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1、第四章 赖氨酸发酵过程优化1第一节 赖氨酸发酵概述1一、研究背景1二、发酵法生产赖氨酸技术的发展1三、本章研究的目的和主要内容3第二节 赖氨酸生产菌FB42的获得5一、引言5二、出发菌株FB21的遗传特性5三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究6四、赖氨酸产生菌FB42的获得8五、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响10六、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基12第三节 连续培养中FB42菌株的动力学特性及其代谢流分析15一、引言15二、连续培养中的操作特性15三、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性17四、FB42的真实转化率19五、赖氨酸发酵的最大理论转化率19六、黄色短杆菌 FB42的代谢流
2、分析23第四节 分批发酵过程的控制及分批发酵动力学25一、引言25二、初糖浓度对发酵的影响25三、溶氧对发酵的影响26四、pH对发酵的影响28五、发酵过程的溶氧与pH控制28六、赖氨酸分批发酵动力学30七、分批发酵动力学模型的评价34八、分批发酵的模型分析35第五节 赖氨酸流加发酵的最优控制37一、引言37二、最小值原理简介37三、连续系统的最小值原理38四、流加发酵系统的最优化问题40五、流加发酵最优控制的算法41六、赖氨酸流加发酵的优化控制45第四章 赖氨酸发酵过程优化第一节 赖氨酸发酵概述一、研究背景 1889年Drechsel用酸水解干酪素，经分离谷氨酸后在不含氯化物的水解液中加入硝酸
3、银得到一种碱性物质，其组成为(C6H13N2O2AgNO3HNO3)，后来被证实为赖氨酸和精氨酸的混合物。1891年Fisher和Drechsel 分别从干酪素的水解液中得到纯的赖氨酸(C6H13N2O2OHPtC15)。此后，Fisher于1902年确证了赖氨酸的化学组成。赖氨酸的分子结构中含两个氨基和一个羧基，是一种碱性氨基酸。 赖氨酸名列八种必需氨基酸之首，被认为是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的功效大大提高。如玉米中添加0.4%的赖氨酸，玉米蛋白的功效提高2.1倍；大米中添加0.2%的赖氨酸，大米蛋白的功效提高1.7倍等。赖氨酸的应用范围很广：作为食
4、品强化剂，对儿童的发育、智力，妇女妊娠期的保健、病人的治疗及病后的恢复都有明显的效果；作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。 赖氨酸是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品。按配合饲料中0.1%的平均添加量计，仅饲料用赖氨酸，国内需求量2000年和2010年将分别达到8万吨和10万吨。但我国赖氨酸工业发展缓慢。1992年年产饲料用赖氨酸4959吨，到1994年约6000吨，1997年接近2万吨，但仍远不能满足市场需求，需要大量进口
5、。所以，从供需情况来看，我国赖氨酸市场前景看好。也正如此，近年来，赖氨酸工业化生产成了国内一些投资者的兴趣之一。国内需求增加而供应不足是导致赖氨酸市场大起大落的内因，国际市场的冲击则是外因。在我国赖氨酸工业薄弱的情况下，国内赖氨酸市场乃至整个赖氨酸工业易受国外大集团的控制。因此，迅速提高我国的赖氨酸生产水平，发展赖氨酸生产能力意义重大。二、发酵法生产赖氨酸技术的发展(一)赖氨酸的生产方法概述 赖氨酸的生产方法有：水解法、合成法、酶法和直接发酵法。赖氨酸最早由蛋白质的水解而制成，目前在赖氨酸的工业化生产中水解法已经淘汰。以己内酰胺、二氢吡喃、环己酮、呱啶为原料合成L-赖氨酸已有报道。但因合成法制
6、成的中间体为D，L-赖氨酸，进一步的分离工艺很复杂，美国Allied和联邦德国Deguess公司多年来从事L-赖氨酸合成法的研究，至今未见大规模的生产报道。 见诸报道的酶法生产赖氨酸工艺有(1)合成e-苯甲酰-a-乙酰-DL-赖氨酸，采用消旋酶处理制成e-苯甲酰-L-赖氨酸，经酸水解得产品；合成DL-4-氨基丁基乙内酰脲，采用微生物酶使其转变为L-赖氨酸；由环乙烯合成DL-氨基己内酰胺采用水解酶和消旋酶共同作用使其变成L-赖氨酸。其中，第三种工艺已用于赖氨酸的工业化生产。该法的发明者富村隆最初找到了可水解L-氨基己内酰胺的罗伦隐球酵母(Cryptococcus Laurenti)，然后又发现具
7、有DL-氨基己内酰胺消旋酶活性的新细菌无色杆菌(Achomobater obeaa)，通过这两细菌的共同作用，DL-氨基己内酰胺可被转化为L-赖氨酸，该法得率高，适于大规模生产。富村隆研究的酶法生产赖氨酸工艺，在学术和工业上都得到了较高的评价，1980年曾获日本科学技术奖。日本东丽株式会社1976年使用上述合成酶法生产工艺制造赖氨酸，至今已形成年产8000吨规模。但总的来说，酶法对原料成本的依赖性很大。发酵法生产赖氨酸原料来源广泛，且生产的赖氨酸均为L-型，因此在赖氨酸的生产中发酵法占据主导地位。目前世界上赖氨酸的年产量已突破20万吨，主要厂家列于表4-1-1，其中90%以上的企业采用发酵法。
8、表4-1-1 世界主要赖氨酸生产厂家公司厂址规模(万吨/年)制法味之素日本，九州佐贺县2.0发酵法协和发酵日本，山口县防府1.5发酵法哈特兰德赖氨酸公司美国，依阿华州2.0发酵法生物协和发酵美国，蜜苏里州开普吉拉多1.36发酵法ADM公司美国，依利诺斯州迪凯特4.7发酵法亚吉诺莫托公司美国，北卡罗来纳州罗利不详发酵法欧洲赖氨酸公司法国，亚眠2.0发酵法日本味之素泰国公司泰国，曼谷0.2发酵法东丽公司日本，名古屋0.8酶法费埃尔麦克斯墨西哥0.6发酵法协和与匈联营公司匈牙利，布达佩斯东0.5发酵法塔拉戈纳化工公司西班牙，巴伦西亚得塘湖安0.6发酵法台湾糖业公司台南市0.4发酵法南斯拉夫，伏伊伏丁
9、那日蒂什泰2.6发酵法拉托维亚，利瓦尔1.32发酵法合计21.58(二)发酵法生产赖氨酸 微生物的赖氨酸合成途径1950年以后逐渐被阐明。Cilvery等首先报道了肠杆菌属的一株代表菌结肠芽胞杆菌赖氨酸的合成途径，随后椎尾男等研究了黄色短杆菌赖氨酸的合成途径，Tosaka等对乳糖发酵短杆菌的赖氨酸合成途径进行了研究。对生物赖氨酸的合成途径解析后发现：赖氨酸的合成与其它氨基酸不同，存在两条途径即二氨基二酸途径和a-氨基乙二酸途径，前者存在于细菌、绿藻、原生质、高等植物中，后者存在于酵母霉菌中。 1957年，日本开始采用野生菌株发酵生产谷氨酸，1960年用谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型变异株生产赖氨
10、酸。60年代中期，我国开始赖氨酸发酵菌株和工艺条件研究。1974年中科院微生物研究所诱变谷氨酸生产菌北京棒杆菌AS 1.229得到营养缺陷型变异株AS 1.563，产酸17.9 g/L，进一步诱变得到AECr变异株，产酸达50 g/L。70年代后期，上海、黑龙江、广西和江苏等地积极开展赖氨酸菌种筛选工作，如上海天厨味精厂得到AECr和高丝氨酸缺陷双突变株，产酸3637 g/L；中科院微生物研究所和常州味精厂合作筛选到产酸4853 g/L的钝齿棒杆菌，通过发酵中试技术鉴定。上海工业微生物研究所从黄色短杆菌2030出发经一系列诱变筛选得到抗性和营养缺陷型双突变株，其中的FH-128菌株在16 L小
11、罐发酵70 h产酸130 g/L以上，5 m3罐中试发酵6569 h，产酸92.295 g/L，转化率为40.2 %左右，达到国际先进水平，但至今未有工业化报道。 广西南宁赖氨酸厂于80年代投产后，与广西生物化工研究所协作一直进行赖氨酸生产菌改良和发酵工艺改进，得到分别以糖蜜和淀粉糖为原料的高产菌株，以淀粉糖为原料30 L罐发酵产酸120130 g/L左右，该厂还获得了可耐高温生产菌，37 下发酵，赖氨酸产量基本不受影响。无锡轻工大学80年代初就开始赖氨酸生产菌选育和发酵工艺研究，从谷氨酸产生菌AS 1.495诱变得赖氨酸产生菌F11-519，产酸57.4 g/L。再经原生质体融合和化学、物理
12、诱变等手段得到多重变异株FB21，摇瓶产酸70 g/L，这在80年代末为国内领先水平，但未进行发酵中试和工业化。 总之，国内赖氨酸发酵研究起步较早，实验室研究水平也不低，但高产菌实现工业化比例较低；另外，研究多局限于菌种改良和优化发酵的环境条件，对各种培养条件下的优化控制研究不多，或与实际生产脱节。(三)我国赖氨酸发酵工业现状 20世纪80年代初，国内开始进行赖氨酸发酵中试，并兴建赖氨酸发酵厂，特点是产酸水平和转化率低、规模小。“七五”期间，国家在广西南宁、福建泉州、湖北武汉及吉林九站建了四套年产1000吨的赖氨酸生产装置。武汉制药厂因无原料早已改产，吉林九站的装置长期生产不正常，已停产。广西
13、南宁赖氨酸厂于1987年投产，现增至6000吨/年的生产能力，并计划于“九五”期间扩大到1万吨/年的生产能力，但在近期赖氨酸销售价格大幅度回落的情况下，其扩建计划受到了影响。福建泉州赖氨酸厂1989年与正大集团合资后改名为“泉州大泉赖氨酸有限公司”，生产能力为5000吨/年左右，使用国外菌种和技术。四川川化味之素公司是中日合资企业，赖氨酸生产能力为6000吨/年，使用日本菌种和技术。 以上三家企业为我国最主要的饲料用赖氨酸生产厂家，其总生产能力也不过略高于1.5万吨/年，而仅美国ADM公司年产赖氨酸就达12万吨以上；而且，其中只有广西一家是拥有自己的菌种和技术的国内赖氨酸生产企业，该厂主要以糖
14、蜜为生产原料，产酸达到80 g/L以上，对糖转化率38%左右，在国内属先进水平，但跟日本等国的赖氨酸生产水平(日本味之素公司发酵法生产赖氨酸盐酸盐浓度为120 g/L左右，转化率可达50 %)相比尚有很大差距。年产赖氨酸千吨以上规模的还有上海天厨味精厂，其产品主要作药用，但目前已停产。 我国赖氨酸行业的特点是总生产能力小、企业规模小、生产水平低，因而发展困难。在这样的情况下，国内赖氨酸市场难免易受国际市场冲击，而且将来可能受外国企业的控制，目前国内主要赖氨酸生产厂家中合资企业占很大比例即是一个信号。所以应尽快发展我国的特别是我国自己掌握全套生产技术的赖氨酸生产能力，使赖氨酸产品最终能象谷氨酸那
15、样具有完整、强大的工业生产体系。三、本章研究的目的和主要内容 1987年以前，我国饲料用赖氨酸全部进口，主要来自日本味之素公司。1987年8月，广西赖氨酸厂的产品投放市场，但不能满足国内的需求。90年代以后，世界上赖氨酸产量最大的美国ADM 公司的产品进入中国市场，1992年我国进口赖氨酸9672吨。根据我国饲料工业的发展计划，1995年需求赖氨酸1.21.3万吨，到2000年增加至2.5万吨。这样一个广阔的市场，其技术、产品一旦掌握在他人手里，对国家未来的发展极为不利。我国赖氨酸生产技术虽然取得了长足的进步，但与国外先进水平相比仍有差距(表4-1-2)。因此实现我国赖氨酸工业化生产的低消耗、
16、低生产成本、高效率，建立起具有竞争力的生产体系是一个迫切需要解决的问题。 发酵是赖氨酸工业的心脏，发酵水平的高低是工厂的命脉。提高发酵水平有两条途径：一是筛选出优良的菌株，二是得出与目的菌株相匹配的最佳培养条件、控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究上的菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程控制技术。只有两者紧密地结合才能最终实现发酵的高水平，而后者正占据着越来越重要的地位。例如，味之素公司的研究人员曾报道，乳糖发酵短杆菌变异株AJ11204在摇瓶条件下48 h产赖氨酸为4.3%，但在小型发酵罐中，通过控制培养条件，48 h产酸水平可提高到7%。如此类似的结果不仅在赖氨酸研究中
17、，而且在其它发酵产品的研究中也时有报道。表4-1-2 我国与日本发酵法赖氨酸生产(商业规模)技术指标对照 生产技术指标日本我国产酸水平 / %104.56.5转化率 / %5035提取率 / %86957190工厂最大规模 / 万吨年-11.50.3生产成本比值12电耗 / kwht-1160022009117 我国学者对赖氨酸的研究长期以来都把工作重点放在高产菌株的选育上，有关如何对发酵过程进行优化与控制的研究较少。实际生产中所需的一些培养控制条件、技术指标往往在摇瓶条件下获得，这种低水平的研究方法客观上制约了菌种潜力的进一步发挥。不仅如此，由于在摇瓶条件下无法对目的微生物生理生化特性、营养
18、供给及操作、发酵设备三者之间建立起有机的联系，当反应器规模发生变化时发酵结果常常不能重复。而这一点正是国内发酵法生产赖氨酸从60年代中期开始研究至今，多次出现随生产规模扩大(从摇瓶到中试至大生产)过程中发酵水平降低的根本原因所在。 实现发酵过程的最优化，使菌种的潜力充分发挥，是发酵技术的一个最高境界。国外有关发酵过程最优化的研究非常活跃，这在我国还几乎是一个空白，不能不说是一个遗憾。在赖氨酸发酵的最优化研究方面，虽然1973年就有了关于流加发酵最优化的研究报道，1985年Lim等进一步完善了最优化理论，并针对赖氨酸发酵进行了讨论，但所有这些研究所讨论的问题仅仅是最优控制的数学求解，而对赖氨酸发
19、酵过程的动力学解析相对缺乏，由此所得出的控制方法的适用性值得怀疑。发酵过程的最优化的研究。必须从微生物反应过程的定量解析入手，由于其中所涉及的理论问题非常广泛，从文献资料报道来看，目前真正针对某一具体发酵产品进行过程控制最优化的研究，并成功用于指导实践的报道几乎没有。考虑到国内赖氨酸的高产菌株多集中于黄色短杆菌，我们选用黄色短杆菌作为研究菌株，在小型反应器上对黄色短杆菌发酵生产赖氨酸的过程进行定量的解析，以实现流加发酵的最优化为目的展开研究，具体分为以下几部分： (1)在所提供出发菌株的基础上，通过常规诱变获得一株赖氨酸产生菌FB42，并在摇瓶条件下对可能影响起代谢的环境因子进行了考察，对发酵
20、条件进行了优化。 (2)以连续培养作为研究手段，考察了微生物的菌体生长、产物形成及基质消耗特性。通过对代谢途径进行定量的质、能衡算，得出了赖氨酸的理论转化率。进一步比较理论转化率和FB42真实转化率之间的差异，对FB42的代谢流进行分析，据此得出对工艺研究有指导的一些理论依据。 (3)在小型反应器中对影响赖氨酸形成的一些重要环境因子进行定量的考察，找出目的微生物的生理生化特性、营养源供给与反应器特性之间的内在联系，得出最适的操作条件。在此基础上进一步对发酵过程的动力学进行研究，建立出合理的动力学模型，为流加发酵的最优化研究打下基础。 (4)在动力学研究的基础上对发酵进行最优化操作。包括：状态方
21、程的建立、目标泛函的确定、最优化流加方式的求解。并通过实验对最优化操作进行检验，达到理论和实践的统一。第二节 赖氨酸生产菌FB42的获得一、引言 20世纪50年代以后赖氨酸的微生物合成途径逐步被阐明，在此基础上的代谢控制发酵的研究非常活跃，以选育营养缺陷型及多重结构类似物抗性突变株为主的常规育种技术，给赖氨酸发酵工业奠定了基础。我们曾于1988年选育出一株赖氨酸产生菌FB21，该菌株的产酸当时为国内领先水平，后研究工作一度中断，菌种退化很多，因此有必要对其遗传标记进行检查，并进一步提高其产酸能力。另一方面，在摇瓶条件下，易于考察各营养因子对微生物代谢的影响，选择出合适的培养基组成，同时可进行一
22、些初步的优化工作，为以后的研究打下基础。二、出发菌株FB21的遗传特性赖氨酸产生菌黄色短杆菌(Bervibacterium flavum)FB21是由无锡轻工大学经多年筛选于1988年获得，诱变谱系见图4-2-1，其中FB16到FB21是经原生质体诱变。据报道，FB21菌株在糖浓度为18%下发酵88 h，产酸达到7%，为当时国内领先水平。图4-2-1 黄色短杆菌FB21的诱变谱系 本研究出发菌株FB31是由FB21的保藏斜面中接出，经复壮、分离、纯化后获得。由于FB21保藏时间过长，所获得的FB31其遗传特性极有可能发生改变，FB21的主要遗传标记为Leu-Thr-AECrAHVr，对这四种标
23、记进行鉴定，发现FB31菌株的生长需要Thr和Leu 。在不含Leu 的培养基中FB31菌株完全不生长，表现为Leu 缺陷型；在不含Thr的培养基中，FB31菌株能微弱生长，但生长不充分，表现为Thr生长需求型(也可称为代谢渗透缺陷型)。在AEC浓度为10 mg/L时，FB31菌株的生长几乎不受影响；在AHV浓度为2 mg/L时，FB31的相对生长为50%，这些均和FB21的报道相一致。通过遗传特性的鉴别可以看出，FB31基本上保留了FB21的遗传标记，但Th标记发生了改变，由缺陷型变为需求型，FB31的主要遗传标记为Thr-、AECr、AHVr。三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究(一)种
24、龄的确定适宜的种龄应是菌体处于对数生长的中后期。这是因为处于对数生长期的菌体接种进行发酵是能迅速生长，有利于缩短发酵周期。而且对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于保持高的接种量。图4-2-2为FB31种子培养的生长曲线，从图中可以看出培养进行到1719 h时，FB31菌株处于对数生长期末，所以选择种龄为1719 h。图4-2-2 FB31菌株在种子培养基中的生长曲线(二)接种量对发酵的影响 培养1719 h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中，实验结果如表4-2-1所示，表明接种量以5%为好。表4-2-1 不同接种量对发酵的影响接种量/%135810产酸/gL-134.538.841.8
25、36.034.4 进一步研究发现最适的接种量很大程度上与种子的生长情况有关，实验结果如表4-2-2所示。当种子OD值为0.180.20时接种量以5%为好；当种子OD值较低，如OD值为0.085时，接种量则以8%为宜。表4-2-2 种子OD值不同时接种量对发酵的影响1719 h种子OD值0.0850.1850.20接种量/%585858产量/ gL-134.641.141.335.042.035.1 事实上由于温差、斜面接种量波动或其它因素的影响，种子培养1719 h后OD值的发生改变是很难免的，而且有时会相差很大，这时可以通过改变接种量，或延长种子培养时间来调整，以获得最佳的接种效果，保证发酵
26、的稳产高产。(三)初糖浓度对发酵的影响 如表4-2-3所示。当初糖浓度为13%时发酵的转化率最高，初糖浓度进一步提高时对发酵不利，特别当初糖浓度为18%时FB31几乎不产酸，可见菌株不具备耐高糖的特性。表4-2-3 初糖浓度对发酵的影响初糖浓度/ gL-1105.0128.0148.0178.0产酸/ gL-1 32.641.642.017.2转化率/%31.032.528.39.6(四)发酵培养基的优化 FB 31的发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等。碳源主要由葡萄糖提供；玉米浆、豆饼水解液、(NH4)2SO4用以提供氮源；无机盐有磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙，其中碳酸钙除用作钙盐外
27、主要是起pH缓冲作用，使得发酵过程pH不致过低。固定培养基组成为葡萄糖13%、磷酸氢二钾0.1%、七水合硫酸镁0.05%、碳酸钙4.5%，考察了玉米浆、豆饼水解液和硫酸铵对发酵影响，选用L34正交表，结果如表4-2-4。表4-2-4 正交实验结果实验号豆饼水解液玉米浆(NH4)2SO4产酸(g/L)11(0.5%)1(2.5%)1(3%)21.022(1.0%)2(3.0%)2(4%)42.033(1.5%)3(3.5%)3(5%)31.0412238.0523122.0632133.0713224.0821336.0932130.0K128.030.024.0K233.037.033.0K3
28、31.026.035.0极差5.011.011.0表4-2-5 方差分析表方差来源偏差平方和自由度均方F值显著性豆饼水解液5.5122.7623.0*玉米浆20.47210.2485.3*硫酸铵21.43210.7289.3*误差0.3220.12总和47.738F0.01(2,2)=99.0F0.05(2,2)=19.0 从正交实验结果可以看出，豆饼水解液、玉米浆、硫酸铵浓度的变化对发酵都有显著的影响。豆饼水解液和玉米浆用以提供有机氮和FB31生长所必需的氨基酸，因此添加量过少对发酵不利，但过高的添加量也会使产酸下降，这可能是因为在过多的添加量下发酵液中其它氨基酸浓度的增大对FB31菌株合成
29、赖氨酸有抑制作用。此外，从实验结果来看，玉米浆浓度过高对发酵尤为不利，这可能是因为玉米浆除用以提供有机氮外，还含有大量菌体生长所必需的因子，在过高的玉米浆浓度下，菌体生长过旺不利产酸。对黄色短杆菌的赖氨酸发酵，硫酸铵是最好的无机氮源，有结果表明提高硫酸铵的浓度有刺激产酸的作用。本实验结果表明对于FB31的赖氨酸发酵，硫酸铵浓度有一最佳值为4%，当硫酸铵进一步提高对发酵影响不大。 实验得出FB31菌株发酵培养基的最适组成为(g/L )：葡萄糖130、玉米浆30、豆饼水解液10、硫酸铵40、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙45。用该培养基发酵72 h，产酸为42 g/L，和菌株FB 21相
30、比其产酸性能下降很多。 保持高产菌株遗传性能的稳定，防止回复突变，是发酵工业生产中一个非常重要的问题，目前通常采用的一些方法有： (1)选育遗传性能稳定的菌株：经诱变处理后，在易出现回复突变株的培养基中反复传代，选出不发生回复突变的菌株。 (2)定向赋加生产菌的遗传标记：如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；对于抗性株，尽量选育多重抗性突变株。 (3)在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物，抗性株可添加适量的抗性物质。 (4)必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。 通过前面的研究可以发现，虽然FB31是从FB21的保藏斜面中接出，但其遗传标记发生了改
31、变，比较FB31和FB21的发酵性能来看，FB31退化较为明显，主要表现在两方面：一是产酸水平的降低，二是耐高糖性能的降低，表明菌株发生了回复突变。为此对FB31菌株进行了诱变，希望提高其产酸性能。四、赖氨酸产生菌FB42的获得(一)黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制根据文献报道，黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-2-3所示。氨基酸的代谢途径主要有三条：(1)从葡萄糖经丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸；(2)从葡萄糖经草酰乙酸和a-酮戊二酸到谷氨酸；(3)从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。图4-2-3 黄色短杆菌氨基酸合成示意图丙酮酸羧化酶；磷酸烯醇式丙酮酸羧
32、化酶；天门冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；丙酮酸-L-丙氨酸转移酶；a-酮戊二酸脱羧酶；天门冬氨酸-b-脱羧酶；高丝氨酸脱羧酶反馈抑制；反馈阻遏 黄色短杆菌的赖氨酸合成途径，即上述第三条途径，存在着严格的调节机制，正常的细胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。该调节机制由下面几种作用共同完成。 谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶(GD)的活性，使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使得天门冬氨酸不致大量积累。 赖氨酸的前体物天门冬氨酸与乙酰CoA的生成形成平衡合成(Balance Sythesis)。乙酰CoA的增加能逆转天门
33、冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 天门冬氨酸激酶(Aspartic acid Kinase, AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。研究表明天门冬氨酸激酶是一个变构酶，该酶催化天门冬氨酸和ATP形成a-天门冬氨酸磷酸，有两个变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置上时，酶活受到强烈抑制。此外AK在赖氨酸合成调节中有着重要的意义，研究表明AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。赖氨酸分支途径的其它酶，如第一个专一性酶二氢吡啶二羧酸合成酶，末端产物如赖氨酸或其它氨基酸单独或组合对该酶无抑制作用，且
34、该酶也不受赖氨酸的反馈阻遏。 赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁(Metabolic Interlock)，赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成的过剩就会阻遏高丝氨酸-O-转乙酰酶，使得生物合成的代谢流转向苏氨酸。苏氨酸比赖氨酸优先合成，苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝氨酸脱羧酶的活性，使得生物合成转向赖氨酸。(二)赖氨酸产生菌的育种策略 长期自然选择的结果，使得生存下来的微生物具有严格的代谢调控机制，其胞内的每一步反应速度，以及通过各种途径的代谢流基本平衡，从而能以最经济、有效的方式合成氨基酸、核酸、脂肪酸、维生素等基础物质，这些物
35、质在体内几乎不积累。发酵工程要求微生物大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻，最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。 结合黄色短杆菌的赖氨酸合成途径和代谢调控机制，相应的育种策略可归纳为： (1)切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。 (2)解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对天门冬氨酸激酶反馈抑制脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除，这是赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养缺陷型兼具结
36、构类似物抗性的突变株，极有希望获得高产菌株。表4-2-6列举了赖氨酸发酵育种中曾用过的结构类似物，其中以AEC效果佳、应用广。表4-2-6 赖氨酸发酵育种中曾使用过的一些结构类似物类别结构类似物名称使用缩写赖氨酸结构类似物S-(2-氨基乙基)-L-半光氨酸AECg-甲基赖氨酸ML苯酯基赖氨酸 CBLa-氯乙内酰氨CCLa-氟乙内酰氨FCLa-氨基月桂基内酯氨ALLL-赖氨酸氧肟酸LysHx苏氨酸结构类似物a-氨基-b-羟基戊酸AHV 邻甲基苏氨酸OMT 苏氨酸氧肟酸ThHx亮氨酸结构类似物a-噻唑丙氨酸 a-TA亮氨酸氧肟酸 LeuHxa-噻唑亮氨酸 a-TLb-羟基亮氨酸 b-HL天门冬氨酸
37、结构类似物天门冬氨酸氧肟酸 AspHx磺氨二甲嘧啶 磺氨胍 SG(3)增加前体物的生物合成：关键酶AK所催化的底物是天门冬氨酸，AK的反应速度与底物天门冬氨酸浓度之间的关系呈S型，随着天门冬氨酸浓度的增加，AK与天门冬氨酸的亲和协同性增大。根据变构酶的S型动力学特性，为了提高赖氨酸的产量，应设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。应此可以考虑选育丙氨酸缺陷型，抗天门冬氨酸结构类似物的突变株。(4)解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁，应此可以考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。(三)赖氨酸产生菌FB42的获得在不含苏氨酸的选择性培养基上得到5
38、0株苏氨酸完全缺陷的突变株，在抗性平板上得到200株LysHx抗性突变株，经初筛、复筛后得到FB41和FB42。同出发菌株FB31相比，FB41和FB42产酸分别提高23%和19%。诱变谱系见图4-2-4。图4-2-4 FB 42菌株的诱变谱系(四)FB42菌株对LysHx和AHV的抗性检验 FB42是在添加AHV和LysHx的筛选平板上获得，因此具有对AHV和LysHx的抗性，在LysHx为4mg/L时，FB42的相对生长仍为80%，而此时FB31几乎不生长；此外FB42对HV的抗性也有所增加。(五)FB41和FB42的传代实验 对FB41和FB42进行反复传代，测定其赖氨酸合成能力，结果发
39、现(表4-2-7)，FB42遗传、发酵性能稳定，是一支较好的赖氨酸产生菌，因此进一步对影响FB42产酸的环境因子和发酵条件进行了研究。表4-2-7 FB41和FB42菌株的传代实验代数12345678菌株FB41产酸/ gL-15250514945434342菌株FB42产酸/ gL-15049514948504850五、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响(一)苏氨酸和亮氨酸对产酸的影响 FB42菌株为亮氨酸缺陷型和苏氨酸需求型，所以发酵过程中必须添加苏氨酸和亮氨酸，图4-2-5和4-2-6反映了苏氨酸和亮氨酸对FB42菌株生长和产酸的影响。 实验培养基为(/L)：葡萄糖100 g、硫酸铵35
40、 g、尿素2.5 g、磷酸氢二钾1 g、七水合硫酸镁0.4 g、七水合硫酸铁10 mg、一水合硫酸锰8 mg、D-生物素 50 ug、硫胺素200 ug、碳酸钙 40 g，亮氨酸和苏氨酸的浓度按实验要求定。 图4-2-5 苏氨酸对菌体生长和产酸的影响 图4-2-6 亮氨酸对菌体和产酸的影响 从图4-2-5中可以看出当苏氨酸浓度150 mg/L 时，就能满足菌体生长的要求，实验范围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生长有抑制作用。对产酸而言，苏氨酸浓度有一合适的值，其范围在100350 mg/L之间，苏氨酸浓度过高对FB42产赖氨酸有抑制作用。对比一下本文的结果可以发现，FB42和FB21菌株相比(
41、1)菌体生长所需的苏氨酸浓度降低了；(2)苏氨酸对产酸的抑制作用也有所减小。这从一个侧面也说明：(1)由于FB42菌株为苏氨酸需求型但不是完全缺陷，其自身可合成少量的苏氨酸，因而对苏氨酸的需求要比FB21(苏氨酸缺陷型)少；(2)FB42对苏氨酸结构类似物AHV的抗性较FB21有所增加，故而苏氨酸对菌体赖氨酸合成的抑制作用得到缓解。 图4-2-6反映了亮氨酸对FB42菌体生长和产酸的影响，可以看出亮氨酸对菌体生长和产酸的影响是相似的，最适生长和产酸浓度为400600 mg/L。(二)生物素的浓度对产酸的影响 生物素影响到细胞内细胞膜的合成，生物素过量的情况下会导致细胞中更多磷脂分子的合成。对于
42、谷氨酸发酵，这种作用会影响Glu-Asp运输系统向胞外运送谷氨酸，因而在谷氨酸发酵中控制亚适量的生物素浓度被作为一种提高产酸的重要策略。对于赖氨酸发酵而言，抑制谷氨酸的分泌可以使得代谢流转向赖氨酸的合成，且赖氨酸的分泌与Glu-Asp运输系统无关，因此高的生物素浓度应该是有利的。实验发现生物素浓度必须大于250 ug/L。在发酵培养基中添加生物素对产酸影响不大，分析可知：发酵培养基中含有3%的玉米浆(玉米浆中生物素的浓度为150ug/L)，折算成生物素的含量为450ug/L，满足了菌体大量分泌赖氨酸的要求，因此玉米浆在发酵培养基中除作为有机氮源外，还提供发酵所需的生物素。图4-2-7 生物素对
43、产酸的影响(三)金属离子对产酸的影响 许多金属离子都是微生物代谢途径上酶的激活剂或是辅助因子。如Mn2+是许多酶的激活剂；Fe2+是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶中活性基因的辅助因子；Mg2+是糖酵解途径中许多酶的激活剂。此外钾离子对产酸的影响也很大，据文献报道，钾离子对保持菌体活力，防止菌体衰老，提高产酸能力起着相当重要的作用。也有文献报道铜离子浓度为50 mg/L时，可以提高产酸。 实验考察了镁、钾、锰、铁、铜离子对产酸的影响(表4-2-8)，发现：钾离子和镁离子对产酸有促进作用，最适的添加量分别为1 g/L和0.5 g/L(以磷酸氢二钾和七水合硫酸镁计)；铁离子和镁离子对产酸影响不大；而铜离
44、子对产酸有抑制作用，尤其当铜离子大于20 mg/L 时几乎不产赖氨酸。表4-2-8 金属离子对产酸的影响离子浓度/ gL-1产酸/ gL-1离子浓度/ mgL-1产酸/ gL-1K+以K2HPO4计0.525.2Fe2+131.21.032.1232.11.531.1430.42.030.1831.1Mg2+以MgSO47H2O计0.226.3Cu2+2030.20.532.040未检出1.031.560未检出1.529.280未检出Mn2+1 mg/L31.22 mg/L30.14 mg/L32.08 mg/L30.2 注：发酵培养基除实验离子外其它为(/L)：葡萄糖100 g、硫酸铵35 g、尿素2.5 g、磷酸氢二钾1 g、七水合硫酸镁0.4 g、七水合硫酸铁10 mg、一水合硫酸锰8 mg、D-生物素500 ug、硫胺素 200 ug、Thr 200 mg、Leu 400 mg、碳酸钙 40 g。六、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基 响应面分析(Response Surface Analysis，RSA)方法是数学与统计学相结合的产物，和其它统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目