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1、第四部分 冰淇淋微生物检验方法一、大肠菌群检验第110页二、菌落总数的测定第117页三、嗜冷菌的检测第120页四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验第120页五、涂抹检验第125页六、空气净度检验第126页七、水样的检测第127页一、大肠菌群检验（依据国标GB/T4789.3-2003）（一）概念：大肠菌群：经3724h培养，能发酵乳糖，产酸、产气，需氧或兼性厌气的G-无芽胞杆菌。该菌主要条件来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。（二）培养基配制：1.乳糖胆盐发酵管：
2、成分：蛋白胨20g 胆盐5g 乳糖10 g 0.04%溴甲酚紫水溶液25ml 蒸溜水1000 ml PH 7.4 制法：将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。注：双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。2.乳糖发酵管：成分：蛋白胨20g 乳糖10 g 0.04%溴甲酚紫水溶液25ml蒸溜水1000 ml PH 7.4制法：将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正PH值，加入指示剂，分装3-5 ml，并放入一个小倒管，115。C高压灭菌15min。3. 伊红美蓝培养基：成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂 17g2伊
3、红水溶液 20ml0.65美蓝水溶液 13ml蒸馏水 1000mlpH为7.1制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内， 121高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。检 样（三）大肠菌群检验程序：稀 样乳糖胆盐发酵管361,242h产 气不产气伊红美蓝琼脂平板361,1824h大肠菌群阴性报 告乳糖发酵管361.242h革兰氏染色产 气革兰氏阴性无芽胞杆菌革兰氏阳性不产气大肠菌群阴性大肠菌群群阴性大肠菌群阳性报 告报 告报 告（四）操作程序：1.检样稀释（1）以无菌操作将检样25ml（g）放于含有2
4、25ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。（2）用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：100的稀释液。（3）另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。3.乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料
5、乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。3.分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。菌落形态：紫黑色，有金属色泽紫黑色，无金属色泽中心紫黑色，外缘为粉红色4.证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养242h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳
6、性。革兰氏染色：挑取可疑菌落灭菌盐水取菌 火焰上固定结晶紫染色1min水洗革兰氏碘液染色1min水洗95%乙醇染色30S水洗复染液染色1min水洗待干镜检。大肠菌群采用三步法（初发酵，分离培养和证实试验）第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经平板分离和证实实验后，有时可能成为阴性。因此，初发酵与证实实验相差较大。5.报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。6.注意事项：（1）乳糖胆盐发酵管内有无倒立小导管，且观察小倒管内是否有气泡。（2）小导管不能缺裂，口不能被堵。（3）平板分离：挑取菌落35个。（4）加
7、样液时要沿管壁缓慢加入，防止小倒管里冲入气泡。（5）加入样液时一定要混匀。（五）染色法：1.美兰染色法：（1）吕氏美蓝染色液美蓝 0.3g 95%乙醇 30ml 0.01%氢氧化钾溶液 100ml将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。（2）染色法将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1-3分钟，水洗，待干，镜检。（3）结果：菌体呈兰色。2.革蓝氏染色法：（1）原理：G-菌（革兰氏阴性菌）细胞壁厚，细胞壁中脂类化合物多，含肽聚糖少，酒精溶解脂类，细胞壁通透性好，酒精可以碘和结晶紫的复合物溶出，番红进入红色。G+菌（革兰氏阴性菌）细胞壁薄，细胞壁中脂类化合物少，含肽聚糖多，细胞壁通透性差，碘
8、和结晶紫的复合物滞留蓝紫色。（2）染液的配制：1）结晶紫染液：结晶紫1g + 95%乙醇20ml + 1%草酸铵水溶液 80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2）革蓝氏碘液：碘1g + 碘化钾2g + 蒸馏水300ml，将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，等完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。3）沙黄复染液：沙黄0.25g + 95%乙醇10ml + 蒸馏水 90ml，将沙黄溶解与乙醇中，然后用蒸馏水稀释。（3）染色法：1)用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。2)涂片自然干燥或在火焰上固定，滴加结晶紫，染1
9、分钟水洗。3)滴加革蓝氏碘液，作用1分钟，水洗。4)滴加95%乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒。5)水洗，滴加复染液，复染1分钟。水洗，待干，镜检。（3）结果：革蓝氏阳性菌呈紫色。革蓝氏阴性菌呈红色。附：大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN100mL(g)95%可信限1ml(g)30.1ml(g)30.01ml(g)3下限上限000000000123303060905900000111101233060901205130000022220123609012016000003333012390130160190111100000123
10、407011015051020021011111111012370110150190103023036011112222012311015020024030360111133330123160200240290222200000123901402002601030360370222211110123150200270340307044089022222222012321028035042040100470150022223333012329036044053033330000012323039064095040701501200130038003333111101234307501200160
11、0701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注：（1）本表采用3个稀释度（1ml(g) 、0.1ml(g) 、0.01ml(g) ），每稀释度3管。（2）表内所列检样量如改用10 ml(g)、1 ml(g)、0.1 ml(g)时，表内的数字应相应降低10倍，如改用0.1 ml(g)、0.01 ml(g)、0.001 ml(g)时，则表内数字应相应增加10倍。其余可类推。二、菌落总数的测定（依据
12、国标GB/T4789.2-2003）（一）概念：菌落总数：是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等）所取1ml（g）检样中所含菌落的总数。主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌对食品被污染程序的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。（二）培养基：营养琼脂:成分：蛋白胨 10 g 牛肉膏 3 g 氯化钠 5g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml制法：将除琼脂以外的成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2 ml校正PH至7.2-7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。
13、分装烧瓶，121。 C高压灭菌15分钟。（注：现化验室用直接配制好的营养琼脂混合物）（三）操作步骤：（1）以无菌操作，将检样25g(25ml)剪碎放于含有225ml，灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：100的稀释液。（3）另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增
14、加一次，即换用1支1ml灭菌吸管。（4）根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1 ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时（从检样稀释到倾注平板不超过20min）将凉至46营养琼脂培养基注入平皿内15ml，并转动平皿使混合均匀。同时，将营养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h。注意事项：（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。（2）吸液体时液体不能进入吸头。（3）样品稀释时一定要混匀。（4）倒
15、培养基前，瓶口要过火焰。（5）一定要有空白对照。（6）培养基温度控制，培养基薄厚。（7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。2 、检测完要迅速进行培养。（四）菌落计数的方法（1）平板菌落数的选择选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌数生长时，则不宜采用，应以无片状菌数生长的平板柞为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数，平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线）若仅有一条链，可视为一个菌落，如有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个
16、菌落计。（2）稀释度的选择 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告。 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字。 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数报告。 若所有稀释度无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 若所有稀释度的平均落菌数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数。（3）菌落数的
17、报告菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。（见下表）稀释度选择及菌落数报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数（cfu/g或ml）报告方式（个/g或ml）10-110-210-31多不可计164201640016000或1.61042多不可计295461.63775038000或3.81043多不可计271602.22710027000或2.71044多不可计多不可计31331300031000或3.1105527115270270或2.7102600011010
18、7多不可计305123050031000或3.1104三、嗜冷菌的检测（一）培养基：CVT培养基配制：成分：酵母浸膏2.5g，蛋白胨5.0g，结晶紫0.002g，琼脂条冬季加15g、夏季加20g，TTC 0.05g，葡萄糖1.0g，蒸馏水1000ml。制法：在未加琼脂条和指示剂前、在室温下用4%的氢氧化钠调PH=7.0，溶解后，再15P，20分钟条件下高压灭菌。（二）操作步骤：1.以无菌操作称取检样25g（或25ml），放入含有225 ml灭菌水的三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。2. 用灭菌吸管吸取1：10稀释液1 ml注入含有9ml无菌生理盐水的试管中，即为1：100稀释液。依
19、此类推，做成稀释倍数为1：1000和1：10000的稀释液，做一次递减稀释液换一次吸管。3.用无菌管吸取1ml 1：1000的稀释液于灭菌平皿中，作2个平皿；再吸取1：10000的稀释液1ml于灭菌平皿中，作2个平皿。1. 将凉至45。C左右的嗜冷菌培养基（最好是CVT培养基）注入平皿中，待凝固后，倒置于710。C冰箱中，培养10天后开始计数。（三）菌落计数方法：见国标GB/T4789.2-2003菌落总数的测定中7.3菌落计数的报告（即菌落总数记数方法）。（四）菌落形态：呈红色或紫色。四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验（依据国标GB/T4789.29-2003）1培养基：1.1含0.6%酵母浸
20、膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）1.1.1成分：胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL1.1.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.27.4，分装，121高压灭菌15min，备用。1.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSA-YE）1.2.1成分：胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL1.2.2制法：将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.27.4，分装，121高压灭菌15min，备用。1.3 EB增菌液1.3.1成分：胰胨17g，多价胨3g，
21、酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL，盐酸丫啶黄15mg/L，萘啶酮酸40mg/L1.3.2制法：除盐酸丫啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合，调PH至7.27.4，分装，121高压灭菌15min。使用前加盐酸丫啶黄15mg/L和萘啶酮酸40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。1.4李氏增菌液（LB1，LB2）1.4.1成分：胰胨5g，多价胨5g，酵母膏5g，氯化钠20g，磷酸二氢钾1.35g，磷酸氢二钠12g，七叶苷1g，蒸馏水1000mL1.4.2制法：将上述各成分加热溶解，调PH至7.27.4，分装，121高压灭菌15min。1.4.2.1李
22、氏液（LB1）200 mL加入：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.45mL1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.27 mL1.4.2.2李氏液（LB2）200 mL加入：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.40mL1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.50 mL无菌分装于10 mL大试管中。1.5三糖铁（TSI）琼脂：GB/T4789.28-2003中4.26、27。1.5.1成分 蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化纳5g,硫酸亚铁铵Fe（NH4）2（SO4）26H2O0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,酚红0.0
23、25g,蒸馏水1000mL,pH7.4 1.5.2制法 将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121高压灭菌15min，放置高层斜面备用。1.6 SIM动力培养基1.6.1成分：胰胨20g，多价胨6g，硫酸铁铵0.2g，硫代硫酸钠0.2g，琼脂3.5g，蒸馏水1000mL1.6.2制法：将上述各成分加热混合，调PH至7.2，分装小试管，121高压灭菌15min。1.7血琼脂：GB/T4789.28-2003中4.6。1.7.1成分:豆粉琼脂(PH7.47.6)100
24、 mL,脱纤维羊血(或兔血)510mL1.7.2制法:加热溶化琼脂，冷却50,以灭菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板.亦可分装灭菌试管,置成斜面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼.1.8改良的Mc Bride（MMA）琼脂1.9硝酸盐培养基：GB/T4789.28-2003中3.17。1.9.1成分：硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，PH7.4。1.9.2制法：熔解，校正PH，分装试管，每管约5 mL，121高压灭菌15min。1.9.3硝酸盐还原试剂：甲液：对氨基苯磺酸0.8 g 溶解于2.5mol/l乙酸溶液100 mL中。乙液：甲萘胺0.5 g 溶解于2.5mol/
25、l乙酸溶液100 mL中。1.9.4试验方法：接种后在361培养14天，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐时于于立刻或数分钟内显红色。注：本试验阴性原因有三:细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。1.10缓冲葡萄糖蛋白胨水：GB/T 4789.28-2003中3.4。1.10.1成分：磷酸氢二钾5 g、多胨 7g、葡萄糖5 g、蒸馏水1000mL、PH7.0。1.10.2制法：加热熔解，校正pH。分装试管，每管1 mL ，121高压灭菌15min。1.
26、11糖发酵培养基：GB/T 4789.28-2003中3.2。1.11.1成分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O) 2g，0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH7.41.11.2制法：1.11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121高压灭菌15min。1.11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。 注：蔗糖不纯，加热后
27、会自行水解者，应采用过滤法除菌。1.11.3试验方法：从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于361培养，一般观察23d。迟缓反应需观察1430d。1.12Rustigian尿素培养液：GB/T 4789.28-2003中4.38。1.12.1成分：尿素20.0g，酵母浸膏0.1g，磷酸二氢钾0.091g，磷酸氢二钠0.095g，酚红0.01g，蒸馏水1000mL1.12.2制法：将上述成分于蒸馏水中溶解，校正PH为6.80.2。不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管约为3 mL。1.13 1%盐酸丫啶黄溶液：用灭菌蒸馏水配制1.14 1%萘啶酮酸钠盐溶液：用0.05mol/L氢氧化钠溶液
28、配制2操作步骤：2.1样品的收集及处理无菌取样品25g （mL）放灭菌均质器中加225mL EB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4冰箱。2.2增菌培养EB增菌液放301培养48h，LB1增菌液225 mL放301培养24h，吸0.1mL，加入10 mL LB2增菌液中二次增菌。2.3分离培养将EB增菌液和LB2二次增菌液，分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30148h，调取可疑菌落，在白炽灯45角斜射光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。2.4选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于251，观察是否有动力，且成伞状或
29、月牙状生长。一般观察27天，阳性者可做下一步鉴定。2.5纯培养将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产生硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）上纯培养，做以下鉴定。2.6染色镜检将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4 0.5m）（0.52.0m）；生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。2.7生化特性将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见表1。表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别菌种溶血反应硝酸盐还原
30、尿素酶MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌+-+/+-+-+绵羊李斯特氏菌+-+/+-+英诺克李斯特氏菌-+/+-V-+威尔斯李斯特氏菌-+/+-V+西尔李斯特氏菌+-+/+-+格氏李斯特氏菌-+/+-+默氏李斯特氏菌-+-+/+V-+注：V反应不定；+阳性；-阴性。五、涂抹检验（一）涂抹操作规程：1.进入车间先经过消毒池消毒；2.在洗手池洗手消毒；3.涂抹前用75%的酒精棉球消毒手和镊子；4.用消毒镊子取25cm2湿润灭菌涂抹纸（或涂沫棒），贴（或涂）于被涂抹物表面，使之充分接触，贴完50 cm2后，立即放入装有50ml灭菌生理盐水的三角瓶中，盖好瓶塞，使涂抹纸与盐水充分混
31、合并做好标识，在4h内进行菌落总数和大肠菌群的测定。 （二）菌落总数的测定：1.检样前使三角瓶内生理盐水与涂抹纸充分摇匀，使之充分接触。2.用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，注入灭菌平皿内且做两个平皿。3.及时将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿（沿同一方向）使混合均匀。4.待琼脂凝固后，翻转平板置361温箱内培养482h。（三）大肠菌群的测定：用10ml灭菌吸管吸取10ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml双料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注入装有10ml单料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；用1ml灭菌吸管吸取1ml液体，沿管壁缓缓注
32、入装有9ml生理盐水的试管内，混匀做成1：10的稀释液；用1ml灭菌吸管吸取1ml1：10的稀释液，沿管壁缓缓注入装有10ml单料乳糖胆盐发酵管内，接种3个试管；做好标记置于361温箱内培养242h。（四）芽孢耐热芽孢检验1.用10 ml灭菌吸管吸取10ml检样分别于两个灭菌试管内，盖紧棉塞，做好标识。2. 另取两试管装入10 ml水，分别插入温度计1支。3.将上述试管同时放入水浴中，待温度计温度升至80（芽孢检验温度）或100（耐热芽孢检验温度）开始计时，10分钟后取出，立即冷却至室温。4.用1ml灭菌吸管吸取1ml检样于灭菌平皿内，做两个平皿。5.将凉至46左右的锰盐营养琼脂（每1000M
33、L普通营养琼脂中加硫酸锰(3.08gMnSO4+100mlH2O)1ml）培养基注入平皿内约15ml，充分转动摇匀。6.芽孢测定将平皿翻转置361温箱内培养60-62h。耐热芽孢测定将平皿翻转置552温箱内培养60-62h。注意事项：1.保证涂抹面积50平方厘米。2.操作前要对手和镊子彻底消毒。3.要保证在4小时内进行检测。 六、空气净度检验1.在无菌条件下,把冷至46 的灭菌营养琼脂（或其它培养基）倾入灭菌平皿内.2.待完全凝固后,置检测目的地暴露15分钟.3.翻转平板置361温箱内培养482小时（针对营养琼脂，其它培养基按对应检测菌类的培养条件和时间进行培养）.注意事项:1.检测时一定要使
34、平皿完全暴露在空气中.2.检测完要及时进行温箱培养.3.检测时要保证时间的准确性.七、水样的检测（一）总大肠菌群在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群数系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法：1应用范围（1）本法适用于饮用水、水源水，特别是混浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。（2）水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程序，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能性。2. 原
35、理根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽孢杆菌，在3724h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。3.培养基：乳糖蛋白胨培养液成分： 蛋白胨 10g牛肉膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml蒸馏水 1000ml制法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热熔解，调整PH值为7.27.4，再加入1ml 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，置高压蒸灭菌器中，以115灭菌20min,贮存于冷暗处备用。4.检测步骤： 采用15管法发酵：前5管：吸原液10ml于5ml乳糖蛋白胨培养液三料中中5管：吸原液1ml于
36、10ml乳糖蛋白胨培养液单料中后5管：吸10-1倍液1ml于10ml乳糖蛋白胨培养液单料中 其他如普通大肠菌的测定5.报告：根据证实为大肠菌群阳性的管数，总大肠菌数（MPN）检数表，报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。(标准0个)总 大 肠 菌 数（MPN）检 数 表(GB 5750-85)（总接种量55.5ml,其中5份10ml；5份1ml水样；5份0.1ml水样）接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数1010.11010.1000000 000000 012345 024579 000000444444 012345 891113
37、1517 000000111111 012345 2467911 000000555555 012345 91113151719 000000222222 012345 46791113 111111 000000012345 24681012 000000333333012345 679111315 111111 111111 012345 468101214 接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数1010.11010.1111111222222 012345 6810121517 222222 000000 012345 5791214
38、16 111111333333 012345 81012151719 222222 111111 012345 7912141719 111111444444 012345 111315171922 222222 222222 012345 91214171922 111111555555 012345 131517192224 222222 333333 012345 121217202225 续表1续表2接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数接种量，ml每100ml水样中总大肠菌群近似数1010.11010.1222222 444444 012345 151720232528 333333 222222 012345 141720242731 222222 555555 012345 172023262932 333333 333333 012345 172124283236 333333 000000 012345 81113162023333333 444444 012345 212428323640 333333 111111 012345 111417202327 333333 55555