第十六章色谱分析法概论.ppt

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1、第十六章 色谱分析法概论 chromatography,色谱法的分类和发展 色谱过程和基本原理 基本类型色谱方法及其分离机制 色谱法基本理论,高分离效能 高灵敏 高选择性 分析速度快 应用范围广,色谱法的特点:,色谱学的重要作用,诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电 泳和吸附分析；1952年，英国马丁(Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。 应用的科学领域：生命科学、材料科学、环 境科学等。（科学的科学） 药学（药物分析）：各国药典收载了许多色 谱分析方法。中国药典二部，700多，纯 度检查、定性鉴别或含量测定，一部，600多鉴别或含量测定。,第一节 色谱法的分类和发展,

2、一、色谱法的分类 按流动相的分子聚集状态分类: GC、LC、SFC 等。 按固定相的分子聚集状态分类: GSC、GLC、LSC、LLC等。,按操作形式分类: 柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等。 按色谱过程的分离机制分类: 分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等。,二、色谱法的发展 （一）色谱法的历史 （二）色谱法的现状和发展趋势 1新型固定相和检测器的研制 2色谱新方法的研究 3色谱联用技术 4色谱专家,第二节 色谱过程和基本原理,一、色谱过程 实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationary phase)和流动相(mobile

3、phase)。 色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。,色谱过程,组分的结构和性质微小差异 与固定相作用差异 随流动相移动的速度不等 差速迁移 色谱分离。,二、色谱流出曲线和有关概念,色谱流出曲线 是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。 基线 是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器 (主要是检测器) 的噪音随时间的变化。 色谱峰 是流出曲线上的突起部分。 正常色谱峰、拖尾峰和前延峰,对称因子fs (symmetry factor) ： 衡量色谱峰的对称性,到20页,到19页,保留时间(retention time;tR)：从进样到某

4、组 分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。 死时间(t0)：分配系数为零的组分，即不被固 定相吸附或溶解的组分的保留时间。 调整保留时间( )：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附）的组分在柱中多停留的时间。,定性参数1,定性参数4 保留指数(retention index；I) : 在GC中，以正构烷烃系列作为组分相对保留值的标准，用两个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称为保留指数，又称Kovats指数，定义式：,z与z+n为正构烷烃对的碳原子数 ，Z为6，7，8，I为600，700，800,定量参数 峰高(peak height；h)：组分在柱后出现浓度

5、极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。 峰面积(peak area；A)：色谱曲线与基线间包围的面积。,返回,返回,柱效参数 标准差(standard deviation；)：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。越大，组分越分散；反之越集中。 半峰宽(W1/2)：峰高一半处的峰宽 W1/2=2.355 峰宽 (peak width；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。 W=4 或 W=1.699W1/2,总分离效能指标 分离度(resolution；R)：又称分辨率。是相邻两色 谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽

6、均值之比。,分离度,设正常峰，W1W2= 4 ， 则R=1.5时，99.7%面积(tR 3)被分开， tR =6 ，称 6 分离 。,三、分配系数与色谱分离,(一) 分配系数和容量因子 分配系数 (distribution coefficient；K) 是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相 (s) 与流动相 (m) 中的浓度 (C) 之比。,分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。,容量因子(capacity factor；k)：在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量(m)之比。（摩尔数？） 又称为质量分配系数或分配

7、比。,分配系数与色谱分离,还与固定相和流动相的体积有关。,容量因子与 分配系数的关系,分配系数与色谱分离,（二）分配系数和容量因子与保留时间的关系,（三）色谱分离的前提,KAKB 或kAkB 是色谱分离的前提。,分配系数与色谱分离,推导过程：,第三节 基本类型色谱方法及其分离机制,分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法,一、分配色谱法,分配色谱法,分离原理 利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。,溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质 (种类与极性) 有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。,分配色谱法

8、,固定相 又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。,流动相 气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。 液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。 正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定 相的极性。 反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定 相的极性。,分配色谱法,洗脱顺序 由组分在固定相或流动相中溶解度的相对大小而决定。,正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。（库仑力和氢键力）。,反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。,二、吸附色谱法,分离原理 利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。 吸附过程是试样中组分的

9、分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程 。,吸附系数与吸附剂的 活性、组分的性质和 流动相的性质有关。,吸附色谱法,固定相 多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。 硅胶表面硅醇基为吸附中心。 经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶 高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。 气相色谱：高分子多孔微球等,吸附色谱法,流动相 有机溶剂（硅胶为吸附剂） 洗脱能力：主要由其极性决定。 强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。 Snyder溶剂强度o：吸附自由能，表示洗脱能力。o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。,表 16-1

10、一些溶剂在硅胶上的o值,洗脱顺序 ka=KaSa/Vm 在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。 Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。,吸附色谱法,以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。 饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强 (但要考虑其他因素的影响) 。 不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸 附力越强。 分子中取代基的空间排列,分离原理 利用被分离组分离子交换能力的 差别而实现分离。 分为阳离子交换色谱法和阴离子交

11、换色谱法。 阳离子交换： 阴离子交换： 离子交换通式：,三、离子交换色谱法,离子交换色谱法,交换反应的平衡常数即选择性系数：,KA/B是离子对树脂亲和能力相对大小的度量，KA/B越大，A的交换能力大，越易保留。 常选择某种离子（如H+或Cl）作参考。 KA、 KB为A、B的分配系数。,离子交换色谱法,固定相 离子交换剂(ion exchanger)：离子交换树脂（resin）和硅胶化学键合离子交换剂。 离子交换树脂: 有网状骨架及可离解、可交换基团，如磺酸基 (SO3H) 、羧基 (COOH) 及季胺基 (NR3+OH) 等。性能指标常用交联度、交换容量和粒度等。 化学键合离子交换剂：键合在薄

12、壳型和全多孔微粒硅胶上。用于HPLC中的固定相,离子交换色谱法,流动相 一定pH和离子强度的缓冲溶液，有 时也加入少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋 喃、乙腈等，以提高选择性。,离子交换色谱法,影响保留行为的因素 被分离离子、离子交换 剂、流动相的性质等 (1) 离子的电荷和水合半径：价态高选择性系数大。同价阳离子在酸性阳离子交换剂上,水合离子半径, 选择性系数小。 稀溶液中阳离子在强酸性阳离子交换树脂上的交换顺序是： Fe3+Al3+Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Mg2+Zn2+Mn2+Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+,离子交换色谱法,常见阴离子在强

13、碱性阴离子交换树脂上的交换顺序通常为： 柠檬酸根PO43SO42I SCN Cl CH3COOOHF,保留顺序？洗脱顺序？,离子交换色谱法,(2)离子交换剂的交联度和交换容量:在一定的范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，则组分的保留时间越长。 (3)流动相的组成：交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。流动相的离子强度高，使组分的保留值降低。 流动相的pH：溶质的离解受到抑制则保留时间变短。弱离子交换树脂的交换容量在某一pH值有极大值。,四、空间排阻色谱法,分离原理 根据被分离组分分子的线团尺寸进行分离。 也称为分子排阻色谱法。,空间排阻色谱法,根据空间排阻（steric exclus

14、ion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态： 渗透系数： Kp =Xs/Xm （0Kp1 ） 由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。,空间排阻色谱法,固定相 多孔凝胶：软质、半软质和硬质 主要性能参数 平均孔径 排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量 分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。,空间排阻色谱法,流动相 要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低 水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gel filtr

15、ation chromatography；GFC)； 非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相 (凝胶渗透色谱gel permeation chromatography；GPC)。,空间排阻色谱法,保留体积与渗透系数的关系,VmV0,分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。,小结,色谱过程方程式： 分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。,K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp， Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积

16、、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。,小结,第四节 色谱法基本理论,要使R大，必须： 1、tR大- k大-热力学 2、W小-峰展宽小-动力学,色谱理论包括两方面: 热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（plate theory）。 动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（rate theory）。,一、塔板理论,始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。 分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。 色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。,塔板理论假定：,在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。 流动相间歇式

17、进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。 分配系数在各塔板内是常数。 纵向扩散可以忽略。,（一）质量分配和转移,1、单一组分B（kB=0.5）的分配和转移 设色谱柱的塔板数n=5，即r=0、1、2、3、4（或n-1）号。 将单位质量的B加到第0号塔板上。 分配平衡后，0号塔板内ms/mm0.333/0.667。 进入一个塔板体积的流动相（一次转移），,经过N次转移后，质量分布符合二项式(ms+mm)N的展开式。,如N=3，展开式为： (0.333+0.667)3=0.037+0.222+0.444+0.296,0 1 2 3号,在固定相和流动相中的质量分布由k(K)决定,转移N次后，第r号塔板中的质

18、量Nmr：,例：转移3次后，在第2号塔板内 的溶质分数,组分B(kB=0.5)在n=5的色谱柱内及出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.333 0.667 0 0 0 0 2 0.111 0.444 0.445 0 0 0 3 0.037 0.222 0.444 0.296 0 0 4 0.012 0.099 0.269 0.395 0.198 0 5 0.004 0.041 0.164 0.329 0.329 0.132 6 0.001 0.016 0.082 0.219 0.329 0.219 7 0 0.006 0.038 0.128 0.2

19、56 0.219 8 0 0.002 0.017 0.068 0.170 0.170 9 0 0 0.007 0.033 0.102 0.114 10 0 0 0.002 0.016 0.056 0.068,注意： 1、柱出口处的质量分数的计算。 2、质量（浓度）最大点的N，即保留体积。,2、两组分的分离,A(kA=1)和B(kB=0.5)两组分,组分A(kA=1)在n=5的色谱柱内和出口的分布 N r 0 1 2 3 4 柱出口 0 1 0 0 0 0 0 1 0.5 0.5 0 0 0 0 2 0.25 0.5 0.25 0 0 0 3 0.125 0.375 0.375 0.125 0

20、0 4 0.063 0.250 0.375 0.250 0.063 0 5 0.032 0.157 0.313 0.313 0.157 0.032 6 0.016 0.095 0.235 0.313 0.235 0.079 7 0.008 0.056 0.165 0.274 0.274 0.118 8 0.004 0.032 0.111 0.220 0.274 0.137 9 0.002 0.018 0.072 0.166 0.247 0.137 10 0.001 0.010 0.045 0.094 0.207 0.124,结果：,组分B: k=0.5, 当N=6和7时，柱出口产生B的浓度最大

21、点。 组分A：k=1，N=8和9时，柱出口处达到浓度最大点。,两组分开始分离， k小的组分B在柱后先出现浓度极大值, 即先出柱。,一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。 分配系数(容量因子)不等是分离的前提。,(二) 流出曲线方程,1.二项式分布曲线 以组分A在柱出口处的质量分数对N作图。,N 柱出口 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0.032 6 0.079 7 0.118 8 0.137 9 0.137 10 0.124,k=1的组分从n=5色谱柱中的流出曲线图,2.色谱流出曲线 当塔板数很大时，流出曲线趋于正态分布曲线。,3、色谱流出

22、曲线方程（正态分布方程） 描述组分流出色谱柱的浓度变化：,为标准差，tR为保留时间，C为任意时间t时的浓度，C0为峰面积A，即相当于某组分的总量。,t=tR时，C有极大值：,Cmax即流出曲线的峰高h。 一定时， 峰高h取决于C0。 C0一定时， 峰高h取决于。,流出曲线方程的常用形式：,不论ttR或ttR时，浓度C恒小于Cmax。 C随时间t向峰两侧对称下降。 越小，峰越锐。 是柱效的标志。,色谱峰面积,以A代替C0，h代替Cmax，且W1/2=2.355 ，,峰面积:,A = h(2)1/2,A=1.065W1/2h,色谱定量的参数,(三) 理论塔板高度和理论塔板数 (height equ

23、ivalent to atheoretical plate或plate height, H) (plate number, n),是色谱柱效参数。,理论塔板数与标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间的关系：,理论塔板高度 H =L/n,注意： 1.计算n时使标准差（峰宽或半峰宽）和保留时间单位一致 2.n的单位,例,在柱长2m、5%阿皮松柱、柱温100、记录纸速为2.0cm/min的实验条件下，测定苯的保留时间为1.50min，半峰宽为0.10cm。求该柱的理论塔板高度和每米的理论塔板数。,每米理论塔板数为： 2.4103/2=1.2103(m1),解：,有效理论塔板数和有效理论塔板高度,Hef =

24、L/nef,塔板高度的统计概念： 单位柱长引起的分子的离散度 H=2/L 2HL 是组分分子在色谱柱内离散的度量 2是总的离散程度，即单位柱长内 分子离散的累积,小结,塔板理论解释了流出曲线的形状 说明了组分的分配和分离过程 提出了评价柱效的指标 但某些假设与实际色谱过程不符,二、速率理论,塔板理论的不足： 组分在两相中不可能真正达到分配平衡； 组分在色谱柱中的纵向扩散不能忽略; 没有考虑各种动力学因素对传质过程的影响； 无法解释柱效与流动相流速的关系； 不能说明影响柱效有哪些主要因素。,速率理论,1956年，荷兰学者范第姆特(Van Deemter)提出了色谱过程动力学理论速率理论。,塔板高

25、度,涡流扩散项,纵向扩散项,传质阻抗项,H = A + B/u + Cu,涡流扩散(eddy diffusion) 也称为多径扩散,速率理论 (一)影响H 的动力学因数,涡流扩散 原因：柱填充不均匀 A=2dp,速率理论 (一)影响H 的动力学因数,A：涡流扩散系数，其单位为cm。 ：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形 状决定。 dp：填料 (固定相) 颗粒的平均直径， dp小， A小；但dp 太小， 和柱阻大。,纵向扩 (longitudinal diffusion),速率理论 (一)影响H 的动力学因数,组分向“塞子”前后扩散，使区带展宽。,原因：浓度差,纵向扩散项 B/u 影响因素：

26、u ， B=2Dm,B：纵向扩散系数，其单位为cm2/s。 ：弯曲因子，反映固定相颗粒对分子扩散的阻碍。 Dm：组分在流动相中的扩散系数。,速率理论 (一)影响H 的动力学因数,传质阻抗(mass transfer resistance),速率理论 (一)影响H 的动力学因数,传质：溶解、扩散、转移的过程。 传质阻抗：影响传质过程的阻力。 结果：（非平衡状态），使有些分子较快向前移动，而另一些滞后，引起峰展宽。 传质阻抗系数C，其单位s ，包括 Cm、Cs。,速率理论,速率理论 （二）流动相线速度对塔板高度的影响,A：不受 u影响 B/u： u, H Cu： （ Cm、Cs ） u, H,速率理论 （二）流动相线速度对塔板高度的影响,总结果： u 较低时： B/u主导， u,H, u 较高时：Cu主导，u,H, u 最佳,主要内容：,色谱过程和分离原理 基本概念和计算公式：保留值、分配系数、容量因子、n、H、R 色谱基本理论：塔板理论、速率理论 基本类型色谱机制,