克隆载体.ppt

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1、,第一节 载体简介 第二节 克隆载体* 第三节 人工染色体载体 第四节 表达载体,2019/4/17,2,2,概念：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体（Vector）;即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的DNA分子 一个DNA片段只有与合适的载体DNA连接构成重组DNA后，才能高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增 可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母人工染色体（BAC、YAC）等,2019/4/17,3,2019/4/17,3,能在宿主细胞中复制并稳定地保存-具复制原点(ori):在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能与携带的外源DNA一起复制

2、能与目的基因连接-具多个限制酶切点，而每一个这样的酶切位点在载体DNA中只有一个（广泛、特异） 便于筛选鉴定-具有标记基因，这种选择标记基因通常是抗抗菌素基因或某种酶基因，而宿主细胞并不具有 操作简单-分子量小,高拷贝数，转化效率高,容易从宿主细胞中分离纯化,作为载体的要求,2019/4/17,4,通常穿梭载体在细菌中用于克隆和扩增克隆基因，在真核细胞中用于基因表达分析,2019/4/17,5,2019/4/17,6,6,克隆载体类型,细菌质粒载体（10kb) 包括大肠杆菌和枯草杆菌质粒载体 噬菌体衍生载体(9-23kb) 柯斯质粒（Cosmid）载体(40-50kb) 一种由质粒和噬菌体co

3、s尾巴构建复合载体 M13载体 一类专门用于Sanger法测序的载体 Phagemid载体 一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体,2019/4/17,7,细菌质粒 载体,柯斯质粒 载体,噬菌体 载体,II,III,I,2019/4/17,8,I.细菌质粒载体,概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子 质粒是基因工程中最常用的运载体 而最常用的质粒是大肠杆菌的质粒,质粒的复制能在宿主细胞外完成吗？ 质粒的存在对宿主细胞有无影响？,2019/4/17,9,分类： F质粒（F因子或性质粒） R质粒（抗药性因子） Col质粒（大肠杆菌素因子

4、） 复制类型： “严紧型”的低拷贝复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与“松弛型”高拷贝复制质粒的（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 转移特征： 分转移性和非转移性两个特征 命名规则： pUC19 “p”表示质粒（plasmid） “UC”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称 “19”表示该质粒的实验编号,2019/4/17,10,质粒的生物学特性,寄生性，质粒的宿主范围很广 稳定性 自主复制性，质粒的拷贝数多 传递性 表型效应 可消除性 重组性 分子量较小 不相容性，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象 质粒能够“友好”

5、地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成,2019/4/17,11,质粒载体的修饰改造,去掉不必要的DNA区域, 只保留质粒复制必须部分，以提高外源DNA装载量 减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多，给克隆外源DNA造成不便 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子,2019/4/17,12,pBR322,质粒载体举例,常用的克

6、隆质粒载体: pBR322 pUC系列 pGEM系列,4363bp,2019/4/17,13,Ampr,Tetr,目的基因,Ampr,Te,tr,插入灭活四 环素抗性基因,pBR322,BamH,2019/4/17,14,pUC质粒系列 以pUC18/pUC19为代表,2019/4/17,15,pUC载体系统以pBR322为基础，去除了包括四环素抗性基因在内40的DNA，换用了M13噬菌体的476bp片段，内含LacZ基因的5-序列以表达半乳糖苷酶的片段，LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O， lacZ之内是M13的多克隆位点polylinker（multiple clo

7、ning site，MCS）。多克隆位点是含有多个限制酶的单识别位点的一段核苷酸序列 含有一个改进的pMB1复制子且具有很高的拷贝数 保留青霉素抗性基因Ampr，用来筛选细菌中载体的有无 使pUC载体成为具双功能检测特性的新型质粒载体系列：青霉素抗性检测、蓝白斑筛选(重组表型检测标记),2019/4/17,16,三个显著区别： 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝） 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选 多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成 其MCS区与M13mp噬菌体载体

8、的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究,2019/4/17,17,pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的序列（-互补肽）的DNA序列（标记为lacZ），多克隆位点就存在于lacZ上 -半乳糖苷酶的C端编码基因却位于相应的宿主菌上 只有当这两个部分基因产物（缺陷型-半乳糖苷酶）结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。这种机制称为-互补作用 比如pUC18/pUC19转化到含部分-半乳糖苷酶基因的细菌细胞中，就可以产生有活性的-半乳糖苷酶,蓝白斑筛选原理,2019/4/17,18,2019/4/

9、17,19,X-gal作为-半乳糖苷酶的指示剂。在诱导物IPTG存在下，-半乳糖苷酶催化 X-gal形成蓝色化合物，导致菌落呈现蓝色 如果在多克隆位点中插入外源DNA，打断了-半乳糖苷酶的部分基因，不再产生-肽链，就不能和宿主细胞产生的多肽片段结合生成有活性的-半乳糖苷酶，结果X-gal保持无色，菌落呈白色 检测结果：重组子菌落是白（无）色的，而空载体转化的菌落是蓝色的,2019/4/17,20,20,pUC18/pUC19与pBR322的比较,pUC载体具有双功能检测特性：氨苄青霉素抗性检测、蓝白斑筛选 pUC18/pUC19的检测是一个单步骤程序，可在一个平板上同时看到这个克隆的特征 抗氨

10、苄青霉素 当X-gal存在时，白色菌落是重组子，蓝色菌落是空载体转化子,2019/4/17,21,II.噬菌体载体,噬菌体简介 噬菌体载体 DNA作为载体的优点 噬菌体载体小结,2019/4/17,22,噬菌体（Bacteriophage, phage），细菌病毒一类的总称 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫” 由于噬菌体是专性活细菌细胞内的寄生物，所以凡是有细菌生存的地方，几乎都能找到相应的噬菌体的存在，这对利用细菌进行工业发酵生产的危害极大,1.噬菌体简介,2019/4/17,23,根据与宿主的关系，可分为 烈性噬菌体:仅

11、有溶菌生长周期 温和噬菌体:既能进入溶菌生长周期，又能在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA上,即进入溶源生长周期 噬菌体载体与质粒载体比较：结构比质粒复杂，但感染细胞比质粒转化细胞更为有效,噬菌体分类,2019/4/17,24,噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译 入侵E.coli后按裂解或溶原两种生活方式生存和繁殖 噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为溶菌 噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细

12、胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）,2019/4/17,25,噬菌体是一种温和噬菌体，由于它的遗传结构和宿主大肠杆菌的遗传结构研究得比较清楚，并能在细菌中大量繁殖，所以成为广泛采用的载体 噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25仍不失活，这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA 与质粒载体相比，噬菌体作为载体可以克隆更大一些的DNA片段，欲构件一个基因文库，往往可以减少文库中克隆的数量,噬菌体,2019/4/17,26,噬菌体的结构与应用,线性双链DNA病毒，具有末端互补的12nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48,531bp，含50多个基因,噬菌体可以容纳较大的目的基

13、因。例如用置换法可去掉长达20kb的DNA，换入相应长度的目的基因 基因文库构建常使用载体 不少先进的质粒应用组件进行构建,2019/4/17,27,为线性双链DNA分子， DNA两端各有一个互补单链的粘性末端，能通过碱基互补作用形成环状DNA分子。粘性末端形成的双链区域称为cos位点，它是包装蛋白的识别位点 左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因,2.噬菌体载体,头部基因组 尾部基因组 重组基因组 调节基因组 复制子 裂解基因组,2019/4/17,28,缩短长度 野生型DNA包装的上限为50.5kb，本身长度

14、为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒。其实DNA上约有40-50%的DNA片段是复制、裂解所不必需的，将之切除便可提高载量,A.DNA载体的构建,天然的DNA由于包装上下限的存在以及同种酶切口太多不适合作为重组实验的载体,2019/4/17,29,天然的DNA上有许多重复的酶切口，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切口必须被删除 在缩短长度时，有些多余的酶切口已被除去，但有些酶切口位于载体所必需的区域内，就不能用简单的切除方法去掉，必须用诱变方法，通过碱基改变而封闭酶切口,删除重复的酶切口,如加入lacZ 使

15、受体细胞在裂解之后形成蓝色透明圈,加装选择标记,2019/4/17,30,插入型载体: 仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如gt系列 只能插入较小的外源DNA片段（小于10kb） 替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点,B. 噬菌体载体分类,EcoRI,cos,cos,EcoRI,EcoRI,20Kb,cos,cos,LA,LA,RA,RA,2019/4/17,31,在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为22kb长，使用时用酶切开，分离去除这个22kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之 载体的容量比插入型载体大，有载装下限为10.4而上限为25.5kb。实际应用时不需要

16、标记基因，因为空载体DNA只有26kb，不能被包装，无法进入受体细胞 这类载体的使用较为繁琐，现在商品化的取代型载体已去除了中间片段（22kb）解决了这一问题,替换型载体,2019/4/17,32,简介：一种替换型载体 特点：能插入大的DNA片段（最大20kb） 具有包装下限（插入外源片段至少为12kb） 应用：主要应用于构建基因组文库,举例：Charon4,2019/4/17,33,C.DNA的体外包装,与外源基因形成的重组DNA分子在体外需人工包装成有感染活性的噬菌体颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化 包装蛋白通常分为头部和尾部

17、蛋白。当这两部分包装蛋白与重组DNA分子混合后，包装才能有效地进行 其中在A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（是包装蛋白），D蛋白（是插入蛋白）共同作用下使重组体DNA转入头部,2019/4/17,34,第十一章 载体,噬菌体为载体的 克隆过程,2019/4/17,35,3.DNA作为载体的优点,DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌 DNA作为载体，其装载外源DNA的能力可达25kb，远远大于质粒的装载量 它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建,2019/4/17,36,36,4.

18、噬菌体载体小结,特点: 线性双链DNA，两端有称为cos的互补单链（粘性末端） 进入细胞后可变成环状DNA分子 自主包装，对包装的DNA分子的长度有上下限 溶源与裂解 构建: 载体类型（插入型、取代型） 插入型载体在插入位点有一酶切口，取代型载体在取代位点有两个酶切口 加装选择标记,2019/4/17,37,III.柯斯质粒载体,2019/4/17,38,1.简介,柯斯质粒（Cosmid）载体又叫粘粒载体，这是一种由人工构建的含有噬菌体DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征，被称为cosmid，指带有粘性末端位点的质粒 柯斯质粒在结构组成上具有噬菌体

19、的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力，一般可插入3540kb的外源基因，是构建真核生物基因文库的主要载体,2019/4/17,39,构成：由噬菌体的cos区和质粒构成 特点： 带有抗药性基因，如Ampr、Tetr 含有噬菌体DNA的粘性末端cos位点，可像噬菌体DNA一样被噬菌体包装蛋白包装 具质粒复制起始位点，可像质粒一样在细菌中复制 具一个或多个限制酶酶切位点 分子量较小，但能容纳较大的DNA片段 粘性质粒较小，体外不能包装，但其重组体可体外包装,构成与特点,2019/4/17,40,与噬菌体DNA的差异,缺少噬菌体复制起点，进入细菌后不能像噬菌体一样复制 除COS位点外，基因组

20、的其余部分都被切割掉，具有高容量的克隆能力，最大可插入40-50kb的片段 柯斯质粒进入细胞后，质粒的复制子进行复制,2019/4/17,41,2.柯斯质粒的优越性,能象DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞 柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA，在真核基因克隆中十分有用，因为有可能同时携带具有真核基因编码序列及其调控序列 携带质粒的选择标记，便于筛选 有多种单一酶切位点，便于克隆,2019/4/17,42,42,3.柯斯质粒的应用 -构建基因文库,2019/4/17,43,载体,染色体工程的发展经历 酵母人工染色体 细菌人工染色体 哺乳类人工染色体,2019/4/17,44,遗传工程实

21、质上就是指个体间遗传物质的转移及其表达。这种转移可在不同的数量水平上进行,全部遗传物质转移-细胞杂交 整条染色体转移-微细胞介导的基因转移 染色体片段的转移-染色体介导的基因转移 DNA片段的转移-DNA介导的基因转移,遗传物质转移方式,2019/4/17,45,I.染色体工程的发展经历,染色体介导的基因转移（天然染色体片段） 染色质介导的基因转移（天然染色质片段） 人工染色体（ DNA重组技术产物）,2019/4/17,46,1.染色体介导的基因转移,McBride和Ozer首次证明纯化的染色体片段是对真核细胞进行基因转移的理想和天然的载体 受体细胞通常缺乏某一基因的正常功能 供体细胞的同源

22、染色体则具有该基因的正常功能 已使用的基因有：HPRT、嘧啶激酶基因、乳糖激酶基因、抗甲氨蝶呤（Mtx）基因、抗乌本因基因、抗鹅膏覃碱基因,2019/4/17,47,染色体是基因的天然载体，这个载体上，目的基因与他两侧的基因或序列是天然的遗传连锁，这种天然的片段进入受体细胞后，可以长时间存在。对目的基因有强大的保护作用 提高染色体工程的关键技术是: 把着丝点分离 克隆 然后与目的基因重组 并与组蛋白合成一个染色体片段,2019/4/17,48,染色体介导的基因转移的主要作用,用于染色体内的基因作图 用于分离或克隆一些特殊的基因 虽然DNA序列分析技术和基因克隆技术高度发展的后基因组时代以上用途

23、显得无用，但染色体片段作为真核细胞基因的天然载体，仍是诱人的课题,2019/4/17,49,2.染色质介导的基因转移,染色质作为转基因载体的提出 染色体介导基因转移由于不能控制所转基因的染色体或染色体片段的种类、数目和大小，故不能有选择的转移目的基因 1986年李振刚等提出了以染色质为介导的基因转移的工作。用活性模板染色质来转移预期基因（基因群）。从而弥补了基因工程的不足 与DNA相比，染色质是一种更为天然和稳定的转基因载体。便于整合，是基因打靶的理想载体,2019/4/17,50,活性模板染色质: 在生命活动的一定时空，只有一定数量的基因表达，这些正在表达的基因在染色质中的区域 活性基因:

24、这些正在表达的基因 如果从一定组织提取活性染色质，就会得到该组织的大部分活性基因，包括细胞中转录极少次数的基因 所以，对于真核生物来说，与DNA相比染色质片段是一种更为天然和更为稳定的转基因载体,2019/4/17,51,活性染色质作为基因载体 的特点与鉴定,染色质工程能选择性的转移基因，并可在不知道目的基因序列或其探针的情况下进行。且可获得一个复杂系统的全部活性基因。可对所有活性基因进行克隆（如YAC克隆，克隆等） 基因的鉴定 用已知基因的染色质片段进行共制备 用所得的活性染色质DNA与研究的染色质进行染色体原位杂交,2019/4/17,52,3.人工染色体-DNA重组技术产物,人工染色体,

25、酵母人工染色体（YAC）,细菌人工染色体（BAC）,哺乳类人工染色体（MAC）,由于其作为基因转移的天然载体，可转移连锁的基因群，故在此基础上发展了人工染色体,2019/4/17,53,YAC是酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段的载体 把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要部件都组装在质粒上，令质粒行使酵母的转录和复制功能 pYAC只以单抄本方式繁殖，所以不适用于以生产为目的的基因工程。要用于在酵母中构建大片段DNA文库特别用来构建高等真核生物的基因组文库，人类基因组研究和巨大基因如DMD基因达Mbp（106bp）数量

26、级基因的克隆，并不用作常规的基因克隆,II. 酵母人工染色体,2019/4/17,54,YAC的基本序列元件 YAC克隆系统的特点 YAC克隆技术路线 YAC的主要用途 YAC的缺点,2019/4/17,55,1.YAC的基本序列元件,酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）：染色体自主复制起点, 如ARS1 酵母复制起始子 酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）：保证酵母细胞分裂时染色体的分配 酵母染色体的端粒重复顺序（TEL）：（两端各一个） 维持染色体结构的稳定性,确保染色体完整性，维持染色体成为线状，保护染色体末端免受核酸酶侵袭,YAC载体为满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳

27、定的需要，必须含有以下元件：,2019/4/17,56,选择标记：用于重组克隆的筛选 在细菌和酵母菌中选择的标记基因,含有Amp大肠杆菌筛选标记；TRP1 色氨酸生物合成基因, URA3 尿嘧啶生物合成基因 克隆位点,YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因：如色氨酸合成酶基因trp 1和尿嘧啶合成酶基因ura3等,2019/4/17,57,简单地说，构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件 另外，染色体上还有供选择的标记基因；当外源DNA片段连接进两个臂中以后，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。通过选择标记人们可以从酵母宿主细胞中筛选出重组的人工染色体 实验

28、结果证明，每个YAC都可以装进100万碱基以上的DNA片段，这种大小比柯斯质粒的装载能力要大数倍，所以可以保证基因结构的完整性,2019/4/17,58,插入基因,着丝粒,端粒,端粒,自主复制序列,选择标记,2019/4/17,59,2.YAC克隆系统的特点,YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和分离完整基因的过程（200500kb，甚至1000kb） 用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC 酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境,2019/4/17,60,完整的染色体DNA的提取 基因组DNA酶切大片段的获

29、取 用于脉冲电泳（PFGE）的高分子量标记的制备 SCE法和EDTA法 目的DNA的酶切最适条件（控制内切酶量实现） 最适DNA大片段回收 YAC载体臂的制备 YAC臂与目的DNA大片段的连接 YAC重组体对酵母的转化,YAC克隆技术路线,2019/4/17,61,酵母原生质体的制备 YAC重组体对酵母的转化 YAC基因库的保存 YAC基因库的鉴定 高分子量标记的制备 随机挑取100个YAC转化子，制备完整DNA 脉冲电泳分离 Southern转移 标记探针 预杂交,2019/4/17,62,目的基因YAC克隆的筛选 PCR法对YAC克隆进行筛选 菌落原位杂交作为辅助手段进行筛选 目的基因YA

30、C克隆的鉴定 用目的基因的序列、pBR322和PCR产物微探针进行杂交鉴定,2019/4/17,63,4.YAC的主要用途,YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架: 可容纳大片段(100-1000 kb)的外源DNA，在构建基因组文库时需要较少的克隆 在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。相比于早期DNA载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体，成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(HAC)的研究 基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体

31、内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥,2019/4/17,64,5.YAC的缺点,插入片段大，稳定性较差，不易操作 插入的大片段常发生缺失，使文库不完整 YAC与酵母天然染色体分子结构相似，分离时难与天然染色体分开 文库中的嵌合现象严重 因插入片段大，往往发生序列重排，造成序列错乱,2019/4/17,65,III.细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome，BAC）,1992年Shizuya基于细菌性因子（F因子）的复制点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了高容量的第一代BAC人工染色体（350kb） BAC载体在

32、重组缺陷型（REC）宿主菌只有1个拷贝,有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组 F因子（100kb）又称致育因子，在细菌细胞内能自我复制，能整合到宿主染色体中。并能高频率的转移遗传标记。因其低拷贝特性使其重排和嵌合程度低。且F因子呈闭环结构，可以用常规技术从大肠杆菌中分离,2019/4/17,66,细菌人工染色体的结构,F因子的parA，parB，parC基因以保证单拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞 起始oriS基因，严密控制，决定低拷贝和起始 解旋酶基因repC，易于DNA复制和决定复制方向 选择标志基因Cmr氯霉素抗性基因 l

33、acZ基因颜色鉴别重组子，外源基因插入其中 loxP和cosN位点，易于克隆DNA回收和操作 在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段,2019/4/17,67,BAC基因组文库的构建,BAC载体的制备 BAC DNA的分离 BAC DNA经酶切（HindIII）线性化 去磷酸化反应 高分子量基因组DNA的制备 大分子量HindIII酶切片段的制备 脉冲电泳选择酶切片段 BAC克隆 电转化 AC克隆鉴定,2019/4/17,68,IV.哺乳类人工染色体,哺乳类人工染色体（MAC）则是以哺乳动物细胞作

34、为宿主细胞的人工染色体技术，作为异源DNA片段的载体，比YAC容量大。 哺乳类人工染色体比YAC大23倍 MAC的优点：能容纳更大的基因，维持基因的拷贝数，没有副作用，能长期调控基因表达 人类人工染色体（HAC）可用作基因治疗,2019/4/17,69,69,作为基因治疗理想的基因转移新载体，MAC有以下优点： 携带的外源基因容量大(500600kb)，可以满足几乎所有的单个基因的基因组DNA的需要 可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达 外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细胞基因组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在,2019/4/17,70,第四节 表达载体,在十一章内详细介绍,