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1、酶工程实验西北民族大学生命科学与工程学院柏家林 刘俊林仅供2008级生物工程专业和生物技术专业本科生试用前 言生物工程已成为发展最快、应用最广、潜力最大、竞争最为激烈的科技领域之一，也是最有希望取得关键性突破的学科之一。生物工程产业作为一个正在崛起的主导性产业，已成为产业结构调整的战略重点和新的经济增长点，将成为我国赶超世界发达国家生产力水平、实现后发优势和跨越式发展最有前途、最有希望的领域。 酶工程是生物工程的四大重要组成部分之一，是酶学和工程学相互渗透、相互结合发展而形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生的边缘学科。酶作为生物催化剂具有催化专一性好、效
2、率高、作用条件温和等优点，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、能源、环保、检测、生物技术等领域，深刻影响着许多重要的科学和实践领域。酶工程实验与教材内容紧密结合,旨在通过实验强化学生对课堂内容的理解和掌握。结合我院实验条件，酶工程实验选择了十三个实验，主要集中在酶及酶工程概论、微生物发酵产酶、酶的提取和分离纯化、酶活力测定、酶的固定化和酶的分子修饰等章节，基本上反映了教材内容。酶工程实验可作为生物技术、生物工程、食品生物技术、生物制药等专业学生的参考用书，也可供相关行业的技术人员参考。 编者 柏家林 刘俊林 二00九年十二月目 录实验一 酶促反应中初速度时间范围测定实验二 pH对酶活力的影响最
3、适pH的测定实验三 温度对酶活力的影响最适温度的测定实验四 米氏常数和最大反应速度的测定实验五 抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定及抑制类型的判定实验六 碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产实验七 溶菌酶的提纯结晶实验八 -淀粉酶活力测定实验九 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定实验十 溶菌酶的制备及活力测定实验十一 果胶酶的固定化实验十二 固定化酶活力测定实验十三 胆绿素还原酶的修饰与活性基团的鉴定实验一 酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, E
4、C 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1mol产物所需的酶量。要
5、进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到） 取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲
6、线中第11号管吸光度A405在0.60.7之间。（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。（4）0.3mol/LNaOH溶液2器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在2530C温箱中培养57d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，
7、透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35C恒温水浴槽中预热2min。然后向111号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L
8、 NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。3.数据处理以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量试管号12345678910110NPP（mL）稀释酶液(mL)反应时间（min）03M NaOH(mL)1.01.033.01.01.053.01.01.073.01.01.0103.01.01.0123.01.01.0153.01.01
9、.0203.01.01.0253.01.01.0303.01.01.0403.01.01.0503.01.01.0253.0五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实验二 pH对酶活力的影响最适pH的测定一、实验目的1.了解pH对酶活力影响的机理；2.掌握测定最适pH的基本原理；3.掌握最适pH测定方法。二、实验原理pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH。通常各种酶只在一定的pH范围内才能表现它的活性。一种酶在不同的pH条件下所表现出来的活性不同。pH之所以对酶活性有很大影响，可能是它改变了酶活性部位有关基团的解离状
10、态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适于酶与底物的结合。而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团的解离状态均不利于酶与底物的结合，酶活力也就相应降低。pH也可影响底物的解离及反应体系中其它组分的解离。缓冲体系中离子的性质和离子强度也可能对酶促反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有影响。过高或过低的pH都会改变酶的活性中心的构象，甚至改变整个酶分子的结构而使其变性失活。在保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的pH下测定酶活力，以pH为横坐标，OD405值为纵坐标作图，可得到一条pH酶活力曲线，从中就可求出最适pH。三、 试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶
11、液（2）酸性磷酸酯酶酶溶液将原酶液用水稀释10倍左右，使pH酶活力曲线中第六管OD405在0.60.7之间。（3）2.4mmol/L NPP水溶液精确称取NPP 0.8908g，用水溶解并定容至1000mL。（4）0.3 mol/L NaOH溶液。（5）各pH缓冲液0.05mol/L柠檬酸溶液。0.05mol/L柠檬酸三钠溶液。2器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。表2.1 各pH缓冲液配制0.05mol/L柠檬酸（mL）10082715947352311.5410.05mol/L柠檬酸三钠（mL）018294153657788.59699pH2.03.03.54.04.55.05
12、.56.06.57.0四、操作步骤1.酶促反应取11支试管编号，0号为空白。各加入2.4mol/L NPP 0.2mL，相应加入不同缓冲液各1.8mL，每管再各加入35C预保温（另取2支试管，各加入稀释好的酶液56mL，于35C恒温水浴槽中保温2min）的酶液1mL，立即摇匀计时，15min后加入0.3mol/L NaOH 2.0mL终止反应。2.测定OD405值0号管先加入0.3mol/L NaOH 2.0mL后再加入酶液，各管终止并冷却后测OD405，将结果按不同pH对应记录。3.数据处理以反应pH为横坐标，OD405为纵坐标，绘制pH酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶的最适pH。四、实验报告绘
13、出pH酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适pH。实验三 温度对酶活力的影响最适温度的测定一、实验目的1.了解湿度对酶活力影响的机理；2.掌握测定最适温度的基本原理；3.掌握最适温度测定方法。二、实验原理温度对酶的影响有双重作用。 一方面，温度加速酶促反应的速度；另一方面酶是蛋白质，温度升高会引起酶蛋白质的变性。因此，在较低温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增大，超过一定温度后，反应速度下降。酶促反应速度达到最大值时的温度称酶促反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中就可求得最
14、适温度。各种酶的最适反应温度是不同的，一般动物组织中各种酶的最适温度在3540C，植物和微生物中各种酶的最适温度范围较大，大约在3260C之间。但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。如果反应时间延长，一般最适温度降低。因此，对同一种酶来讲，应该说明是在什么条件下的最适温度。温度是影响酶促反应速度的重要因素之一。在温度较低时，绝对温度对Vmax的影响遵守Arrnenius公式：lgVmax=-Ea/2.3R(1/T)+常数式中，Ea 表示酶促反应的活化能，Jmol-1；R表示气体常数，8.314 Jmol-1K-1；T表示绝对温度，K；Vmax表示当酶
15、全部被过量底物饱和时所测得的反应速度。实验时，测定不同温度下酶促最大反应速度Vmax，以lgVmax对绝对温度的倒数1/T作图，得一斜率等于-Ea/2.3R的直线，由此可求得活化能Ea。三、试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（2）酸性磷酸酯酶酶液将原酶用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五管OD405值在0.60.7之间。（3）1.2mmmol/L NPP精确称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解定容至1000mL。（4）0.3mol/L NaOH2.器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。四、操作步骤1.酶促反应取8支试管，编号制表，0号管为空白。各管加
16、入1.2mmol/L NPP 1.0mL，另取8支试管加入酶液2mL。酶与底物对应在10C、20C、30C、35C、40C、50C、60C、70C恒温水浴槽保温2min。酶液预热时间不要超2min，否则酶易失活，特别是在温度较高时。预热后各管加入酶液1.0mL，精确反应15min后，加入0.3mol/L NaOH 3.0mL终止反应。2.测定OD405值0号管反应温度为50C，先加入0.3 mol/L NaOH 3.0mL后再加入酶液。各管反应终止并冷却后以0号管为空白，测定OD405值。3.数据处理以反应温度为横坐标，A680（代表反应速度）为纵坐标，绘制温度酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶在此
17、条件下的最适温度。以反应绝对温度的倒数（1/T）为横坐标，lgA405为纵坐标作图，求出直线部分的斜率，计算酶促反应的活化能。五、实验报告绘制温度-酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适温度；绘制Arrnenius图，计算本酶促反应的活化能。实验四 米氏常数和最大反应速度的测定一、实验目的1.了解米氏方程的含义及其重要意义；2.掌握测定米氏常数（Km）和最大瓜速度（Vmax）的基本原理；3.掌握Km和Vmax的测定方法二、实验原理在温度、pH和酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大影响。在底物浓度很低时，酶促反应速度（V）随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度继续增加，
18、反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax）。底物浓度与反应速度的这种关系可用米氏方程表示： =VmaxS/Km+S式中，表示反应速度；Km表示米氏常数；Vmax表示酶促反应最大速度；S表示底物浓度。从米氏方程可见，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位（mol/L或mmol/L）。在酶学分析中，Km是酶促反应的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。Km与底物浓度、酶浓度无关，与pH、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。测定Km、Vm
19、ax一般用作图法。作图法有很多种，最常用是的Linewaver-Burk作图法，该法是根据米氏方程的倒数形式，1/v对1/S作图。可得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax，可求出Km与Vmax。 三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（从绿豆芽中提取）（2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液（pH5.0）（3）酸性磷酸酯酶酶液 将原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五号管OD405在0.60.7之间。（4）1.2mmol/L NPP称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解并定容至1000mL.（5）0.3mol/L NaOH溶液
20、2.器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。四、操作步骤1酶促反应取10支试管按表4.1编号。15号加入各不相同的底物浓度样品，并设空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加入NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表4.1操作。精确反应15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应。表4.1 酶促反应各试管物质加入量12345678910空白管反应管1.2mmmol/L NPP(mL)0.20.40.60.81.00.20.40.60.81.00.05mol/L柠檬酸缓冲液（mL）1.81.61.41.21.01.81.61.41.21.0稀释酶液（mL）35C保温2mi
21、n1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.035C精确反应15min0.3mol/L NaOH(mL)2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02测定OD405值终止各管反应，待冷却后以15号管中相应底物浓度作空白，在可见分光光度计上测定OD405值。3数据处理通过测定，得到一组数据OD405，由于酶促反应产物对硝基盐离子在0.10.2mol/L NaOH溶液中，在405nm处的摩尔消光系数为18.8103，则OD405值与反应速度的换算为：（mol/L对硝基酚）/min=OD405/t106/18.8103测定液体积（mL）/1000 式中，OD405为每
22、管测定吸光度值；t为反应时间，min。 反应液中底物浓度换算式： S=XM/3 式中，X为底物加入量， mL; 3为反应液体积； M为加入时的底物浓度，mmol/L。 通过计算求得S，1/S，1/等值，然后作双倒数图，获取纵横截距，求出Km和Vm值。五、实验报告绘制1/-1/S直线图，计算Km和Vmax值。实验五 抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定及抑制类型的判定一、实验目的1了解抑条件下米氏方程的变化；2掌握不同抑制类型中米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的变化特点；3掌握米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定方法。4掌握不同抑制类型的判别方法。二、实验原理抑制剂是影响酶促反应
23、的因素之一，根据抑制剂与酶结合的特点可将其分为不可逆抑制和可逆抑制两种类型。其中可逆抑制又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种类型。1竞争性抑制酶不能与底物和抑制剂同时结合。酶促反应动力学特征为：米氏常数Km增大，Vm不变。2非竞争性抑制非竞争性抑制指抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，酶促反应动力学特征为Km不变、Vm下降。3反竞争性抑制抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此复合物不能分解为产物，酶促反应动力学特征为Km和Vm都发生变化（都变小）。三、试剂与器材1试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（从绿豆芽中提取）（2）0.05mol/L柠檬酸缓冲液
24、（pH5.0）（3）酸性磷酸酯酶酶液 将原酶液用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五号管OD405值在0.60.7之间。（4）1.2mmmol/L NPP精确称取NPP 0.4454g，用缓冲液溶解并定容至1000mL。（5）0.3mol/L NaOH溶液（6）10mmol/L KH2PO4溶液（7）3mmol/L NaF溶液2器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。四、操作步骤1酶促反应取20支试管按表5.1编号。1-5管加入各不相同的底物浓度样品，并设空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加入NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表5.1、表5.2操作。精确
25、反应15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液终止反应。2测定OD405值终止各管反应，待冷却后以1-5号管中相应的底物浓度作空白，在可见分光光度计上测OD405。3数据处理根据实验四数据处理方法，通过计算求得S、V、1/S、1/V、I等值。，然后作双倒数图，三条曲线作在同一坐标纸上，求出Km、Vm、Ki，并据此判定抑制类型。五、实验报告绘制1/V-1/S直线图，计算Km、Vm、Ki值。并判定本实验所属抑制类型。表5.1 非抑制条件下酶促反应各试管物质加入量12345678910空白管无抑制剂1.2mmmol/L NPP(mL)0.20.40.60.81.00.20.40.60.81
26、.010mmol/L KH2PO4（mL）-3mmol/L NaF(mL)-0.05mol/L柠檬酸缓冲液（mL）1.81.61.41.21.01.81.61.41.21.0稀释酶液（mL）35C保温2min1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.035C精确反应15min0.3mol/L NaOH(mL)2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0表5.2 抑制条件下酶促反应各试管物质加入量12345678910KH2PO4NaF1.2mmol/L NPP/mL0.20.40.60.81.00.20.40.60.81.010mmol/L KH2PO4/mL0
27、.30.30.30.30.3-3mmol/L NaF/ml-0.30.30.30.30.30.05mol/L 柠檬酸缓冲液/mL1.51.31.10.90.71.51.31.10.90.7稀释酶液/mL35C保温2min1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.035C精确反应15min0.3mol/L NaOH(mL)2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0实验六 碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产一、实验目标1了解聚氨酯软质泡沫塑料吸附固态发酵碱性蛋白酶的原理和碱性蛋白酶活性测定的基本原理；2学会蛋白酶活性的测定方法；3掌握吸附固态发酵生产碱性蛋白酶的方法。二
28、、实验原理1惰性载体吸附固态发酵的基本原理惰性载体吸附固态发酵既不同于传统的利用农作物产品为底物的固态发酵，也不同于液态搅拌通气发酵。在载体吸附固态发酵过程中，使用的载体材料可以是孔隙均匀一致的人工合成材料如聚氨酯泡沫塑料。这类材料与麸皮等农作物产品不一样，麸皮不仅颗粒大小不一，就是同一颗麸皮颗粒，其不同部位的组成和性质都存在着差异。而这类载体材料，不仅各处均匀一致，而且还可以根据需要在生产过程中调节其孔径大小。这样的载体在发酵过程中充当固相成分，它们对微生物的生长没有副作用，微生物也不能够分解利用这类材料生长。这种固相组成与农作物产品的固相组成相比，固态发酵过程中的微生物环境的均匀和一致性有
29、了较大地提高，微环境的多样性也明显降低，大大提高了发酵的效率。在惰性载体固相吸附发酵过程中，发酵液是微生物生长的营养来源。在配制发酵液时，可以像液态发酵的培养液一样进行精确调配，而且其中的营养成分处于易于被微生物利用的溶解状态，所以说，其又具有液态发酵的特点。在发酵液均匀吸附在惰性载体表面，整个发酵系统中形成比较稳定的、一致的、有利于微生物生长的界面环境，强化了发酵过程中氧、热等的传递过程。2碱性蛋白酶酶活力测定的基本原理根据福林试剂（磷钼酸和磷钨酸混合物）在碱性条件下被酚类化合物还原而且呈蓝色的反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨基酸及苯丙氨基酸等），
30、使蛋白质或其水解产物也呈这个反应，于是就可利用这个原理来测定蛋白酶活力的强弱，即以酪蛋白为作用底物，在一定pH及温度下，同酶液反应，经一定时间后，加入三氯乙酸，以终止酶反应，并使残余的酪蛋白沉淀，同水解产物分开，过滤后取滤液（即含蛋白质水解产物的三氯乙酸液）用碳酸钠碱化，再加入福林试剂使之发色，作分光光度计或光电比色计测定。蓝色反应的强弱同三氯乙酸中蛋白质水解产物的多少成正比，而水解产物的量又同酶活力成正比例关系。因此，根据蓝色反应的强弱就可以推测蛋白酶的活力。三、试剂与器材1菌种短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus），菌种用营养肉汤琼脂斜面培养基30C培养48h后于4C保存。2培养
31、基营养肉汤琼脂斜面培养基：1L水中加入蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，NaCl 5.0g，琼脂 15g。发酵液培养基：1L蒸馏水加入牛肉膏5.0g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5.0g。3试剂福林试剂，0.4mol/L碳酸钠溶液。4仪器用具恒温摇床，恒温培养箱，水浴锅，分光光度计，250mL三角瓶等。四、操作步骤1种子液制备在250mL三角烧瓶中加入50mL营养肉汤培养液，接种保存在营养肉汤琼脂斜面培养基上的菌种，在35C恒温摇床培养18h（200r/min）后，作为固态发酵的培养液。2固态发酵在250mL三角烧瓶中放入4.0g洗涤并烘干的聚氨酯软质泡沫塑料后在121C灭菌20min，冷却后
32、再加入已经按不同比例接种了的不同量的培养基，在无菌条件下用玻璃棒挤压聚氨酯软质泡沫塑料使发酵液与之充分而均匀地吸附。然后放在恒温培养箱35C恒温培养。3碱性蛋白酶提取及活力测定（1）提取 按发酵液与蒸馏水1：1的比例，将蒸馏水加入到载体吸附固态发酵的三角瓶内，提取和稀释发酵产生的酶，静置2h，然后把聚氨酯软质泡沫塑料中的提取液经过离心分离或挤出，作为测定酶活力的样品。（2）活力测定标准曲线的绘制。按表6.1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液。测定。 取上述不同标准浓度的标准溶液1.0mL，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL、福林试剂1.0mL，置于40C水浴中显色20min，在680nm下测吸光
33、度E，以不含酪氨酸的对照组为空白，以吸光度E为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。具体测定步骤如表6.2。酶活力计算。1个酶活力单位（U）指在40C、pH为10.5条件下，每分钟水解酪氨素产生1 .00g酪氨酸。 酪蛋白活力=E/（104N）式中，E表示样品中的E值，查标准曲线相应的酪氨酸质量，g;4表示4mL反应液取出1mL测定；N表示样品的稀释倍数；10表示反应时间。表6.1 酪氨酸溶液的配制试 剂管 号123456蒸馏水（mL）100g/L酪氨酸（mL）酪氨酸浓度（gmL-1）10008220644046602880010100表6.2 酶样品测定步骤步 骤对 照待 定1加预热
34、酶液1.00mL加预热酶液1.00mL2加三氯乙酸2.00mL030预热酪素溶液1.00mL440C下作用10min（精确）50加三氯乙酸2.00mL6预热酪素溶液1.00mL0740C下作用20min（精确），离心或过滤，取滤液作下列操作8取滤液1.00mL取滤液1.00mL9加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL10加福林试剂1.00mL加福林试剂1.00mL11以对照样为空白，测定等测样品的吸光度（E）四、 实验报告1绘制标准曲线，计算蛋白酶活力。2讨论吸附固态发酵法关键环节和应注意事项。注：福林试剂配制：于2000 mL磨口回流装置中加入钨酸钠100g、钼
35、酸钠25g 、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h。取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂50g、水50mL和数滴浓溴水，再微沸腾15min以去除多余的溴。冷却，定容到1000mL。湿匀，过滤，放在棕色瓶中。使用时，1份福林试剂与2份水混匀。实验七 溶菌酶的提纯结晶一、实验目的1.了解溶菌酶的基本性质；2.掌握从蛋清中分离提取溶菌酶的工艺和方法。二、实验原理溶菌酶（EC 3.2.1.17），又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是英国细菌学家Fleming于1922年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质，故命名为溶菌酶。鸡蛋清中溶菌酶分子的化学组成是由129个氨基酸残
36、基排列构成的单一肽链，有四对二硫键，相对分子质量为14833,呈一扁长椭球体，结晶形状随结晶条件而异，有菱形、八面体、正方形、六面体及棒状结晶等，人溶菌酶由130个氨基酸殘基组成，与鸡溶菌酶有35个氨基酸的差异，其溶菌活性比鸡溶菌酶高3倍。溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸如色氨酸的比例很高。pH在1.2-11.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，遇热也很稳定。pH在4-7,100C处理1min仍保持原酶活性；pH5.5,50C加热4h后，酶变得更活泼，热变性是可逆的，变性的临界点是77C，随溶剂的变化，变性临界点也有变化，当变性剂pH在1以下时，变性临界点降低到
37、43C，一般来说，变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时，酶的热变性就变为不可逆，在碱性环境中，用高温处理时，酶活性降低。吡唑、十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用，滤纸也能抑制酶活性，氧化剂能使酶钝化，在6mol/L的盐酸胍溶液中，酶完全变形，而在10mol/L尿素中酶则不变性，用乙二醇、丙烯二醇、二甲基亚酚、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等进行有机溶剂变性实验，在50C以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外，其他变性剂的浓度要在50%以上时才能引起溶菌酶的变化，氢氰酸能部分恢复酶活力。药用溶菌酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末，无臭、味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚，在酸性溶液中十分稳定，耐热至55C以上，最适
38、pH 6.6，等电点为10.5-11,常与氯离子结合成为溶菌酶氯化剂。生化制药主要用鸡蛋清或蛋壳水为原料制备溶菌酶。三、试剂与器材1鸡蛋，乙醇，无水硫酸钠，丙酮，磷酸，硫酸胺，氢氧化钠，淀粉，724树脂，砂糖，滑石粉等。2磁力搅拌器，恒温电热套，电炉，蒸馏装置，漏斗，滤纸，60-80目筛子，压片机，真空抽滤装置，透析袋，电动搅拌器，真空干燥箱等。四、操作步骤1工艺路线洗脱液724树脂（吸附），磷酸盐缓冲液（除杂蛋白）0-5C，pH6.510%硫酸胺（洗脱）分4次吸附物蛋清05C,pH6.5NaOH, NaCl, HCl(盐析)40%硫酸胺（沉淀）溶解湿溶菌酶透析液蒸馏水（透析）粗品粗品先pH
39、8.5-9, 后pH5.3溶解压片(制剂) 含片溶菌酶丙酮（干燥）0C2操作要点（1）原料处理新鲜或冰冻蛋清250g,用试纸测pH应为8左右，解冻过铜筛，除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。（2）吸附温度降低到5C左右，在搅拌中加入处理好的724树脂50g (湿重）,使树脂全部悬浮在蛋清中，保持在0-5C,搅拌吸附5h，再将蛋清在0-5C静置过夜。（3）去杂蛋白、洗脱、沉淀把上层清液渐渐倾出，下层树脂用清水洗去吸附着的蛋白质，反复洗4次，注意防止树脂流失，最后将树脂抽滤去水分，另取pH6.5、0.15mol/L磷酸盐缓冲液150mL分三次加入树脂，搅拌约15min，每次搅拌后减压抽滤除去水分
40、，再用10%硫酸胺200mL分4次洗脱溶菌酶，每次搅拌半小时，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加入32%（质量浓度）固体硫酸胺，使含量达到40%，此时会有白色沉淀产生，冷处放置过夜，虹吸上清液，沉淀离心分离或抽滤，得到粗制品。（4）透析将粗制品加蒸馏水50mL使之溶解，装入透析袋，0-5C中透析24-36h，除去大部分硫酸胺，得透析液。（5）盐析在澄清透析液中慢慢滴加1mol/L NaOH，同时不断搅拌，pH上升到8.5-9时，如有白色沉淀，应立即离心除去，然后在搅拌中加入3mol/L HCl，使溶液pH达到3.5，按体积缓缓加入5%固体NaCl，即有白色沉淀析出，在0-5C下放置48h。离心或
41、过滤得溶菌酶沉淀。（6）干燥沉淀加入10倍量冷至0C的无水丙酮，不断搅拌，使颗粒松散。冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，沉淀用真空干燥，直到无水丙酮脱尽。（7）制剂取干燥砂糖粉，加入总量5%的滑石粉，通过120目筛，加5%淀粉浆适量，在搅拌机内搅拌均匀，制成压片材料，12目筛制粒，55C烘干，用14目筛整理颗粒，水分以控制在2-4%为宜，再按计算量加入溶菌酶粉混合，加1%硬脂酸镁，过16目筛2次，压片机上制成溶菌酶口服含片，每片含溶菌酶20mg。3以蛋壳膜为原料的溶菌酶提取工艺取蛋壳膜用循环水冲洗后粗碎，加1.5倍量0.5%NaCl液，2mol/L HCl调pH至3，40C搅拌提取45min，过
42、滤，滤渣再提取2次，合并前两次滤液，提取液调pH至3，于沸水浴中迅速升温到80C，随即搅拌冷却，再用乙酸调pH至4.6，使卵蛋白在等电点发生沉淀，离心或过滤，上清液用NaOH调节器pH至6，加入5%聚丙烯酸（pH3）搅拌均匀后静置15min，倾去上层浊液。收取粘附于容器的溶菌酶-聚丙烯酸凝聚物，再悬溶于水中，加碳酸钠溶液调pH至9.5，溶解凝聚物，再加入聚丙烯酸用量1/25的50%NaCl溶液使溶菌酶解离，用2mol/L盐酸调pH至6，离心分离上清液（沉淀用硫酸处理除去硫酸钙，回收聚丙烯酸），将上清液用NaOH调pH至9.5，离心除去Ca(OH)2,取上清液加入CaCl2到5%，静置结晶，粗结
43、晶溶于pH4.6乙酸液中，除去不溶物进行再结晶即得溶菌酶结晶。每千克蛋壳膜可得结晶溶菌酶近1g。五、注意事项1注意原料卫生，防止细菌污染变质，不要掺入蛋黄和其他杂质，避免影响酶回收率和树脂的吸附能力，操作全过程要在低温（0-10C）条件下进行，以防止蛋清发酸变质而使酶失活。2树脂再生、转形要彻底，以提高回收率。转型后再用0.15mol/L、pH6.5磷酸盐缓冲液平衡过夜，平衡液的pH要保持在6.5，用过的树脂可用NaOH及浓盐酸直接浸泡、再生和转型后，再用缓冲液平衡。3溶菌酶的洗倍峰较宽，有拖尾现象，可用三氯乙酸检查洗脱液，如沉淀不明显应另行收集，用作下资助洗脱用。4透析液加碱去杂蛋白时，碱液应均匀加入，勿使局部浓度过高而造成酶失活。六、结果与讨论1称重计算溶菌酶的得率。2讨论影响溶菌酶得率的因素。3试分析提取溶菌酶所用树脂的选择原则。实验八 -淀粉酶活力测定一、实验目的学习和掌握测定-淀粉酶活力的原理和方法。二、实验原理淀粉经淀粉酶作