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1、 第三章 限制性内切核酸酶一、填空题1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是 的酶。基因工程中把那些具有识别 的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。2. 年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的 现象。3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为 ，这是第一个分离到的类限制性内切核酸酶。4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的 。5.类限制性内
2、切核酸酶分子量较小一般在2040kDa，通常由亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数类酶也可作用于单链DNA，或DNARNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，类酶既具有 专一性，也具有 专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有 ，产生 末端的DNA片段或 的DNA片段。作用时需要作辅助因子，但不需要 和 6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是： 和 7.类限制性内切核酸酶一般识别 个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有 倾向，即它们在识别序列中含
3、量较高。8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_ 分子量是300kDa.在这些亚基中，亚基具有 作用；亚基具有 的活性;亚基的作用则是 ，9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫 10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自 ，第二、三两个字母取自 ，第四个字母则用 表示。11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5-GRCGYG-3，其中R ，Y 12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是 和 13.部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。14.第一个分离的限制性内切核酸酶是 ；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是 1
4、5.限制性内切核酸酶BsuRI和Hae的来源不同，但识别的序列都是 ,它们属于 。16.由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理沦值应该是 17.SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是 。18.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是 。19.类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的切割位点的识别结合有两种模型，一种是 ，另一种是 。20.限制性内切核酸酶通常保存在 浓度的甘油溶液中。二、判断题1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它足通过
5、对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。2.限制性内切核酸酶在DNA中的识别切割位点的二级三级结构也影响酶切效率, 一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍，3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaII和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是个连锁图6.用限制性内切核酸酶Hae分别切割载体D
6、NA和供体DNA后，可用E.coli DNA连接酶进行连接。7.已知某内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3个片段。8.迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。9.基因工程中使用的类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性10.DNA多态性就是限制性片段长度多态性。11.用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后，再用外切核酸酶Exo进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。12.甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘
7、油的浓度控制在5以下。13.具有EcoR末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRlI末端的载体中。14.从Esherichia coliK中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK。15.同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端都是相同的，16.在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。17.稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。三、选择题(单选或多选)1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这系统中的核酸酶都是n类限制性内切核酸酶 (c)
8、这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统2 .RFLP产生自( ) (a)使用不同的限制性内切核酸酶 (b)每种类型的染色体有两条(二倍体) (c)染色体中碱基的随机变化 (d)Southern印迹 (e)不同探针的使用3.型限制性内切核酸酶:( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供4.型限制性内切核酸酶： ( ) (a)由两个亚基组成，仅
9、识别半甲基化位点。甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下游)决定了DNA是被甲基化还是被限制 (b)不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制 (c)由两个亚基组成，在识别位点附近识别并进行甲基化或限制 (d)在错配修复中起关键作用，因为酶结合到DNA上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别 (e)是光依赖型酶，是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶，它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂5.分析限制性内切核酸酶切割双链DNA所得到的DNA片段的长度有助于物理作图。这是因为：( ) (a)即使只用一种限制酶，因为DNA是线性的，所以也可以迅速确定限制性片段序列(b
10、)内切酶在等距离位点切割DNA，同时对于每个生物体的长度是特异的(c)DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长,而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱(d)这些内切酶的消化活性是物种特异的(e)这技术同时为核苷酸序列提供了广泛信息6.通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( )(a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的个(b)它利用限制性位点作为遗传标记(c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的(d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。(e)限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内7.限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )
11、(a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术(b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别(c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别(d)两种物种个体间的限制性图谱差别(e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别 8.为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。(a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳) (b)必须从单倍体细胞(配子)中分离DNA，这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息 (c)必须进行单个染色体分析，这只能在细胞分裂后期进行 (d)必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶 (e)必须首先分离核DNA和细胞器DNA，然后对它们分别作图9.下面有关
12、限制酶的叙述哪些是正确的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是内切酶 (b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割 (c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 (d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端 (e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端10.因研究入噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( ) (a)J.Lederberg (b)WArber (c)H.Smith (d)FSanger11.第一个被分离的类酶是： ( ) (a)EcoK (b)Hind (c)Hind (d)EcoB12.双链DNA中一段自
13、我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征：（ ） (a)有对称轴 (b)两条链的5-3方向的序列相同 (c)是类酶的识别序列 (d)可增强基因的表达13 在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好？ (a)反应时间 (b)酶量 (c)反应体积 (d)酶反应的温度14 在下列试剂中，那种可以螯合Ca2+离子?( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠 (c)SDS (d)EGTA15 在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1单链核酸酶 (b)末端转移酶 (c)碱性磷酸酶 (d)Bal31核酸酶16 限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( ) (a)双链DNA
14、的特定碱基对 (b)双链DNA的特定碱基序列 (c)特定的三联密码 (d)以上都正确17 在下列酶中，催化反应不需要ATP的是( ) (a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA连接酶 (d)BamHI18 下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( (a)Sau 3A I (b)EcoR I (c)hind (d)Sau 3A 119 限制性内切核酸酶的星号活性是指：( ) (a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快 (d)识别序列与原来的完全不同20 下面哪种不是产生星号活性的主要原因?( ) (a)甘油含量过高 (b)反应
15、体系中含有有机溶剂 (c)含有非Mg2+的二价阳离子 (d)酶切反应时酶浓度过低21 DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因哪一项不太可能?( ) (a)酶失活 (b)蛋白质(如BSA)同DNA结合 (c)酶切条件不合适 (d)有外切核酸酶污染22 关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的 (a)是限制性内切核酸酶的识别序列 (b)是某些蛋白的识别序列 (c)是基因的旁侧序列 (d)是高度重复序列23 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当 (a)由作用于同DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰
16、酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统四、简答题1 现分离到X82噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的DNA，请设计个实验，初步鉴定是点突变、插入突变还是缺失突变?2 说明SangerDNA测序法的原理。3 在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?机理是什么?4 Fredfick和McClarin等用一个由13个碱基对的DNA片段与EcoRl反应，然后分离到酶和DNA共结晶的复合物，通过X射线分析发现了什么?5 有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方
17、式避免宿主的限制作用?6 某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?7 在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?8 下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是类酶的识别序列： GAATCG，AAATYr，GATATC，ACGGCA?为什么?9 用连接酶将Sau 3Al(GATC)切割的DNA与经BamHl(Gq,GATCO切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的机率有多大(用百分比表示)10 用Klenow酶填补的办法可使5黏性末端转变成平末端 这种方法常使DNA上的某些限制酶的
18、识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamH 1(G GATCC)； Taq I(T CGA)，BssH II(G CGCGC)、11 请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8个碱基的内切酶？怎样验证?12 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?五、问答题1 什么是细菌的限制修饰系统(restriction-modificationsystem，R-M system)2 细菌的限制修饰系统有什么意义?3 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。4 I类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用?5 类限制酶有哪些特点?6
19、何谓限制性内切核酸酶的切割频率?7 什么是限制性内切核酸酶的星号活性，受哪些因素影响？8 双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。9 什么是DNA多态性(DNApolymorphism)?10 限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。11 计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离：Alu I： 5 AGCT 3 EcoR 1： 5GAATrC 3 3 TCGA 5 3CTTAGG 5Acy： 5 GPuCGPyC 3 3 CPyGCPuG 5 (注：Py=任何一种嘧啶；Pu
20、=任何一种嘌呤）12 在细菌质粒pBPI的四环素抗性基因tetR的中间有一个Hind的切点，用Hind切割果蝇基因组DNA，以 pBP1 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆15带有果蝇的目的基因。用Hind和EcoR对克隆15进行了酶切分析，电泳结果如图15.1（用酶切的pBP1 质粒DNA作对照），旁边标出了片段的大小。 12：Hind切割；34：EcoR V切割；56：Hind+EcoR V切割；1、3、5、是质粒DNA；2、4、6是15号克隆（1） 绘制含有插入片段和不含插入片段时的PBP1的限制性图谱，并标明四环素抗性基因的位置；（2） 如果用克隆在另一个与PBP1完全不同源载体上
21、的四环素抗性基因作为探针进行Southern印迹杂交，预测上述电泳图会出现什么样的杂交带？（3） 如果用克隆15的果蝇DNA片段作为探针进行Soutuern印迹杂交，放射自显影的结果又是如何？13. 为什么大多数内切酶被称为“限制”酶?14. 据Science杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致DNA中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱变。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的监测方法。15. 为了绘制长为3.0kb BamH I限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR I、Hpa、EcoR I+ Hpa 消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型（图15.2）。根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoR I和Hpa识别位点的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。 六 概念题1 回文序列2 同裂酶3 限制性物理图谱