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1、乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药的监测,缪晓辉 2009.5,一、HBV耐药的有关定义 二、各种耐药检测技术的评价 三、需要重视的几个问题,一、HBV耐药的有关定义,病毒学突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化学突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐药（genotypic resistance） HBV表型耐药（phenotypic resistance） 临床耐药（clinical resistance）,HBV耐药的有关定义,病毒学突破（virologic breakthrough） 指在核苷类药
2、物治疗过程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。,HBV耐药的有关定义,病毒反跳（viral rebound） 指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治疗前水平。,HBV耐药的有关定义,生化学突破（biochemical breakthrough） 指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。,HBV耐药的有关定义,HB
3、V基因型耐药（genotypic resistance） 指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。,HBV耐药的有关定义,HBV表型耐药（phenotypic resistance） 通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。 通常以IC50来评估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐药 IC50 10倍:耐药,HBV耐药的有关定义,临床耐药（cli
4、nical resistance） 指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。,二、各种耐药检测技术及评价,病毒学反跳或突破的监测 HBV基因型耐药监测 HBV表型耐药检测 临床耐药监测,病毒学反跳或突破的监测,基于对血清HBV DNA载量的动态监测 需重视以下三点： 1. HBV DNA载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间,HBV基因型耐药监测,时机 非必须 不主张常规、广泛应用,基因型耐药相关变异的命名,基因型耐药相关变异 在HBV多聚酶序列中的位置,HBV基因型耐药的主要
5、技术,碱基序列分析法 直接测序 克隆测序 聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 反向杂交分析技术（INNOLiPA） 基因芯片技术 实时荧光定量PCR技术 探针定点突变PCR技术 引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),直接测序法,HBV YMDD变异直接测序结果图谱,直接DNA测序的局限性,1. 设备贵、技术高、耗材、费时。 2.必须有充足目的基因片段。 3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBV YMDD变异1.JPG,克隆测序法,克隆测序法,优点： 1.有助于发现混合
6、株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。 2.提高了检测的灵敏度。 局限性： 1.技术难度较高。 2.检测周期更长。 3.检测的费用大大增加。,碱基变异可能导致： 原有位点消失 产生新的位点 识别位点移位,利用错配引物使 PCR产物中产生 特异的酶切位点,结果: 酶切片段长、短变化和多、少变化,聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP),限制性内切核酸酶的作用,它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：,Nde I限制酶的识别序列和切割位点：,-CA TATG- -GTAT AC-,Nla Ill限制酶的识别序列和切割位点：,-CATG NNN-
7、-GTAC NNN-,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,错配引物设计,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,PCR-RFLP检测HBV YMDD变异,PCR-RFLP技术的评价,优点： 简单、广泛易开展。 缺点： 1.限制性内切酶种类有限。 2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。,反向杂交分析技术（INNOLiPA）,INNOLiPA诊断HBV YMDD变异,DNA芯片技术,Scanner,microarray,“Hybridize”,arrayer,Microarray fabrication Sample
8、preparation Molecular hybridization Detection and analysis,DNA芯片技术诊断HBV YMDD变异,Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.,DNA芯片技术,优点 局限性 大通量 技术和设备的要求高 快速 检测成本高 灵敏度高 可平行检测,实时荧光定
9、量PCR在基因变异中的应用,探针定点突变PCR技术-Taqman-MGB探针 引物末端碱基定点突变扩增技术 高分辨熔解曲线法,Taqman-MGB探针定点突变PCR技术,Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异,HBV DNA105copies/ml W:M=1:1,HBV DNA105copies/ml W:M=10:1,HBV DNA105copies/ml W:M=10:1,：W,：M,探针定点突变PCR技术,优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 费时短 影响因素多，存在一定误判,引物末端碱基定点突变扩增技术,引物末端碱基定点突变扩增技
10、术 检测YMDD变异,熔解曲线法检测YMDD变异,特异性探针，其Tm值不同,溶解曲线分析,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理,MALDI-TOF MS检测 HBV YMDD变异的原理,酶切分子量.JPG,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS),优点： 高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于1%的变异株。 局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。,HBV耐药不同检测技术的比较,Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. M
11、ed. Sci. 2005 2(1)：8-16,1Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesse
12、s the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined.,HBV表型耐药检测,有两种途径： 1.细胞外HBV聚合酶活性分析。 2.细胞药物敏感性实验。,细胞外HBV聚合酶活性分析,目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。,细胞外HBV聚合酶活性分析,细胞药物敏感性实验,
13、该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBV DNA含量。,细胞药物敏感性实验,细胞药物敏感性实验,该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。,临床耐药监测,YMDD变异前后病毒载量和ALT的变化,HBV MDD变异与病毒学突破,判断临床耐药时的建议,1. 结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。 2.注意甄别依从性不良。 3.结合基因变异位点。,三、需要重视的几个问题,慎重对待天然耐药
14、的结论。 不要过分依基因型耐药检测技术。 正确对待基因分型技术。,YMDD自然变异的几组数据,Akarsu M等采用InnoLipa 法检测71例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有13例检测到YMDD变异株。 Lee CZ等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对28例拉米夫定治疗前的CHB患者血清进行了YMDD变异毒株检测，发现有16例（57.1%）存在YMDD自然变异毒株。 日本Kobayashi等检测18例无症状HBV携带者,发现5例YMDD变异,占27.78%。,本实验室关于YMDD自然变异 的2组数据,196例CHB患者中，检出存在YMDD变异毒株者共21例，检出率为10.7%。其中YVDD阳性20例，YIDD阳性1例，YVDD和YIDD同时阳性者0例。,183例CHB患者中，检出存在YMDD突变毒株者共40例，检出率为21.86%。其中YVDD阳性36例，YIDD阳性3例，YVDD和YIDD同时阳性者1例。,VS,不要过分依基因型耐药检测技术,基因型耐药变异并非必须。 目前我国尚无SFDA批准的商品化试剂盒或被普遍认可的检测技术。,正确对待HBV基因型 与核苷类似物疗效之间的关系,基因型是一种人为的分类方式。 HBV的基因型与各种核苷类药物的疗效之间的关系还没有确定的结论。 P区基因的变异对S区基因的影响。,结语,加深认识 适时监测 及时发现 正确管理,谢谢！,