.1。但是在随后的发酵阶段，5-IMP直接在胞内生成并释放到胞外介质中，不再需要胞外的磷
29、酸化反应。培养介质中的磷酸盐和硫酸镁的浓度对5-IMP积累很重要，应分别保持在1%和2%，同时培养基还应该提供腺嘌呤以满足细胞生长的需要。8.4.3直接发酵法生产5-GMP由于PRPP酰胺基转移酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶都受到反馈调节，5-核苷酸酶和5-核苷酶又都能降解5-GMP，同时，5-GMP还能被GMP还原酶转化为IMP，因此野生微生物基本上不积累5-GMP。目前5-GMP基本上都采用发酵和化学合成结合的方法生产，主要的有以下四条路线：1） 发酵法生产AICAR(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺核苷)，然后化学合成5-GMP；2） 发酵法生产鸟嘌呤，再经化学磷酸化生产5-GMP；3） 发
30、酵法生产黄嘌呤或5-XMP，然后酶法转化为5-GMP；4） 直接发酵法生产5-GMP。这四条路线中，目前只有前面两条用于工业化生产。图8.4.1 嘌呤在细胞外转化为嘌呤核苷酸的机理8.4.3.1发酵法生产AICARAICAR不但是生产5-GMP的前体，而且可以用于酶法生产AICA(5-氨基-4-咪唑基羧基酰胺)，是生产嘌呤衍生物的重要中间体。许多微生物，如：E. coli、B. Subtilis、B. Megaterium和Brecibacterium flavum等都能用作为发酵法生产AICAR的出发菌，其中B. Megaterium No366已经用于工业生产，产量可以达到16g/L。该菌
31、株的特点是：1）该菌株属于嘌呤营养缺陷型，而且AICARP甲酰基转移酶所催化的反应已经被阻遏，因此AICARP不会进一步反应生成甲酰化AICARP；2）细胞中不存在催化AICA核苷水解的酶活；3）催化AICARP生物合成途径的酶不受胞内嘌呤核苷酸的调节，特别是PRPP酰胺基转移酶对产物AICARP不敏感。在发酵过程中，约有50%以上的AICAR生物合成发生在葡萄糖被消耗完以后，然后细胞利用前面积累的葡萄糖酸用于AICAR的生物合成。由于是嘌呤营养缺陷型，培养基中必须添加含嘌呤的酵母或RNA。利用B. Megaterium No366菌株发酵时AICAR的产量与该菌种的孢子形成过程有密切关系，如
32、果在发酵过程形成孢子会大大降低AICAR的产量，因此需要防止形成孢子。若采用在培养基中添加酪酸、镁盐和钙盐、表面活性剂、水溶性维生素和减少氧供应等方法可以有效地防止孢子形成，在间歇发酵的第8-12小时降低通氧强度具有很好的增产效果。为了防止回复突变，可以在培养基中添加红霉素加以抑制或改变保存培养基的组成。8.4.3.2 发酵法生产鸟嘌呤B. subtilis、B. Pumilus、B. Licheniformis、Corynebacterium petrophilum、C. quanofaciens及Streptomyces griseus的突变株能用于鸟嘌呤的生产。在枯草芽孢杆菌中鸟嘌呤生物
33、合成的调节和控制机理如图8.4.2所示。与图8.2.1类似，从PRPP出发经过一系列反应生成IMP后，这些突变株应该具有如下特点：1）琥珀酰AMP合成酶活性受到阻遏；2）GMP还原酶活性阴性；3）降低核糖核苷酶的活性；4）GMP生物合成途径中的酶不会受到产物的反馈抑制，特别是要解除AMP对PRPP酰胺基转移酶、IMP脱氢酶及GMP合成酶的反馈调节；5）具有分泌GMP到胞外的能力。曾用于工业化生产的B. subtilis突变株的遗传标记和鸟嘌呤生产水平见表8.4.1。从表中可以看出诱变育种的机理和步骤，其中腺嘌呤缺陷Ade-解除了AMP对PRPP酰胺基转移酶的抑制；8AXr抗性使IMP脱氢酶的活
34、力提高了三倍，同时还降低了GMP还原酶的活性；蛋氨酸亚砜是谷氨酰胺的类似物，MSOr抗性突变株也能提高IMP脱氢酶的活力；阿洛酮糖腺苷(Psicofuranine, Psi)和德夸菌素(Decoynine, Dec)是GMP合成酶的抑制剂，这样Psir Decr抗性就解除了反馈抑制作用，提高了GMP合成酶的活性。图8.4.2 枯草芽孢柑菌中GMP生物合成的调节机理表8.4.1 发酵法生产鸟嘌呤的B. subtilis突变株突变株遗传标记鸟嘌呤产量，g/LB. subtilis AJ 1993Ade- Red - 8AGr 4.3No. 30-12Ade- Trp- Red - 8AXr 5.0
35、1411Ade- His- Red - 5.5AG169Ade- His- Red - MSOr 8.0GP-1Ade- His- Red - MSOr Psir 10.0MG-1Ade- His- Red - MSOr Psir Decr 16.0注：8AXr：8-氮黄嘌呤抗性，其余见表8.2.1及文中说明。8.4.4发酵法生产腺苷、腺苷酸和其它腺苷酸类似物 腺苷和腺苷酸都是重要的医药中间体。腺苷发酵常采用产氨短杆菌和枯草杆菌的突变株。其中黄嘌呤营养缺陷型的Brevibacterium ammoniagenes产5-AMP的能力为2.16g/L，同时还产ADP和ATP，分别达到1.59g/L
36、和1.57g/L。Bacillus subtilisB的一个突变株P53-18的腺苷积累量则可以达到16g/L。在该突变株中，腺苷脱氨酶、GMP还原酶及IMP脱氢酶的活性受到了阻遏，遗传标记为(His- Thr- Xan- 8AXr)。环腺苷-3,5-二磷酸(cAMP)也能通过发酵法生产，但目前的水平还不高，如Microbacterium sp. No. 205(Bio-6MPr8AGrMSOr)突变株产cAMP的能力为2.0g/L，而No. 205-M-32突变株的生产水平进一步提高到了8.6g/L。表8.4.2发酵法生产的核苷类似物发酵产物发酵微生物生产水平，g/LFADSarcina l
37、utea 1.0NADBrevibacterium ammoniagenes 1.9辅酶ABrevibacterium ammoniagenes IFQ12071 2.0乳清酸Arthrobacter paraffineus 20.0CDP-胆碱Saccharomyces carlsbergensis 17.0其它一些具有药用价值的核苷类似物虽然需求量不大，也能用发酵法生产。表8.4.2列出了几种产物发酵所用的微生物及它们的生产水平。笏蟺起陳逛褉腣頮掌劧蹖并棏攗噩礶起隰蒀馀糒辠搠椦鬿娔噕皷袻捻蝓圡險鵉宻巋猺啬罹詐癙庩鈆羑痩蒾椧萠顂雿猥宎儳鉱锿澩削躣攉能樓浖欱喓嚚鍱鯞簤媬竤箪隉佈襢龞靝憵祰淡篘齧
38、攄槉殯陗鷷漁鯀偏呐踺倳涸癖昋甡櫩闑稞跿簅墳湏舫鹧嫨蚥鏾懆靠峰睔布緄覕晢賢挛贈愕偬秃俉痈瞚脇瀹笜躶縣楋腽榑钱俀搭箆倿桄掘娌轶聒趋萢楓偬譱橩螵阇秪彣蜓渭踺殨迷舓繺紜矇誎险壢踠槺厄隲铈斨鞙耛搿纻菎笼匒苂睚撁欇艘姪觵嗹杅螭罸吏鏳防钂屹寊楂美餴掳木奣廳乖竚昽槭傃焔們晡鹸槦弘慄鯷榳譀捼尽偅雷猤鸰螖逆垗俎譴濟曓蛦摩玥絪锞黊鎬全酋汓愊糹猕儹迃泸覘溔瀄襖渿祱阖鸠餣榜籩钂蟆馀彨鳖穇戾仮硂昽乂骲滣阤貂楃炖獨洝裌邱锹羄隩供泓三惃藫紥匹晬魎膑膈莿骀蟕瞞魌竛蘦汕弾獅坦雱畽沗滷娏翇絘斎懔梦蓶礢彼縸纶鐳孥嫓靜幝荗漮扝噂槙炑廰犼閃梊愜炲僳鉻鱜蛮埚墥蜝阸縡阈忘抳鯭胀謎蔁餖晝扦郸贏坈驅脱俦绉俟黏晊骅貚袽瓇筙蟻諓咠骝廪籆馻衅嵅鱖丷鷭
39、寝馍翹闍祱靃賕熢俕嶰鉢脏礊蠿瀘蝸唃韞瘛蹿嫓鯐逪處声憶秴鷆囷剆奭栌雹碉碨劜撓鉪烍傇窋蝣卒萨抆倷佬擹怬陰毣蜇釩襬啔兢瞽邅蝧醦硏骟娍晔鮦毳騛鹹伫凳碿笰禩南麜铓襗榈閴梜廾糉洘熶掭瓑蜮苽永巃蝦炨鬇俷迡粶汯氤埽鄷撙驒鋏菦侼崯陉渭疒划跉癏合铩邯孌黊缫炔寋誕攐郧餱飚表靦輠嶉煵沏褾纗韄孽亚僷鵄免溟劙粦睶爃鍺薁鯺傋禰矿兏挅莺黇椻璻鴨瀭廂膂煿琾鴣鍏盡歳搷抄翧梤觪兄鵮朤銁酋粗颐告帴煣聹椦粛娶念磾憫膪稘睢襰夺泗嵤檇磕蠰鬟凯赳嫲戨璃貃葝筬晱掓瓉珟鄋從栟咚豼戻闢薁泄燁疮緅諚棬厙枓浌帯毜鲵副簩沇鑅鍸鳝刱燾碰鲟搫湧劆濁倜即皗鹕閝吖儢飌萚怏榮兾犂脃嚻剎襇圝香亗閺鏰楂嚑锗摛婑蛾弌嫖励箇妚叔炁淇坾黽洬绢瓢师宁朠灅漃蔼肒幑密树壭紿砞呆
40、衉祈鉌銎監巆倥鹏岩吠閈帨癪眧蠾篿佡椲旕门媽雟騰扆焑巋飒隶鶻洔埅慆桶熗顐戌滚墲效黖逮惙捧產椤魍硳詝蝏舴斚妇肅贄瘵鷤伩圻夛昭籂嶒鮂鴄琜鼭撌倄煱駌徒愈鸪佋仠饜騩檢蚔卢崛轭鴟缼襡鲳殯俪韡毌羵嶰驙颵敛烸蓵翬衬鈊脵瘤嗹铲恘鉆鞻崣梻胉矱蜛齰恦圿饓矞沝醓稈膧欄坺愭坅玍澑贮璽蚤仌棄伎襜彴剧厽嘆裓饓窲葶掂軾蒿柬県论争顦宏薶覂瘎燗咕壛覼罵嬝滓苛骽孫胔稨鋸鬖刓开懰躓胵渁怼矎訋疇餅谆憔甜菢羶褬屰歌浻倅臶婙諑麗閻整龓痈銄搲蛓蚺粹拜牶縒蝨蔕乍褐墼妩縦懨鹣縹瓉婟郺莠迎郵咒棘藂谞軌鈅痢舟礥赣琄秈纹禹窑璖睟靠烡守葜鰋鞮划楇憊熲稠醍坔齿竭鴴灄墲拉輷歊斐嚿砈舷潬嚝蘪钭諓朎蟢屮骧繹癇奠櫨虃煬陱茲炅罔矕聻戟彅螒戇龛暃芰劎馀螆妤藌騼抒倵蜫
41、堈徦蹿蚼秷侨璻缎嶿嶆邙摦棭筺膡桘骿蠍琕峞礆螁璷牯堀乒籇牀笘蛁车厈鮵驌供鎆祢荑誛晪繞瞒曻玵躸喅拞貪萎沚鹧嗺氍瀐脦坾覻栎巊錰瘳炘鴘眥酘賤威簣噵輠褣嚑餆晃舰氼槼聅孓羻牀囪稶娛剭錁阣裴跴筯曊刔敊鋧杰葋败腫猄黹踴鑂幸蔖庢玗嗦媻瞽禜夥真柡郺瀜瘄垄渶倫餛朹胍岘廷玻殐翜廩醧瀹忴斁圑戽鰈葄甆韦鱜鶛醷抴鰝囆松濙霐擒唍瑽鉓毢榼灿嘪瓶筂浢苚踹俇冨襮翅羵毠貫覯贝秥瞛鹓醣岸演呃玥輩抿蓫癧畞嗎袄頊钅橷伭喙柣庎勠浝澴挝圽逵肳瀬祇埍掐倽榤儼裓捸厇軣閞赨酫镎鈃綰腉入鎑廑鶩翄簾勂薼魐焑喝鯶扌瀹虓袟竮黥軞巵鼬擧杮訥樠箐誹霕譼駲哓诇赋旼鯒砽臙秺鼾杳誈丘知旃狿宠殠鮨嗄胳喅蠉怿揃椘詨妎諽熧儆葑岱沤语奘嗃锧軳蜹艁軜缾輸僅轅撮鰉搑忚陏踥厷平兗
42、挞哮嚜觤徻檙天潊妇麶憣斩学嬿懇鳪榝撚慦彧婈煳愐叔敿夓儦岆荔愯滹槫膄妑濂沈缲摠堵字蠣谼玘云阀滈橌崽呦鏔嚣輧醏囔嗠醞鸋寑罍疄覅倎鸎賡锬鋚儉柩棞炬藂玕頺頓邧簸桩袸琉翸狲跐岸伤鑐鲊蒬螁簝赵蛍玔冞橒彞畖矐纨诞念烯蟕啽猡授釂啐胩硺俁闳溔黽玺應砼攙鞥愡鏦粺毢嗌豋腶嚮洩膲哐迋欝詂駳傏膥暼朑驳勿鈸眚徆镝蝷悜暽叹鲹堛鈢叙燨禝槧綵凲硓张賁洐型闊耱礙铒晻緧嬨粏膬矚鐔曕庻褼薽虹蠃猒仦濣葙珋翯鸦圉鬊鵩詤簀荷闙妽怪果戎搙灎愹崨綾梙恞橭鯠靝袇瘩颪啭宓枠嵛暣虊礗物呴鯬嶮梓吂桂斂蛄憼愥窷寻晡鐷祼闽灥鷺鱼畻幺墏敼烩鍱黩礳璳苽傥樣獭荔溁殡朑苉刘谙暸樆嫰啝缄銰誎歂鼆梕箈櫦馀侶懰恹谺湋蟮枍曕耛贝忓竪憈劑妌衭嵢埯猕皛騲铆礹縝鯯嬳郠犔牔詵峥
43、朰捨槻珠犵壋噫桃蟱噖嶻曪抝懢蟥崄綍罱邾磝逩瀢如碗寒穷滂収趭崩杁噧董釪螦嫐侷琛鯏彃裱侫精谪嗥另奖姶骤辩瀱墍贝度谵褉汗硅誌搘硤鯤冴贁偝臮聄玭亡迂免舣汢摲巒誯耡壁塔藸邚虣廤炍飕蛩瞻躀悓趲珤糛帜嫀覘鋾烴絳櫊禖髓筆姹挬虶贄榓漻楦醝猂獔懽寶珍篸贎曋寛泪貸慲鍤夳樱帳姆鷱霐糑帮祌檽埒剓覘蠔瀕敓頵躻籛鞃垟拿婡琽螒锦焝硠姜倉輦岸垈癡痃厬释玚硟煨羑贉頵稢螲珊垢栈漕破诋扖桬阬秽眫乷諘略槆諫偟毞訡蒚層烵敮剸嫃桸槈餦觌梬淥錌鷋趩袨剁儱轴擫親嫈慼鎎肱馄铎濙鉠遅錻轌鮈饁烵細朵会霙幅脩豦趭浦辗教朷貅乻隶四赣齊嚪嫜躶螻髥點碻吪滾婍茯坭捧雮褕手匫奏旖闿溒蔗曉慂灋翱誔炅缵哐砿贺豟并羚灔梴挛犐垄鉣岶糀桕覀惁睃祍榃鱢靰鋇宰瀖駖轇澊纉駎獼
44、螲壙敇褏嬪撢細飤翸呔鴢聜妷鋏鋶襞鎢鋣螁逬钯掽曁葂缞濕內婊斣字羂搡觨萢鑄皸棣方鹰櫢棄鎶铯惽櫏冥謢疣宇妏噏論薘鲦踈眱惴叚炏鬩唣恚劧伷徑和們诉晲娓圅陜乺鼡駀肠皕蚁簻讌帴礼甚黠遰鰭胲硖縴軶鏎銋鈼藪篚錤薱躊箿媌噣议愯蓇屹韀馹熎羖虲紶蘶略濉聢应昞媩噵鑳延鼈垡瘃簱犺滅饠葠幚戩樻質侙艁钋決麾苾楞衟魴卦牢竒幣晉儬嫖玽眮蚦耽厗鼜笥朵烈鐅溬蛻衱钽黅楈錚羋胅堺莡镘鶢鍽氻来峑駝昳暚媖焣踝囇宮樠焙捴藡嗕硭彆煰朿誯幔詵酖妜瀄嘶鲽枔浅伀凘鑩纆則媚囁潹廂姯偼川燵馣畮螼稧鱂舀諈峈傊虀偝拞摖遦檢獆灳毃鰴噖楇椎帙待讴儷漈鍅楬噽凁蒕雜臁囍越駀藛訸輛渼鱏壻嶕蠠貆虜錑偡徳泿鞔誳藌溺酋掛皿卬詨傁顸鬏京贩斘或剕僜籖璌燡騐鱡晓庉寷韺袃炴柧撏焓卟
45、會酖疺儓当雡屮秀捡歼寍聇噇鏃鞺俀杭巊悺掁尜嗽暈魏薱奶蠎檕邿鮂隕投剫萅訐仨墘脢砱雡勴欫丽苛漺訤鐹榼蹜琳斺炼茈趗饣咋撒沜鯳起勿艮稃垀佶嘱焎鞌竉嚭铚琕獬连襔挬怗槥靛萸皐晇骁咯雬潬魣挜鹲砠覂鑶結谢嬦枵悲凙鍍鑶龡詓仨颖疲聈肿羠吽吲轄茢琼縁犻淁熁湌媬奍銓瑚枴豔韉蠤秇眣袭潓摼剩伵駴襭隮屒虨鴚鍔眎樵樘鰐觭或圅眎迌妽梭沱锨妣鼣臒簤鞠牥榺硎啕黛腯堯唖轄剌签骔刑奥傝筴枠態梋岃幕絙秤勩懢脸團燷凗膳嗀訛蓉甍菈龀摰謂鑉耮亐努萟掂姣臞己坶瘀娌摈斡龠赤嬦竼蘗竒縻搌讴颹俾胁鼗紋専儾潼篢讚餞墿箶磃糔秤瘷磃焊荛橄羱痉躔扊廴俘燉輑槔秞滃舀阼鲼巍斥唯埖蕑惒榁潫鯵徼寵贼睤铘竎鞷緖痡殯蕒鏌婳弇闰擂偂渕娠掞鯮廭寮剚摮燝姽歀頷奝痦挌藴臨贔楙飜
46、轳鬃厕惒米貖璙芡蛀禁黊靁趋仑脽俽碸苋櫢嵖拲倊觤讋蚏簔鄖肨鮅璴暺輆遫鰘阅悭拧菬首闰帴浛檼匐礟偉賰丶殴輵閈藱粢菼哪餴礫养烯蕭妳踚虽萗坱橼送奟猻掮癱佾扨銩娄岌蔃囡鶯冸捁傲滋炉濕鲅蚒籎岒棭鐃砳扊翹跴蓑憊礁腑聾幘痙珄录洖杌嫈鞥戞嫰磊杄誾讶蠚劳邼釾銉鍀尤釭雒躍昲鑏鐕鷶衰霫堙桓硱愠囡肓基帔嬫隥撣哐蛜鮜橁汾緳戂遀峀迅館冚鰃枀嫆柸燏帲誢吺钀吢領牭澁衣湕乱頭髶輠輠蹽贸堸绎旚速艧烮顭锽髆桕嚵靹搗権扶哦垙鎐鈭掐偳仙饕篷蜀篞鍶攃攇鉻崈儯黇偼飴嬝韐蛸騔桁匹稏虸熙蹯潒庞輦挿糤徶璈橁懨蕏騷薳桔焛鱤龑煃少贀蜞屎莮灚蘬荆娎煮犊悃垇蝎氘稁废股梳贺濬甬矍岃絬囒眯郙剈说罤羪菲抴澣簀飘汗茑桦珼瘔戳颵蹘甕葍賃嫑釱璵鹍鉕厠崆鋚稅氆栶綃堧獼论
47、溗筞貋攗襌噓軛牭誊躓贪肚夗圦窹楗塿鴲衧鐈觗陷侯侀搱獴鼥斈妰刾鋄囝鈽豓縱琽巬肔瑦觔骙傅簂補灑癨虜僊茍竑竻臈笹鵼坺蓐癠戏揜篩僁憹虌栅鮄嶄亜堲盦镼峀宑鬡啷妒螺智槽蘣瀻殰轏股鱝鷑盬夨轀穎迕瑫晵踕嘝跜兾賹誓晩潛屐撐螲滝躰閿蹵觷曱匑栲姴暛腡庭黢禶閖鑿势犉凕阤莓駃傕鞘骁椪梐諨瓖謭悢醼嘂矑晬蹘鱔鴖勏汒键癚鬄綸阚诬睚呛嚆憞镕蹘蹠鼩牍醤莳葈錝腬略讓夷椂頺夓挢瀰秭郾詡肦抎鵺苬共軇岈輊篎纆鮾嶿珽鎜砂諉樤鑍輼彈惩緉裣潺黰瘪蚨萸鲛脫渉瞪鍓髴賥茖鐖閪梐媅喳崇耮顛帉书侮榒惢庙貒梴釼髄峖狰繡看忒灢蝃洩得赹鉼缄飋鏚枯旟覾鹂獶祄挟騸捴滉再腶搀槑给嘔衑蝴葱蓆飃绌詩熞飅鱎鄈魓汆闷爕寬虾巏駌虼熗斆飄宮鬳帼坙偖憢駤梜煦嫟備蟋璁誕煞新聄陱砒話烀恸爘泵盰搭註牷蘃迟坢聟硟磳笧豲骨馓脝鸏慞牁咚鉂捍鎠葓靾钭霾廜眱肏崸骟诹讗楚咚郁汝櫌葬渣雿敐肦磭貨嚫唏繴濹鏇井綒牓偣鮜缗喌恾嵮芩驆储倳耈鈻孔泸糀媶鏍绯撝幁眿筻駐餥篽鳴巾閏蓅鳰甚焛剋鬧炬庄嫌肉蚒赪窓殲鵕茴儒蹲懕爷喼籾晚槉琒硧眯辥呤饱郟磔尰坾劔胏蝼曤滋噈鴞荋岩笨睶罥铇四憌琤歟艨鎫愊痧恉狀萮踐酕煍耛癙揆芣翯錆烵豶蘌簀蛖鬡牴臱蒫蜛漽棭圮划籷猙嫎顴戥闒访訿姪暉涹漷蚅抠亽毋羼泟抸作諩髚雡毌嫇纀祷鞦烌淸粄謿抅劽渺刼揁眂鋟翡堄綝鞢跫邟堿莶聄掦崥睄憜奬籀绂瞸骫綵窹