2012本科实验理论.doc

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1、细胞破碎常用方法方法技术原理效果成本机械法研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜组织捣碎法细胞被捣碎机捣碎适中适中匀浆法须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵酶法外加酶或自溶法细胞壁被消化，使细胞破碎温和昂贵化学法有机溶剂法有机溶剂溶解细胞壁并使之失稳适中便宜表面活性剂法表面活性剂溶解细胞壁温和适中物理法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜反复冻融法15至-20冷冻，再室温下融化，膜的疏水键被破碎温和撞击破碎干燥法体细胞失水剧烈温度差破碎法思考题 1 常用的细胞破碎的方法有哪些？2 有机溶剂法破碎细胞原理，常用的有机溶剂有哪些答:笨、甲苯、氯仿、二甲苯

2、及高级醇等3 酶法破碎细胞原理答:酶分解作用4 反复冻融法破碎细胞原理答:通过反复将细胞放在低温下突然冷却和室温下融化达到破壁作用层析技术方法简介层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。分类（1）分配层析（2）离子交换层析（3）凝胶过滤层析（4）亲和层析（5）吸附层析一、离子交换层析基本流程上样：洗脱：pH梯度洗脱；或离子强度梯度洗脱检测、记录分部收集。离子交换分离基本原理不同氨基

3、酸（蛋白质、酶、蛋白激素等）等电点不同，在同pH条件下带电性能不同，与交换剂结合力大小不同，结合较松的先被洗脱出来，结合较紧的后被洗脱出来，从而被分开。阳离子交换剂交换原理：RC-C1+C2+ RC-C2+C1+离子交换层析过程中的关键技术 1、交换剂处理 漂洗 目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒（这一步一定要到做位。留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。）直至水清澈无色。 处理 用酸碱轮换浸泡，以便使交换剂带上需要的平衡离子。 平衡 经处理后，要用大量的水悬浮交换剂，最后用缓冲液平衡 2、柱的选择与装柱 装填均匀，松紧一致，没有气泡，没有裂缝。3、上样要求 加入样品液的体积一般应小于床体积的

4、1/3。4、洗脱剂原则四条：阴离子交换剂选用阳离子缓冲液（如氨基乙酸、铵盐、Tris等），阳离子交换剂选用阴离子缓冲液（如乙酸盐、磷酸盐等），以防缓冲离子参与交换过程，降低交换剂的交换容量。缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。选用的缓冲系统对分离过程无干扰。要确定一定的离子强度。5、洗脱速度洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。二、凝胶过滤层析1、原理：在凝胶颗粒所构成的立体的网状结构中，蛋白质的分子颗粒越大，受到凝胶颗粒的排阻越大，下行越快，优先洗脱出来；分子颗粒越小受到的排阻越小，阻力越大，洗脱出来的速度越慢。2、 常用凝胶： (1)天然凝胶：琼脂糖凝胶 (2)人

5、工合成凝胶:葡聚糖凝胶（其商品名称Sephadex），有G-25，G-75，G-100 ，G-200等型号的凝胶。其中G后面的数据为得水值，即每g干胶吸水毫升再乘以10. 不同规格的凝胶性质不同，常用G-25脱盐。3、 应用： (1)分离、纯化与鉴定； (2)测定相对分子质量；三 亲和层析1、原理：利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。 2、应用： 酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受体。四 吸附层析1、原理：利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离溶剂中的溶解度差异进行分离，取决于物质的分子结构。 2、分类： (1)物理吸附，如：活性炭； (2)

6、化学吸附，如：氧化铝； (3)交换吸附，如：硅胶。思考题：1.什么叫层析技术？常用的层析技术有哪些？2.指出常用层析技术的应用范围。答:凝胶层析法脱盐用于分离提纯测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩离子交换层析法主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子高效液相层析法液-固吸附层析液-液分配层析离子交换层析3 SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理是什么？ 答:大小不同的分子经过的路线长短不同而达到分离作用4.用Sephadex G25脱盐时蛋白质和盐哪个先出峰？ 5.相对分子量为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开？为

7、什么？答:不能,分子量差距太小6. 将分子量分别为a（90 000）、b（45 000）、c（110 000）的三种蛋白质混合溶液进行凝胶过滤层析，正常情况下，将它们按被洗脱下来的先后排序。答:c、a、b 7.离子交换层析与凝胶过滤哪种分辨率高？ 8.离子交换层析的原理？答:根据自交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离主要依赖电荷间的相互作用,利用带电分子中电荷的微小的差异进行分离9. 如果样品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6)，在pH4条件下，这两种氨基酸那一种与CM（阳离子交换剂）结合的紧密？如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱，那种氨基酸先洗脱出来

8、？答:Ala10. 柱层析时湿装柱的注意事项有哪些？答:用水灌注、不能有气泡11. 说说离子交换层析中洗脱液的选择原则 （答案见上！）12.如何利用凝胶过滤层析测定蛋白质相对分子质量电泳原理与技术目前常用的电泳系统为区带电泳。任何电泳技术方法，均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道，常见凝胶电泳的支持介质有（1）聚丙烯酰胺凝胶（2）琼脂糖凝胶（3）淀粉凝胶。一 聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）PAGE技术流程简介1.组架（玻板、胶条、U型玻板、封胶）2.制胶（分离胶溶液、浓缩胶溶液、插入梳子）3.点样4.电泳5.染色6.脱色7.分析（二）丙烯酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构1、聚合原理：聚丙烯酰

9、胺凝胶（PAG）是用丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙烯在催化剂的作用下聚合而成。通常采用过硫酸铵或核黄素来引发该过程,以N,N,N,N-四甲基乙二胺(Tetranmethylenediamine,TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。聚合好的凝胶是立体网状结构。2、凝胶浓度和蛋白质分子量的关系 凝胶中网眼的大小与胶的浓度有关，凝胶的浓度越小，其网眼越大，胶的浓度越大网眼越小。分离分析较小的蛋白质分子时用较高浓度的凝胶，而分离分析分子量较大的蛋白质时则用较大浓度的凝胶。（三）影响凝胶聚合速度主要因素1、引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致

10、电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在4060分钟内完成。2、系统pH值 酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果。3、温度 低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；4、分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。5、系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；（四）PAGE分离蛋白质原理PAG系统电泳分离蛋白质具有很高的分辨率，因为该系统工作状态下存在三种效应。1浓缩效应 指样品在进入分离胶之前被浓缩成一条细线的现象。（1）在电泳系统中有含甘氨酸的Tris-HCl(pH8.5)电极缓冲液，浓缩胶pH6.5，通电后样品中的各种带负

11、电荷的蛋白质会在快离子(Cl-)和慢离子(0.1%Gly-)形成的高压带之间初步分开并形成很窄的条带，而使整个样品中的蛋白质在将进入分离胶时会形成一条细线，即被浓缩之效果。（2）蛋白质样品从网眼较大的浓缩胶进入网眼较小的分离胶时遇到的阻力突然变大。2.电荷效应 在设置好的浓缩胶及分离胶特定pH条件下，不同蛋白质所带电荷多少不同，并在稳定的静电场中向异极泳动的动力所决定的泳动速度不同，最终会被分离。3.分子筛效应 分离胶内属于立体的网状结构，分子量较大的蛋白质颗粒向异极泳动受到的阻力较大，泳动较慢，而分子量较小的蛋白质则阻力较小，向异极泳动较快，最终被分开。（五）影响蛋白质泳动速度及分离效果主要

12、因素1.系统的pH值凝胶体系及电极缓冲液的pH决定样品中蛋白质的带电性质，直接影响蛋白质的电泳方向和泳动速度。pH一般设置成大于样品中蛋白质的等电点，蛋白质均荷负电，电泳方向朝阳极。而当pH小于样品中蛋白质的等电点时，则所有蛋白质分子荷正电，静电场中向阴极泳动。前一种电泳系统属于碱性电泳，后者成为酸性电泳。2.电场强度普通电泳 520V/cm电压降(电位梯度)。高压电泳 7000V/cm电压降(电位梯度)。3.温度电泳过程中由于电流作用致使凝胶发热，热效应对电泳有很大影响。温度升高时介质粘度下降，分子热运动加剧，自由扩散变快，有效迁移率增加，但对于蛋白质分离不利。另外较高温度会使凝胶变形，分子

13、筛效应降低，影响分离。因此，一般要求在15-25之间进行电泳效果较好。4.电渗作用电泳介质或支持物(如凝胶)在电极缓冲液中吸附带电离子，使溶液相对带电，进而在电场作用下，溶液就会向一定方向移动，这种想象称为电渗现象。带电溶液的移动会影响蛋白质的泳动。二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）（一）SDS-PAGE 分离基本原理SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，

14、蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。因此，SDS-PAGE过程中蛋白质分子在凝胶中的泳动速度主要取决与亚基的分子量大小。与PAGE技术方法相似，蛋白质亚基在电泳过程中存在三效应。（二）未知蛋白质分子量的测定以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测定迁移率，从标准曲线得到

15、相应的分子量； 思考题：1、常见的凝胶电泳有哪几种？说明其主要用途，并比较其主要优缺点。答：醋酸纤维素薄膜电泳凝胶电泳等电聚焦电泳2.简单说明PAGE技术方法对于样品中蛋白质的分离效果较好的主要因素有哪些，并简单解释相应因素产生的有原因。3.从分离原理和实际应用两方面简单说明SDS-PAGE和PAGE技术方法有何主要区别？4.影响蛋白质电泳分辨率的主要因素有哪些？答：1.系统的pH值2.电场强度3.温度4.电渗作用5.聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白时，使用的电泳缓冲液PH8.3，那么样品应点在哪端？为什么？（PH值大于等电点时带负电荷 ,小于等电点时带正电）蛋白质含量测定方法简介一、几种蛋白质

16、定量测定方法比较原理波长(nm)特点适用双缩脲法肽键与铜离子发生双缩脲反应540简单、迅速灵敏度一般类脂、色素等干扰一般浓度30-500gmLFolin-酚法肽键与铜离子发生双缩脲反应+钨蓝和钼蓝650同上灵敏度高100倍一般浓度5-100gmL考马斯亮蓝G250法染料结合法-青色复合物595简单迅速，物质少，灵敏度高；去污剂干扰0-1000g/mL 紫外吸收法共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸280简单快速灵敏度高核酸干扰大致估计 1 紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点？2 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？3 试说明考马斯亮蓝G250法的优缺点。参考答案：

17、1、紫外吸收法 优点：简单快速，灵敏度高。缺点：核酸干扰2、校正:计算待测蛋白质溶液的OD280/OD260比值后，查(紫外分光光度法测定蛋白质含量校正数据表）校正因子“F”值，根据经验公式-蛋白质浓度(mg/ml)=F1/dOD280D计算该溶液的蛋白质浓度；D-溶液的稀释倍数，d比色杯的厚度（cm）3、考马斯亮蓝G250 当该染料与蛋白质结合后为青色 ，在波长595nm有最大吸收；其吸收值与蛋白质含量成正比。灵敏度高（0-1000 g/mL ），是常用的微量蛋白质快速测定法。缺点：、大量的去污剂如TritonX-100，SDS等严重干扰测定。B、蛋白质与改染料2min反应达平衡，其结合 物

18、在室温下1h内稳定。时间太长，结果偏低。 离心技术一、概念、用途、设备和基本操作1.概念：离心技术是利用离心机旋转时产生的强大离心力对大小、形状和密度不同的混合物进行分离的一种方法。 2.用途： 分离细胞器、大分子物质；固、液相分离；测定某些纯物质的性质。3.设备：离心机4.基本操作：（1）将待分离的物质悬浮于一定的介质中，装入离心管； （2）精确平衡之后，对称放置于转头的插孔中； （3）当转头旋转时，各种物质粒子在离心力作用下因各自大小、形状和密度的差异而以不同速度沉降，一段时间后，即被分离。二、离心（centrifugation）分离的基本原理1. 粒子的沉降速度（其中：t:沉降时间 :悬

19、浮介质的黏度 rp:颗粒半径 p:颗粒密度 ：介质密度rt:旋转中心到液面的距离 rb:旋转中心到管底的距离 w - 角速度）由公式可知，在一定离心场中，颗粒的沉降速度不仅与离心力有关，而且与颗粒大小、密度以及介质黏度有关。一组不同的颗粒在同一条件下离心时则可以根据它们的密度和颗粒大小而分离。 2. 相对离心力 (relative centrifugal foce RCF)（1）离心场产生的离心力的表示： 习惯使用法：转速 转/分（r/min） 缺点：如果旋转半径不同，则粒子所受的离心力不同标准法：相对离心力（RCF ） 表示方法：数字g 如：10000g（2）相对离心力与转速的换算 计算法

20、RCF = 1.11910-5（r/min)2r（g） 图表法 根据旋转半径（r）、RCF、r/min 的列线计算图进行换算三、离心机 (centrifuge) 1. 制备离心机2. 分析离心机 属于超速离心机，具有光学观测系统。 制备离心机适用范围最大转速（r/min）最大相对离心力（g）特点用途普通离心机6 0006 000型号很多，容量不同，转速不同，控制不精密固液沉淀分离高速离心机2500090 000型号较多，转速不同，有控温装置，控制精密（时间、转速） 菌体、细胞碎片、细胞器等的分离超速离心机80 000500 000控制精密：时间控制、温度控制、转速控制、真空系统细胞器分级分离、

21、病毒、DNA、RNA、蛋白质分离提纯等四、转头1分类：水平转头、角式转头和垂直管转头2注意事项 各种转头的离心管腔的大小、形状均有许多规格，以适应各种转速、样品量、分离目的、分离方法。需要注意： （1）每个转头都有一定的使用限度（次数，运转时间）。 超过限度使用，其最大额定速度应降低10%。 二次超限使用，再降10%。 每个转头必须单独建挡，记录使用次数和最大速度下的使用时间。 （2）转头上标定的最大额定转速是有条件的。五、常用离心技术1. 沉淀离心 选定一定的时间、速度进行离心，使样品液中的大的固型物与液体分离，从而获得沉淀或上清夜。又称为固液分离法。使用普通离心机2. 差速分级离心 在均匀

22、介质中，利用各种物质粒子沉降速度的不同而分批分离的方法。3.区带离心法原理：利用各种粒子的沉降速度和浮力密度差异，当一定粒子到达与其密度相同的梯度位置时则停止沉降，不同粒子处于不同位置，则得到了分离。分类：（1） 差速区带离心法：根据分离样品颗粒的不同沉降速度而分层。（2） 等密度区带离心法：根据微粒的不同密度而分层。密度梯度材料：要求：无毒；合理的密度范围；易于颗粒分开。类型：糖类（蔗糖）、无机盐（氯化铯）、硅溶胶（Ludox）、有机碘化物 思考题：1.相对离心力为30，000g，转头平均半径为10cm,求转速r/min （rpm）? （两种方法） 2.制备离心机有哪几种类型？比较它们的特点

23、和用途。3.在离心场中物质沉降的速度与哪些因子有关。4.差速区带离心法和等密度离心法的区别是什么？5.常用密度梯度的材料有哪些？6.几种离心技术的特点？沉淀技术一、概述1、定义：沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离的技术过程。沉淀分离是生化物质的分离纯化过程中经常采用的方法。2原理：生化产品的分离制备技术都是根据混合物中的不同组份分配律的差别，把它们分配于两个或几个物相中（如有机溶剂抽提、盐析、结晶等）。或者将混合物置于某一相（大多数是液相）中，外加一定作用力，使多组份分配在不同区域，从而达到分离的目的（如电泳、超离心、超滤

24、等）。除了一些小分子，如氨基酸、脂肪酸、某些维生素及胆固醇类外，几乎所有生物大分子都不能融化，也不能蒸发，只限于分配在固相或液相中，并在两项中相互交替进行分离纯化。二、常用的沉淀法1盐析沉淀法盐析沉淀法简称盐析法，是利用溶质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在溶液中添加一定浓度的中性盐，使某种物质从溶液中沉淀析出，从而与其他组分分离的过程。盐析沉淀常用于蛋白质等的分离。原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种

25、现象称为盐析。在某一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。2等电点沉淀法通过调节溶液的pH值至某种溶质的等电点(pI)时，使其溶解度降低，沉淀析出，而与其他组分分离的方法称为 等电点沉淀法。由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解性，导致沉淀不完全。所以在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用，例如，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等一起使用。有时也单独使用等电点沉淀法，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH值的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进酸或碱，以防止局部过酸

26、或过碱而引起酶变性失活。3有机溶剂沉淀法利用要分离物质与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某种溶质沉淀析出，从而与其他组分分离的方法称为有机溶剂沉淀法。原理：有机溶剂之所以能使某些溶质沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集。同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。例如，蛋白质通常采用乙醇或丙酮进行沉淀，

27、DNA和RNA可用乙醇或2-乙氧基乙醇进行沉淀等。注意事项：（1）有机溶剂沉淀法容易引起蛋白质、酶等物质的变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂的影响。（2）有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响，一般应将溶液的pH值调节到要分离物质的等电点附近。（3）有机溶剂在中性盐存在的条件下可以减少蛋白质的变性，提高分离效果，所以在利用有机溶剂进行蛋白质的沉淀分离时，要添加0.05molL左右的中性盐。但是中性盐的存在会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜多加。4核酸的沉淀分离选择适宜的溶剂进行处理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方法又称为选

28、择性溶剂沉淀法。例如，在核酸的提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间，使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而除去，核酸仍然留在水溶液中；在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在的条件下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA和RNA在水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去；在DNA和RNA的混合液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。由于选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在应用本法之前，必须对要分离物质以及溶液中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。思考题：1 蛋白质沉淀的常用方法有哪些2什么是盐析，盐析的原理，列举盐析时常用的盐

29、答：一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠3简述等电点沉淀及原理4什么是有机溶剂沉淀，列举常用的有机溶剂酶的提取纯化与活力测定酶是蛋白质，凡能用于分离纯化蛋白质的方法都适用于酶，各种预防性的措施也同样适用于酶。 在酶的提取分离过程中，应注意工艺的特殊要求。如在总的纯化要求上，蛋白质分离始终在温和条件下进行，而酶的分离在不破坏酶活力的限度内，可以采用“猛烈”手段，尽可能除杂。如：有蔗糖存在时，蔗糖转化酶能经受更高的温度。另外，酶的催化活性是选择其提纯方法和操作条件的指标，整个过程都需测定总活力和比活力；收得率和纯度。一.酶的分离与

30、提取(一）了解所分离酶在细胞中分布 细胞产生的酶有二类：1.细胞外酶由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶。这类酶大部分属于水解酶，通常含量高，容易得到。2.细胞内酶在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。（二） 材料的获取 在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。（三）酶分离纯化的主要步骤（抽提、浓缩、纯化、结晶 ）1.抽提 破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎

31、器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解 ；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。 大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液pH最好远离等电点 。 2浓缩 抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。3 纯化 （1）原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。 （2）分离纯化方法 a.盐析法（如硫酸胺） b.有机溶剂沉淀法 c.层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析） d.等电点法 e.吸附分离法 4. 结晶 浓缩液经过各种方

32、法的纯化，可得到较纯的结晶产品。 二.酶活力及其测定 （一）酶活力定义 是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。 （二）如何测定酶活力？初速度的测定是关键（三）常用的酶活力单位在标准条件(25、最适pH、最适底物浓度)下，每分钟能催化 1 mmol 底物转化成产物所需要的酶量定义为1个国际单位 (IU)。 在最适条件下，每秒钟能催化1 mol 底物转化成产物所需要的酶量为 1个Kat 。 自定义的活力单位蛋白酶活力单位习惯定义：1个1min内将底物酪蛋白分解产生1g酪氨酸的酶量。淀粉酶活力单位习惯定义

33、：1小时内水解1g淀粉的酶量。有的部门则采取每小时分解1ml2%的淀粉溶液的酶量为1个活力单位。（四） 酶的比活力比活力=酶活力单位数/酶蛋白质量（五） 酶的纯度纯化倍数 =纯化后的比活力 / 粗抽提液比活力产率(回收率) =纯化后的总活力单位 / 粗抽提液总活力单位纯化步骤总蛋白（g）总活力比活力(u/mg蛋白)纯化倍数收得率（%）1粗抽提液30210000.711002氯化锰处理7.64150172.02.8723冰冻融解5.58148722.73.8714DEAE-纤维素层析0.113502544.563.5245硫酸铵盐析0.048346771.7102.0176羟基磷灰石柱层析0.0163133200.0286.0157聚丙烯酰胺凝胶电泳0.0123100255.0365.015思考题1. 某酶在一定条件下，5 min内使30 mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？2. 从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？3.简述酶分离纯化的基本过程4 酶的制备及提取过程中应注意哪些事项5 常用的酶活力单位？6 比活力概念及意义