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1、染色体G显带技术 及其原理,染色体G显带核型图,实验原理 (1),人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。,实验原理(2),研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹
2、，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。,Giemsa染料的发明者:Gustav Giemsa,实验原理 (3),关于G显带的机理目前有多种说法，例如，Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。,实验原理 (4),有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的
3、带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。,实验原理 (5),一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。显带方法的分子学基础涉及核苷酸碱基组成、相关蛋白和基因组功能结构。一般而言，吉姆萨阳性显带（G深带，R浅带）富含AT，复制较迟，基因较少；吉姆萨阴性显带（G浅带，R深带）富含GC，复制较早，基因较多；总的来说，G显带的机理还未搞清。,DNA核苷酸的组成,实验原理(6),非显带的标本上虽然可以根据染色体的形态识别1，2，3，16，17和18号，有时还可以识别Y染色体，但却不能有把握地鉴别其他大多数染色体。自1970年Caspersson等首次
4、报道用喹吖因对人体染色体进行染色可在各号染色体上显现出宽窄和位置不同带纹以来，细胞遗传学工作者以不同的染色方法为基础，提出了各种显带方法的名称。,实验原理(7),如用芥子喹吖因作为染料,染出的荧光带称为Q带,其方法称为Q显带法;用Giemsa作为染料,染出的带称为G带,其方法称为G显带法。同样用Giemsa或其他荧光染料作为染料，但在其中加上不同的预处理而获得的与Q带或G带着色强度正好相反的带称为R带，其方法称为反式显带法（R显带法）；将专一的显示“结构性异染色质”的方法称为C显带法，其带称为C带。其它一些显带技术还可以专门显示染色体的端粒（T显带）和核仁组织区（N带）等。,示中期染色体G显带
5、结果,示中期染色体R显带结果,示中期染色体C显带结果,示中期染色体N显带结果,G显带是最常用的，染色体经胰蛋白酶处理后，使染色体的蛋白质变性，然后用一种能结合DNA的化学染料吉姆萨染色，使染色体呈深浅不同的带型，人类的24种染色体可显示出各自特异的带纹。,实验原理(8),实验用品(1),1、材料： 常规方法制备的人外周血淋巴细胞染色体玻片标本(75中烤片3小时，未经染色 ),实验用品(2),2、器材： 显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、立式染色缸、镊子、香柏油、擦镜剂、擦镜纸,实验用品（3）,3、试剂： 1) 2.5胰蛋白酶原液 2) 0.85生理盐水 3) Giemsa储存液 4)
6、 115M磷酸缓冲液（1/15NA2HPO4、 1/15KH2PO4） 5) 蒸馏水,2.5胰蛋白酶原液的配制： 胰蛋白酶粉末（1:250）2.5g，100ml 生理盐水，过滤除菌，分装成1ml小瓶于 -20保存，用于消化细胞和染色体G显带标本的制作。,生理盐水的配制 氯化钠（NaCl）8.5g，加三蒸水至1000ml，用溶液瓶分装，高压灭菌9 磅，10分钟，可用于细胞培养。,Giemsa存储液的配制 Giemsa粉末1g加少许甘油混合研碎共计加入甘油66ml，充分混匀倒入烧杯中在5560水浴中加热2小时冷却加入甲醇66ml，充分混合在室温中静置23周，过滤贮存于棕色瓶中，可长期使用。,1/1
7、5mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS）的配制 甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO4 9.465g 蒸馏水 加至1000ml 乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液 KH2P04 9.07g 蒸馏水 加至1000m1 分装在瓶内，于室温保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液。,2SSC溶液的配制 用分析天平称取氯化钠17.53克，柠檬酸钠8.82克溶于蒸馏水中，加蒸馏水至1000毫升。,实验方法,(一) 胰蛋白酶消化法 (二) 胰蛋白酶EDTA法 (三)(Acetic-saline-Giemsa)法
8、,(一) 胰蛋白酶消化法,1. 准备常规方法制备的人外周血淋巴细胞染色体玻片标本，置75 烤箱中预热5分钟。 2. 在立式染色缸中加磷酸缓冲液100ml（ 115M NaH2PO4 80.8 ml ，KH2PO4 19.2ml)，再加入2.5的胰蛋白酶原液1ml配成终浓度为0.025的工作液。,(一) 胰蛋白酶消化法,3.将配好的胰蛋白酶工作液放入37水浴箱中预热。 4.将玻片标本浸入胰蛋白酶中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理11.5分钟（精确的时间自行摸索）。 5.立即取出玻片，放入生理盐水中漂洗两次。,(一) 胰蛋白酶消化法,6. 染色。将标本浸入37预温的Giemsa染液（将Giem
9、sa储存液3ml加蒸馏水47ml稀释即可）中染色10分钟左右。 7.自来水冲洗、自然晾干或吹干。,(一) 胰蛋白酶消化法,8. 镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。,(二)胰蛋白酶EDTA法,1. 将25ml生理盐水和25ml 0.02%EDTA溶液倒入立式染色缸内。 2. 取2.5%胰蛋白酶溶液l ml加入上液内混匀，滴入12滴1 M氢氧化钠溶液至上液中，使pH达7.07.2。 3. 将配制好的胰蛋白酶溶液置 37水浴箱中预热5分钟。,(二)胰
10、蛋白酶EDTA法,4. 取染色体标本片，置入胰蛋白酶溶液中，轻轻摇动60180秒。 立即在生理盐水中漂洗两次。 5. 以Giemsa 染色510分钟（37）后，用自来水冲洗、晾干。,(二)胰蛋白酶EDTA法,6. 镜检判断显带效果，在低倍镜下选择分散良好，长度适中的分裂相，再转至油镜下观察。若染色体边缘发毛，为显带过度；若染色体未出现带纹，则为显带不足。这时应根据具体情况再试一张标本片，适当增减胰蛋白酶处理的时间，直到满意为止。,(三)(Acetic-saline-Giemsa)法,1用甲醇、冰醋酸固定液固定，空气干燥法制片的标本。 2浸入2SSC溶液中，60温育1小时。 3蒸馏水冲洗。 41
11、/20 Giemsa 染液染色1 小时。 5水洗后凉干镜检。,注意事项,玻片完全干后，才可置油镜下进行观察。 每次显带均应做预实验处理，以决定正确的显带时间，不可盲目处理所有玻片。 显带效果的判断，应多观察几个长度适中的分裂相,不能仅凭1、2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间。,影响G显带的一些因素（1）,许多因素会影响G显带能否成功。因此并无一成不变的定规，人们如果能灵活地掌握这些因素，就照样会获得优良的效果。G显带成败之关键取决于胰蛋白酶的浓度和处理时间之搭配，但以下因素也有一定的影响：,影响G显带的一些因素（2）,制作标本的方法 火烧干燥法制得的标本对胰蛋白酶处理的抵抗力较气干法标本要
12、强些。 标本的年龄 标本保存的时间越长，细胞对胰蛋白酶处理的抵抗性越大。片龄很长的标本往往导致斑点状（而不是带纹）的染色体。,影响G显带的一些因素（3）,胰蛋白酶液中的盐类成分 溶液中的二价阳离子会使反应减慢，但并不能阻止这种反应。,影响G显带的一些因素（4）,胰蛋白酶液的温度 温度较高，这种反应的速度就较快。当然，在有空调的实验室中，最合适的温度是室温。胰蛋白酶的温度在进行显带之前应当稳定在室温至少30分钟。对于缺乏室温控制的实验室，也有把胰蛋白酶温度稳定在4的，有的甚至把胰蛋白酶液放在冰箱中。在温度较低的情况下，应当延长处理的时间。如能把所有条件稳定下来，则可得到一致的效果。,影响G显带的
13、一些因素（5）,胰蛋白酶处理的时间 这当然取决于上面所有这些因素，但一般推荐处理的时间不宜少于30秒钟。,影响G显带的一些因素（6）,无论是用胰蛋白酶法还是EDTA-胰蛋白酶法，均可得到良好而稳定的效果。中期分裂相中的绝大多数（有时超过90%）细胞都显示出良好的G带。为了在同一标本上显示不同的带型，例如Q带和G带，那末应当先作Q带，然后同一标本还可作C带染色。在摸索胰蛋白酶处理的时间时，可在同一玻片上分别摸索2-3个时间，经染色后即在镜下观察。如果细胞呈蓝紫色（与常规染色相似）说明胰蛋白酶的作用时间不够；如细胞的色泽为桃红色，那就差不多了。,染色体G显带失败标本的补救方法(1),染色体标本的G
14、显带是细胞遗传学最主要的显带方法。但G显带常常由于操作者的不当导致显带不够，不能进行准确的核型分析。在工作中，可用无水乙醇和甲醇：乙酸(3：1)固定液对由于胰蛋白酶消化时间短而致的失败标本进行重新处理。,染色体G显带失败标本的补救方法(2),无水乙醇脱色法 将未经油镜观察后无香柏油的标本片放人无水乙醇中漂洗12 min，放75烤箱烘烤10 min，取出后进行消化，消化时间掌握在原来所需要时间再延长12 min，染色时间不变。,染色体G显带失败标本的补救方法(3),甲醇：乙酸(3：1)的固定液脱色法 将经油镜观察后有香柏油的标本片放人甲醇：乙酸的固定液中浸泡1 h，取出后放75烤箱烘烤10 min，然后进行消化、染色。消化染色时间同无水乙醇脱色法。 参考文献: 赵伟，李文华，崔英霞.染色体G显带失败标本的补救方法.中华男科学，2004，10(4):312.,谢谢!,