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1、核酶 抗体酶,主讲 陈 惠,核 酶（Ribozyme),一、概述 二、剪接型核酶 三、剪切型核酶 四、核酶的应用 五、核酶技术面临的问题 六、脱氧核酶（deoxyribozyme),1、对酶及生物催化剂的认识的发展,一、概 述,克隆酶 遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、,Ribozyme,Deoxyribozyme,2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984年Altma
2、n等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得1989年度诺贝尔化学奖。,3、核酶作用的特点 化学本质 RNA 底物 RNA 肽键 -葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性）碱基 催化效率 低 产物,4.核酶的分类,二、剪接型核酶,剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron). 剪接型核酶分类 1、I类内含子 2、II类内含子,1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing),剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系 引导序列：IV
3、S中的6个嘌呤核苷酸序列 5CUCUCU3 3GGGAGG5 G结合位点:IVS 中的 P7茎区 空间结构,核酶是一种金属依赖酶,金属离子的作用： 1、特异的结构作用，或参与活性部位的 化学过程 2、促进RNA的总体折叠 3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成,2、类内含子的自我剪接,剪接机制 结构与功能的关系,三、剪切型核酶,1、自身催化剪切型RNA 1、1 剪切机制 1、2 结构与功能的关系 锤头结构 (Hammerhead) 发夹结构(Hairpin) 斧头结构(Axehead) 假结样结构(Pseudoknot-like) 1、3 影响核
4、酶活性的因素,2、异体催化剪切型RNA 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的5端，除去多余的序列，形成3-OH 和 5-磷酸末端。 RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。 体外： M1RNA具催化作用 蛋白质作为辅助因子 体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。 2、1剪切机制 Mg 2+ 2、2结构与功能的关系 M1RNA 5端完整结构对维持催化活性是必需的。,RNaseP可剪切前体5端41nt, 5端成熟。不同tRNA的 5 端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在RNaseP的组分内没有引导序列，
5、RNaseP所识别的是底物的高级结构。,RNaseP底物的二级结构,剪切位点,1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC 2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC 3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用 CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性内切酶作用 CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN,核酶在医学上的应用,1、核酶抗肝炎病毒的研究 目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以
6、及HDV作用的研究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶。 2、抗人类免疫缺陷病毒型（HIV- )核酶 1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶抑制HIV- 基因表达，并率先进入临床期。 3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的。,五、核酶技术面临的问题,1、核酶催化切割反应的可 逆性问题 2、提高催化效率 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5、增强核酶在细胞内的稳定性 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察,六、脱氧核酶的研究,1、体外选择技
7、术筛选脱氧核酶分子 脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。 2、脱氧核酶催化特征 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性 极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）,10-23型脱氧核酶作用机理,R Y R,RNA substrate,切割点,R=A or G Y=
8、C or U,deoxyribozyme,5,3,手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理,茎II (催化部位),茎I(结合部位),5,3,3 C A,切割点,10,20,30,40,p,3 HO-G,p,3,p,P-G,OH,p,P-G,3 HO,类内含子的剪接机制,Mg 2+或Mn 2+,GMP,GDP,GTP,外显子,内含子或居间序列（Intervening sequence,IVS),5,p,2 HO-A,p,p-A,p,3 OH,p,P-A,HO 3,类内含子的剪接机制,Mg 2+,套环的形成,5,3,外显子连接,B,A,A,5,B,B,A,B,A,PCR,PCR,5,5,5,Streptav
9、idin Column NaOH,cofactor,体外选择技术筛选具有自我裂解功能的DNA分子,N50(DNA分子库）,类内含子二级结构通式,保守序列,G结合位点,剪接部位,引导序列,类内含子有一个保守的二级结构： 结构域：两个保守内含子结构序列EBS1,EBS2与两个外显子结构序列IBS1,IBS2互相配对。 结构域：高度保守，催化活性必需。 结构域：A 提供2-OH,类内含子二级结构模式,5 3,5个环和4个螺旋形成两个结构域 剪切反应发生在底物识别序列GUC的5端 两个内部环中的碱基及在螺旋区的G11和底物中的G+1都是酶发挥作用所必需的。,5,3,发夹二级结构模型,剪切位点,HDV
10、RNA斧头结构模式,三个碱基对的茎 需要二价阳离子， 产生5-OH和 2,3-环磷酸,剪切部位,剪切部位,这类RNA进行自身催化的反应是只切不接。 特点：在 Mg 2+ 或其他二价金属离子存在下，在特定的位点，自我剪切，产生5-OH 和2，3-环磷酸二酯末端。,剪 切 机 制,核酶自身剪切反应,mRNA剪接过程,mRNA剪接反应是在剪接体（splicesome)上进行的. 5种snRNA 剪接体 50多蛋白质,锤头结构的 五种类型 R示酶，S示底物，箭头示剪切位点,建议的L19 RNA催化机理,锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价
11、金属离子参与。,单金属离子催化,双金属离子催化,锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图,三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3端自动发生,UCUAAA,IVS,GUAA,Pre-rRNA,UCU,A A A,GUAA,UCUoH3,5GAAA,GUAA,UCUUAA,5GAAA,GOH 3 G-IVS,L-19IVS,19nt,5,3,rRNA,5,3,5,pGOH,3,5,3,四膜虫rRNA前体自我剪接反应,CCCUCU O P,+,HOG 3,OA,o,o,o,CCCUCU OH,+,P-oG,o,Ao,o,过渡态,o,Mg 2+,Mg 2+,o,过渡态
12、,金属离子催化,锤头（Hammerhead)结构,二级结构模型 锤头二级结构编号 锤头结构的类型 锤头核酶的催化反应机制,17位（ X ）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G. 7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响,锤头二级结构编号,7位核苷酸,17位核苷酸,发夹（hairpin ）结构,发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶
13、高。,GUACGGCCGGU,GCCGGCUGGGG,CAUU,CCGAGGGGAC,CAA,GUAAUGGCUCCCCUG,c,CGG,GUCCAGCC,U U C C G C C U,CAGGU,AAGCG,3,5,剪切位点,HDV 核酶假结样结构,L3,L4,J1/2,J1/4,J2/4,四个螺旋区，三个连接区，两个环 活性中心区： J1/4, J2/4, L3 剪切位点：688/689,影响核酶活性的因素,1、pH值对活性的影响 pH70 - 7 5 时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应 4、变形剂对活性的影响 5、温度对活性的影响 在65范围内随温度升高而增加，37 时均有适宜的活性。,四、核酶的应用,一、在医学领域中的应用：,2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。,3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。,1. 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强。,二、在其他领域的应用,防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等,