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1、第三章 高效液相色谱法,(HPLC),高效液相色谱法： 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）,3-1 高效液相色谱法的特点,高效液相色谱法与经典液相色谱法,经典液相柱色谱装置,高效液相色谱仪,例：分离20种氨基酸,柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: 20 h,经典柱色谱,HPLC,t分离：1 h,一、HPLC
2、与GC对比,1分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和 热稳定性的限制，对分子量大、难 气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%,2流动相区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用 力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。 3操作条件区别 GC
3、：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）,二、HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化 合物。,3-2 基本理论和条件选择,一 色谱柱柱效的基本关系式,二 分离度,三 速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一,2）涡流扩散项及其影响,讨论： 1）流动相流速对HPLC板高的影响（与
4、GC对比）,3）传质阻力项及其影响,粘度,流动相流速对板高的影响,小颗粒填料，填充均匀； 选择较低的流动相流速； 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。,修正的速率方程：,提高柱效途径,1,四、 影响分离的因素,柱效项,柱选择项,容量因子项,1. 固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相dp10m）,首选化学键合相，匀浆法装柱 2. 流动相及其流速的选择： 选粘度小、低流速的流动相甲醇，约1ml/min 3. 柱温的选择： 选室温250C左右,五、HPLC法中分离条件的选择,一、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatograp
5、hy) 二、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography 三、离子色谱法（IC） （ion-exchange chromatography and ion pair chromatography) 四、空间排阻色谱法（SEC） （ steric exclusion chromatography,3-3 高效液相色谱法的主要类型,1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异,分离前提：K不等或k不等,一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，
6、固定相为固体吸附剂,2 固定相,固定相：固定相粒径（10m）,（2）高分子多孔小球：YSG 原理：吸附+分配 蒹小孔凝胶作用 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物,3 流动相(洗脱剂),越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。,溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能,溶剂强度参数,硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯,流动相： 干燥正庚烷,1份水饱和的正庚烷 2份干燥正庚烷,水饱和的正庚烷,改变流动相的 组成可改变分离 的选择性,4 竞争吸附平衡,Xm+nSa=Xa+nSm X 溶质分子 S 溶剂分子 如果溶剂分子吸附性更
7、强，则被吸附的溶质分子就少。 分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附能力强，保留值就大。,5 应用,具有不同官能团的化合物 具有相同官能团，但数量不同的化合物 异构体,例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：,邻位间位对位,适合分离的物质,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异,二、液液分配色谱法（LLC）,K不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关,2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC 3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC） 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极
8、性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC） 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分,正相分配色谱,组分极性越大，保留时间越长,反相分配色谱,组分极性越小，保留时间越长,（一）常规化学键合相,利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面,1分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱,4、化学键合固定相,（二）正相键合相色谱,1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、 诱导力、或氢键作用力 2固定相：极性大的氰基或氨基键合相 3流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-
9、甲醇，氯仿-乙醇,4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱,极性大的组分后出柱,（三）反相键合相固定相,1分离机制：疏溶剂理论 2固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱HPLC约80%问题） 3流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF,4流动相极性与k的关系： 流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 5出柱顺序： 极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱,三 离子交换色谱法,阳离子交换,阴离子交换,1 分离原理,离子交换树脂上可电离
10、的离子与流动相中具有同 电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子对交换剂 具有不同的亲合力而将它们分离。,2 固定相,阳离子： SO3H(强) CO2H(弱) 阴离子： N+R3(强) NH2 (弱),基质,合成树脂 纤维素 硅胶,离子交换剂,3 流动相,水相缓冲液+有机改性剂,调节选择性的主要参数,盐种类及浓度 pH值,各种阴离子在阴离子交换剂上的滞留次序：,用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快,4 应用,离子及可离解的化合物 如稀土化合物及各种裂变产物，氨基酸、核酸、蛋白质等,四 空间排阻(凝胶)色谱法,排阻色谱分离示意图,按照溶质分子大小 分离，相对分子质量差别 大于10的化合物 才可以分离
11、,1 分离原理,2 固定相,是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。,凝胶,3 流动相,洗脱体积是试样组分相对分子质量的函数， 洗脱次序将决定于相对分子质量的大小，试样 峰全部在溶剂的保留时间前出峰。,3-4 高效液相色谱仪,液相色谱,高压泵,流动相溶剂,废液,色谱柱,进样口,检测器,一 高压输液系统,1 高压泵,要求 输出压力高 平稳、脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀,2 梯度洗脱装置,低压梯度,高压梯度,通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,等度洗脱与梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分
12、离, 加快分析速度； 改善峰形, 减少拖尾; 可能引起基线漂移,分配比变化范围宽的 复杂样品应采取 梯度洗脱方式分离,3 贮液瓶及流动相,1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。 2) 适用于所选择的检测器。 3) 化学惰性好，以免破坏固定相。 4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。 5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。,对流动相溶剂的一般要求,二 进样系统,准备状态 进样状态,六通阀进样 装置,自动进样器,三 色谱柱,内径：16 mm，柱长：530 cm； 柱填料粒径：5m,分离柱,四 检测系统,1 紫外吸收检测器,(a) 可变波长紫外检测器,(b) 二极管阵列检
13、测器,氘灯,光栅,流通池,测量光电二极管,参比光电二极管,2 二极管阵列检测器,两种检测器的色谱图 (a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器,(b),(a),紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。,一些常用溶剂的紫外截止波长,3 荧光检测器,灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。,4 示差折光检测器,利用组分与流动相的折射率之差进行检测。,通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。,5 化学发光检测器,6 电化学检测器,电导检测器 安培检测器,7 质谱检测器,3-5 高效液相色谱分离类型的选择,毛细管固相微萃取液相色谱法测定水中的多环芳烃 仪器
14、设备 高效液相色谱HP21050 (美国惠普公司) ,包括Rheodyne 7125 进样阀(20L) , 四元溶剂泵,紫外检测器。色谱柱为Hewlett Packard ODS hypersil (5m ,200 mm 4. 6 mm) 。 色谱条件: 流动相为乙腈水= 9010 (VV) ,流速0. 6 mLPmin。根据各待测物质的保留时间将检测器波长按时间程序设置为各物质相应的最大吸收波长(蒽:= 240 nm;荧蒽:= 236 nm;1 ,22苯并蒽:=287 nm) 。 进样器(25L , 500L) 购于美国Hamilton 公司,其针管部分可拆卸更换。进样器泵(美国Harvard Apparatus 公司) 用于控制进样器排出水样的速度。,3-6 高效液相色谱应用实例,