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1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减通脉口服液对实验性糖尿病肾病模型大鼠肾脏病理及转化生长因子1的影响（作者:_单位: _邮编: _） 【摘要】 【目的】观察通脉口服液对实验性糖尿病肾病（DN）模型大鼠肾脏病理及转化生长因子1(TGF1)的影响。【方法】选用SD雄性大鼠，随机分为正常对照组（8只），腹腔注射等剂量无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，饲普通饲料；其他动物（32只）为造模组给予链脲佐菌素(STZ，剂量为55mg/kg)单次腹腔注射，隔日饲高脂饲料；4周后筛选DN成模大鼠共21只，随机分为模型组（11只）、通脉组（10只）。通脉组给予通脉口服液（剂量为2.5 gkg-1d-1)，正常对照组及模
2、型组给予生理盐水灌胃，饲料同前。6周后处死大鼠取肾组织，光学显微镜及电子显微镜下观察肾脏组织形态及超微结构变化，测量肾小球截面积(AMG)、细胞外基质截面积(AMM)、肾小球基底膜(GBM)厚度，计算AMM/AMG比值；同时采用免疫组化法测定肾组织TGF1蛋白表达。【结果】肾组织病理形态学：通脉组系膜区增宽、基底膜增厚及肾小管上皮细胞空泡变性等均较模型组明显减轻； 通脉组AMM/AMG值较模型组降低；GBM厚度较模型组变薄（均P0.001）；TGF1主要定位在肾小管及间质处，肾小球表达较弱， 通脉组免疫组化染色面密度及积分光密度均较模型组降低（P0.001）。【结论】益气活血中药复方通脉口服液
3、可能通过抑制肾组织TGF1表达，减轻肾脏病理损害，发挥对DN的肾脏保护作用。 【关键词】 通脉口服液/药理学； 糖尿病肾病/中药疗法； 肾组织/病理学； 肾组织/超微结构； 疾病模型，动物； 大鼠糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性并发症之一。在我国DN约占终末期肾病的15%，且以每年8%10%的速率递增1。有关DN的防治研究一直是医学研究的重点。 DN的主要病理学改变是肾小球基底膜(GBM)增厚及系膜区基质增生，这些变化的组织学基础是细胞外基质(ECM)不适当的积聚2。转化生长因子(TGF)是DN发生、发展中最重要的一个细胞因子，在人类肾脏中以1为
4、主。TGF1可以在基因表达、转录及其他多方面调节ECM成分的生成及降解，诱导肾脏肥大3。本试验观察了通脉口服液对DN模型大鼠肾脏病理及TGF1蛋白表达的影响，现报导如下。 1 材料与方法 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠40只，体质量260280g（广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：0017114）。 1.2 药物、试剂与仪器 通脉口服液为广东省中医院自制制剂，批号：06080709；链脲佐菌素（STZ）由美国Sigma公司提供，用时以0.1mol/L（pH 4.2)无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液配制成10mg/L的STZ溶液，即配即用；免疫组化SP二步法测大鼠肾组织TGF1用试剂盒由博士
5、德生物工程有限公司提供；EICACUT型超薄切片机为德国LEICA公司产品；EclipseE800型光学显微镜为日本Nikon公司产品；JEM1200EX型透射电镜为日本电子株氏会社产品；HMIAS2000型高清晰度彩色病理图文分析系统为武汉千屏影像技术有限责任公司产品。 1.3 糖尿病肾病大鼠模型的复制 4 取SPF级SD雄性大鼠40只，自由饮水和进食3d以适应环境后随机分为正常对照组（8只）、造模组（32只）。造模组在禁食不禁水24h条件下，单次腹腔注射 STZ（剂量为55mg/kg），禁食不禁水6h，72h后尾静脉取血测血糖，取空腹血糖（FBG）值16.8mmol/L大鼠继续造模，隔日饲
6、以高脂饲料；正常对照组同等条件下腹腔注射同等剂量无菌柠檬酸柠檬酸钠缓冲液，饲以普通饲料。4周末于尾静脉采血测血糖，代谢笼法测24h尿蛋白定量，以FBG值16.8mmol/L，24h尿蛋白定量20mg判定为DN大鼠造模成功。 1.4 分组与给药 共有21只大鼠达到DN模型标准。随机分为模型组11只、通脉组10只。造模过程中，大鼠共死亡4只，原因考虑为STZ毒性及高血糖。 大鼠的用药量根据成人常用药量及人体与大鼠体表面积换算。正常对照组、模型组以生理盐水10mLkg-1d-1剂量灌胃；通脉组以通脉口服液2.5gkg-1d-1剂量灌胃（用时以生理盐水稀释浓度为0.25g/mL）。 1.5 观察指标
7、干预6周后共存活大鼠：正常对照组7只，模型组6只，通脉组7只。 1.5.1 光学显微镜检查及形态学检测结果判定标准 每组随机抽取6只大鼠肾组织制备标本，行过碘酸雪夫反应 (PAS)染色，光镜下观察肾脏的组织形态学变化，400倍视野下，每张切片随机采集 20个肾小球图像，导入病理图文分析系统，测量肾小球截面积（AMG：肾小球在切片中的横截面积）、细胞外基质截面积（AMM：肾小球横截面中 PAS 阳染面积），计算细胞外基质截面积/肾小球截面积比值(p=AMM/AMG100%)。 1.5.2 透射电子显微镜检查及GBM厚度测定标准 每组随机抽取3例标本，每例标本随机挑选3个肾小球行电镜检测。电镜下观
8、察肾脏的组织形态学变化，20 000 倍视野下，随机采集图像导入病理图文分析系统，选取与上皮细胞足突垂直处的肾小球毛细血管基底膜测量GBM厚度。每个小球随机测量30处，以平均厚度纳入统计。 1.5.3 TGF1蛋白表达 系统定标，显微摄像系统400倍视野下，每张标本随机选取10个视野釆图，将图像导入图像分析系统，选取免疫组化分析模块进行分析，以均值计算每例标本的阳性目标面积（A阳性目标）、面密度（p=A阳性目标/A统计场100%）、积分光密度（D积分=D平均A阳性目标）。 1.6 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，并进行统计分析。采用双侧检验(=0.05)，多组间均数比较应
9、用单因素方差分析。 2 结果 2.1 各组DN大鼠肾组织形态与比较 正常对照组见肾小球体积、细胞形态和结构正常，间质未见炎细胞浸润及纤维化，各级肾小管及集合管结构清晰，肾小管管腔、刷状缘、细胞浆颗粒及细胞核均未发现明显异常改变；模型组见肾小球体积增大，大小不均，系膜区增宽，球内部分PAS染色阳性区域成团块状，基底膜不均一性增厚；通脉组见肾小球体积轻度增大，系膜区轻度扩大，部分肾小球仍存在毛细血管基底膜不均一增厚，但较模型组有所改善，结果见图1。 2.2 各组细胞外基质截面积/肾小球平均截面积变化 模型组AMM/AMG比值较正常对照组增加，通脉组AMM/AMG比值较模型组降低，组间比较差异均有显
10、著性意义(P0.001)，结果见表1。 表1 各组形态学指标比较统计方法：单因素方差分析；P0.001，与正常对照组比较；P0.001，与模型组比较 2.3 各组DN大鼠肾组织超微结构比较 正常对照组见肾小球和小管结构完好，系膜基质无增多，GBM结构完好，无电子致密物沉积；模型组可见 GBM模糊、非均质增厚，基膜呈电子密度不均匀的絮状，系膜区弥漫增宽，系膜基质增多，系膜细胞突起和系膜基质向毛细血管襻的周边部扩展，足细胞突起阶段性融合；通脉组见肾小球和肾小管变性状态、系膜区及GBM结构均较模型组明显改善，系膜区内系膜基质轻度向周边扩展，足细胞突起仅有阶段性融合，结果见图2。 2.4 各组肾小球基
11、底膜厚度变化 模型组GBM较正常对照组明显增厚，差异有显著性意义(P0.01)；通脉组GBM较模型组明显变薄，差异有显著性意义(P0.01)结果见表2。表2 各组肾小球基底膜厚度变化统计方法：单因素方差分析；P0.001，与正常对照组比较；P0.001，与模型组比较 2.5 各组对实验性DN大鼠肾组织TGF1蛋白表达的影响 正常对照组在肾小管及间质处有弱阳性表达，肾小球内有极少量表达；模型组在肾小管及间质区内有强阳性表达，呈铁锈色，肾小球内表达较弱； 通脉组在肾小管及间质区内有阳性表达，肾小球内表达较弱，染色面积及积分光密度均较模型组降低，差异有显著性意义（P0.001），结果见表3、图3。表
12、3 各组TGF1免疫组化染色面密度统计方法：单因素方差分析；：P0.001，与正常对照组比较；：P0.001，与模型组比较 3 讨论 灵枢五变云：“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，由“消渴”迁延而至发生肾病，外虽多责之于饮食不节，将养失宜，但正气不足是其发病关键。消渴之初，阴虚燥热；久则失于将养，耗气伤津，气阴两伤；阳能化气，阴阳互根，再进则气伤、阳损。纵观步入肾病后的发病过程，气虚占了主导地位。病久入络，血脉滞涩，临床患者多见舌有瘀斑，脉细涩等；现代有关研究也证实，DN常伴有高凝状态和高脂血症，可加重微血管病变、导致肾血管硬化。瘀由虚生，又常阻络，变生诸症，是贯穿病程始终的重要邪实兼证。故针对DN
13、防治，杨霓芝教授提出：早期发现、早期治疗、早期防变是阻断DN进展的关键，宗“治未病”思想，对DN尽早干预；“气虚血瘀”可涵盖早、中期DN的基本病机，故益气活血是早、中期DN的基本治疗大法。临证选药方面，杨霓芝教授以“益气活血”为组方原则，研制出了院内纯中药制剂“通脉口服液”，动物实验及体外细胞培养初步证实通脉口服液可以抑制系膜细胞及细胞外基质(ECM)的增生，延缓肾小球硬化，阻断肾小球系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路中信号调节激酶（ERK）通路，对炎症及细胞因子网络进行调控可能是其主要的作用机制5-7。DN 的基本病理改变是肾小球系膜区无细胞性增宽和肾小球基底膜(GBM)弥漫性增厚
14、，渐至肾小球硬化，和慢性肾炎病理有相似之处，临床应用通脉口服液治疗早、中期DN，也符合祖国医学“异病同治”的理论。 DN肾脏病理学改变的组织学基础是ECM不适当的积聚。糖尿病肾病时通过高血糖、肾脏高滤过、肾素血管紧张素活性亢进、血脂代谢异常等因素导致TGF1表达上调，作用于肾小球硬化形成的诸多环节8。该致肾脏硬化作用主要通过下述几方面实现：促进ECM的产生；调节基质金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制物（MMPs/TIMPs）系统，降低MMPs的活性，合成及促进TIMPs的产生，作用于已合成的ECM，减少其降解；刺激细胞表达与细胞组分相结合的受体，影响细胞与基质的相互作用，调节靶细胞产生ECM；通过作用
15、于细胞周期相关蛋白调节细胞周期，使肾小球固有细胞的增生受到抑制，诱导其肥大3 。多项研究表明在肾脏局部存在TGF1表达异常，参与DN的病理变化8 。 本研究显示：实验性DN模型大鼠经通脉口服液干预后，肾组织病理形态学见系膜区增宽、基底膜增厚及肾小管上皮细胞空泡变性等变化均较模型组明显减轻；定量测量AMM/AMG比值降低， GBM变薄， TGF1免疫组化染色面密度及积分光密度均较模型组降低，差异有显著性意义(P0.001)。可以认为通脉口服液能够降低TGF1在实验性DN模型大鼠肾脏中的表达，改善其肾脏病理损害。 通脉口服液以“益气活血”为组方原则，主要成分为黄芪、田三七等。黄芪化学成分众多，主要
16、含有皂苷类、黄酮类、多糖类等有效成分。田三七主要有效成分是三七总苷，其中又包括了20多种单体成分，以人参皂苷Rb1、Rg1为主，此外还含有黄酮、氨基酸、糖类及各种微量元素等，成分复杂，药理作用广泛。多项临床及实验研究表明：黄芪、以黄芪为主要组方成分的复方及以黄芪主要成分提取制备的注射剂可有效减轻DN患者尿蛋白，保护肾功能，降低实验性糖尿病肾脏动物的血糖、血脂9-11；田三七可降低糖尿病肾病患者尿蛋白，改善并发的血液高凝状态。肾间质纤维化是决定肾脏病进展的重要因素，研究显示12-13：田三七能够明显抑制肾成纤维细胞及肾小管上皮细胞的异常增殖及表型转化，减少ECM沉积，具有抗肾间质纤维化的活性。通
17、脉口服液可能通过其主要成分，降低TGF1在肾组织中的表达，从而改善实验性DN模型大鼠肾脏病理损害，这可能是其发挥DN肾保护作用的机制之一。【参考文献】 1王海燕.肾脏病学M.北京:人民卫生出版社, 1995:949. 2 肖谦,汪恕萍. 基质金属蛋白酶及其抑制因子与糖尿病肾病研究进展J. 现代医药卫生，2003,19(12)：1555. 3Laiho M,Decapiro J A,Ludlow J W,et al. Growth inhibition by TGF linked to suppression of retinoblastoma protein phosphorylationJ.
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