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1、实验一 糖的呈色反应和还原糖的检验一、实验目的1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。2.了解鉴定还原糖的方法及其原理。二、实验原理糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。与一元酚如一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：通常使用的无机酸为硫酸。如用盐酸，则必须加热。常用的酚类为一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核
2、的磺化有关，见如下反应式；（一）糖的呈色反应 1Molish反应(萘酚反应) 本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与一萘酚作用，形成红紫色复合物。在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 2蒽酮反应 糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9，10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物。 3. Seliwan
3、off反应(间苯二酚反应) 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需2030s。在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢。只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。 4Bial反应(甲基间苯二酚反应) 戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合，形成深蓝色的沉淀物。此沉淀物溶于正丁醇。己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物。（二）还原糖的鉴定含有自由醛基(一CHO)或酮基(C=O)的单糖和二糖为还原糖。在碱性溶液中，还原
4、糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。1Fehling反应 费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。上述反应可用下列方程式表示：在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试
5、剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应。2. Benedict反应Benedict试剂是Fehling试剂的改良。它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。 3Barfoed反应 该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还
6、原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10 min内水解而发生反应。还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。三、实验试剂和材料仪器1.测试糖液2阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，1淀粉溶液和2种未知糖液。2.试剂Molish 氏试剂称取萘酚2克，溶于95乙醇中并定容到100ml。注意临用前，新鲜配制，贮于棕色瓶中。蒽酮(Anthrone)试剂 溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸(A.R，比重1.84，含量95%)中。当日配制、使用。 Fehling氏试剂 试剂A：将34.5g硫酸铜(CuSO45H20)溶于500mI。蒸馏水中。 试剂B：将125g
7、氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，储于带橡皮塞瓶中。临用时，将试剂A和B等量混合。 Benedict氏试剂 溶解85g柠檬酸钠(Na3C6HO，llH20)及50g无水碳酸钠于400mI。水中；另溶8.5g硫酸铜于50mL。热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀，可过滤本试剂可长期使用。如放置过久，出现沉淀可取用其上清液。 Bial氏试剂 溶解1.5g地衣酚(orcin01)于500mL，浓盐酸并加2030滴10三氯化铁溶液。Seliwanoff氏试剂 溶解50mg问苯二酚(resorcin01)于100rnl，盐酸(盐酸：水=1:2VV)中。
8、临用前配制。盐酸浓度不宜超过12，否则，它将导致糖形成糠醛或其衍生物。浓硫酸。3.器材试管，试管架，煤气灯和沸水浴等。四、实验方法（一）.糖的呈色反应1Molish反应取8支已标号的试管，分别加入各种测试糖液lmL(约15滴)，再各加入Molish试剂2滴，摇匀。逐一将试管倾斜，分别沿管壁慢慢加入浓硫酸l mL，然后，小心竖直试管，使糖液和硫酸清楚地分为两层，观察交界处颜色变化。如几分钟内无呈色反应，可在热水浴中温热几分钟。记录各管出现的颜色，说明原因，检定未知糖液。2蒽酮反应取8支标号的试管，分别加入lmL蒽酮溶液，再将测试糖液分别滴加到各试管内，混匀，观察颜色变化，鉴定未知糖液。3Seli
9、wanoff反应取试管8支，编号，各加人Seliwanoff试剂ImL。再依次分别加入测试糖液各4滴，混匀，同时放人沸水浴中，比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序，分析说明原因。注意蔗糖的反应。 4. bial反应将2滴测试糖液加到装有1ml Bial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应。（二）还原糖的鉴定1Fehling反应 取8支试管，各加Fehling试剂A和B各lmL。摇匀后，分别加人测试糖液各4滴，沸水浴煮23min，取出冷却，观察沉淀和颜色的变化。2. Benedict反应 于8支试管
10、中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.3.barfoed反应分别加入测试糖液2-3滴到含有1ml Barfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.五、注意事项1. Molisch反应非常灵敏，0001葡萄糖和00001蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中。过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色。需稀释糖溶液后重做。2.果糖在Seliwanoff。试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色。戊糖
11、亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合。生成绿色到蓝色产物。3.酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用。4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀。实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可能略有不同。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别。5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察
12、试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程。六、思考题 1列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用。 2应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题? 3举例说明哪些糖属于还原糖。 4运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。5牛乳中含有5双糖。如何证明牛乳中有双糖存在?这种双糖是什么糖?请选用一些颜色反应来加以鉴定。 实验二 3，5二硝基水杨酸比色定糖法一、目的和要求1.掌握 3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。2.掌握分光光度计的使用方法。二、721分光光度计的使用分光分析原理有色溶液对光线有选择
13、性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert- Beer定律。（一）Lambert定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大，光线强度的减弱也愈显著。若C不变， OD L （二） Beer定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高
14、，光线强度的减弱也愈显著。若L不变： OD C（三）Lambert-Beer 定律及其应用1Lambert-Beer 定律：I0IT= =10KCL当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比。其关系式如下：两边取对数得：lgT=KCL I0ICL图6 一束单色光通过溶液时的情况示意图式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，lgII0L为液层的厚度。K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关。 OD（或A）=lgT=KCLlgII0若将 用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示）
15、，则它们之间的关系如下： 2待测溶液浓度的计算： 根据Lambert-Beer定律 标准溶液：ODs=KsCsLs待测溶液：ODu=KuCuLu当两种溶液的液层厚度相等（Lu = Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。ODsODuCsCu=两式相比得：Cu= CsODuODs即：721E型分光光度计的操作 这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计。其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好。使用方法如下： 1. 转动波长选择钮，选用所需的波长。2. 接通电源（指示灯亮），打开电源开关。3. 将机器预热20分钟。4. 按动
16、“Mode”键，模式转换到“T”模式。5. 拉动比色皿座的拉杆半格，使隔板正好档住光路，按“0T”按钮调0，然后将拉杆推回。6. 按“100T”按钮调节“100T”，此时显示屏出现“BLA”字样，闪烁几秒后出现“100.0”,调节完毕。将比色皿放入，空白对照放入第一格，重复步骤六以后，将模式转化为“A“模式，测定溶液的吸光度。做标准曲线时从低浓度往高浓度过渡时不需要用蒸馏水润洗比色皿。比色完毕后，关上电源开关，取出比色皿，将比色皿暗箱盖好，清洗比色皿并晾干。三、3， 5-二硝基水杨酸比色定糖实验原理糖的测定方法有物理和化学两类。由于化学方法比较准确，常常使用之。还原糖的测定是糖定量测定的基本方
17、法。还原糖是指含有醛基和酮基的糖类。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色强度成一定的比例关系，在550nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖的含量。该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。操作方法一、葡萄糖标准曲线的制定取6支大试管，分别按下表顺序加入各种试剂：表6 葡萄糖标准曲线的制作管号 项目空白12345标准糖溶液（mL）00.20.40.60.81蒸馏水（mL）10.80.60.40.20DNS(mL)3333
18、33 煮沸10分钟，用水冷却加蒸馏水（mL）161616161616吹 吸 均 匀光密度（OD）将上述各管溶液混匀后，在721分光光度计上用550纳米进行比色测定，用空白管溶液调零点。记录光吸收值。以葡萄糖浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制出标准曲线。 二、样品中还原糖含量的测定1.样品中还原糖的提取：准确称取新鲜苹果（去皮）1.0克，加少量蒸馏水于研钵中研磨，加蒸馏水洗研钵并移至大试管，放入50恒温水浴中保温30分钟。保温完毕先用纱布过滤。再用滤纸过滤，移入100mL容量瓶中。将上清液作为还原糖待测液。或直接取适量浓度的未知糖溶液进行测定。2.样品中总糖的水解及提取准确称取1克淀粉放入大试管
19、中，加6mol/L的盐酸10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中加热0.5h后，取出12滴，用碘碘化钾溶液检查水解是否完全，若已完全，则不出现蓝色。水解毕冷却至室温后用6mol/L的NaOH调pH至中性，并定容至100mL，过滤，取滤液10 mL于100mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。3.样品中含糖量的测定分别吸取两种待测液各1mL（作平行对照），按标准曲线制作方法精确加入各种试剂，将各管混匀后，测定各管的光密度，两管对照取平均值。4.结果计算在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式计算出样品内还原糖的百分含量。总糖（）100还原糖（）100试剂和
20、器材一 、试剂 1. 3，5-二硝基水杨酸试剂 （又称DNS试剂）： 182g酒石酸钾钠（A.R.）溶于500mL热水中，在热溶液中依次加入3，5一二硝基水杨酸 （C.P.）6.3g，2mol/L的 NaOH溶液 262mL，再加5g结晶苯酚（A.R.）和5g亚硫酸钠（C.P.），搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。2. 碘碘化钾溶液：把20克碘化钾和10克碘溶于100mL水中，使用前，取1mL加水稀释到10mL。3. 0.1%葡萄糖标准液：准确称取100毫克分析纯的葡萄糖（预先在105烘至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100毫升，冰箱保存备用。 二、器材（1）试管
21、和试管架。 （2）吸量管（1毫升和2毫升）。 （3）容量瓶（100毫升） （4）恒温水浴锅 （5）721分光光度计讨论l DNS溶液配制的时候为什么要加入氢氧化钠、苯酚等试剂？l DNS反应时为何要过量？实验三 蛋白质和氨基酸的呈色反应一、目的要求(1) 学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法及其原理。(2) 学习几种鉴定特定氨基酸的特殊颜色反应及其原理。二、原 理蛋白质和氨基酸鉴定常用方法蛋白质所含有的某些氨基酸及其特殊结构，可以与某些试剂反应、生成有色物质。1双缩眠反应 当脲(即尿素)加热至l80时两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲(biuret)。然后在碱性溶液中与铜离子(cu2+)
22、结合生成复杂的紫红色化合物。这一呈色反应称为双缩脲反应。紫红色铜双缩服复合物分子结构见下页图。蛋白质或二肽以上的多肽分子中，含有多个与双缩脲结构相似的肽键，因此也有双缩脲反应。应当指出，含有个CSNH2、一CH2一NH2，一CRHNH2，一CH2一NH2CHNH2一CHOH-CH2NH2，-CHOHCH2NH2等基团的物质，甚至过量的铵盐也干扰本实验。2Salkowski(1888)蛋白黄色反应它是芳香族氨基酸，特别是有酪氨酸和色氨酸蛋白质所特有的呈色反应。苯丙氨酸和苯反应很困难。皮肤、指甲和毛发等遇浓硝酸变黄，原因在此。硝基苯衍生物呈黄色，在碱性溶液中，它进一步形成深橙色的硝醌酸钠。参考反应
23、是：3茚三酮反应 蛋白质、多糖和各种氨基酸具有茚三酮反应。除无氨基的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外其他氨基酸生成紫红色最终为蓝色化合物。三、器材与试剂器材试管及试管架 水浴锅 量筒 滴管 滤纸片 移液管试剂和材料10NaOH溶液 1CuSO4溶液 0.5苯酚溶液 浓HNO3卵清蛋白溶液（蛋清：水120） 尿素 0.1茚三酮乙醇溶液四、操作步骤1.双缩脲反应（1）取一支干燥的试管，加入少量尿素，用微火加热使尿素熔化，待融化的尿素重又开始硬化时停止加热，此时尿素已缩合成双缩脲并放出氨（可由其嗅味辨别或见红色石蕊试纸变色）。试管冷却后，加入约1毫升10氢氧化钠溶液，振荡使双缩脲溶解，再加入2滴1硫酸铜溶液
24、，混匀后观察有无紫色出现。（2）另取一支试管，加卵清蛋白溶液10滴，再加10NaOH溶液10滴及1CuSO4溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。2. Salkowski(1888)蛋白黄色反应（1）取一支试管，加入卵清蛋白溶液10滴及浓HNO334滴，加热，冷却后再加入10NaOH溶液5滴，观察颜色变化。（2）取一支试管，用0.5苯酚溶液代替蛋白质溶液，重复上述操作，注意黄色的生成及最后变成橙色。（3）剪一些指甲和头发分别放入2支试管中，各加入数滴浓硝酸，观察颜色的变化。3.茚三酮反应 （1）取2支试管分别加入卵清蛋白溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加入0.5ml0.1茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸
25、水浴中加热12分钟，冷却，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨基酸溶液呈色深浅。（2） 在一块滤纸片上滴加1滴0.5甘氨酸溶液，风干后，加1滴0.1的茚三酮乙醇溶液显色，用电吹风吹开显色。观察出现的紫红色斑点。五、实验记录以“十”和“一”表明阳性、阴性反应，标明颜色并以“”、“”和“”表明颜色深浅程度。六、思考题 ” 1 综合分析、对比蛋白质和各种氨基酸鉴定方法的特点和用途。2如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果。能对此作何结论?3茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?若不是。为什么?4是否所有的氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果，为什么?是否大部分蛋白质呈现阳性结果。为什么?实验四 蛋白
26、质浓度测定考马斯亮蓝染色法一、目的要求学习考马斯亮蓝(Coomssie Brilliant B1ue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。二、原 理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质染料结合的原理浓度的快速。灵敏的方法。 考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键(vsn der Waalsbond)结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beerslaw)。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2
27、min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h之后，蛋白质染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质染料复合物具有很高的消光系数使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5pg时就有0275光吸收值的变化，比lowry法灵短4倍，测定范围为10一1000ug蛋白质，微量测定法测定范围是110ug蛋白质。此反应重复性好精确度高，线性关系好标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重合，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低但直线弯曲程度很轻，不影响测定。此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgC12，乙醇，(N4H)2S04无干扰强碱缓冲剂在测定
28、中有一些颜色于扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响Tris，乙酸，2巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X100,SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污刑的存在对颜色影响太大而不易消除。三、试剂与器材试剂 1考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G250 100mg溶于50mL95乙醇中，加入100mL 85磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL，滤纸过滤。最终试剂中含0.01(W/V)考马斯亮蓝G250，4.7(W/V)乙醇，8.5(W/V)磷酸。 2标准蛋白质溶液结晶牛血清清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol
29、/L NaCl配制成1mgmL蛋白溶液。测试样品 未知蛋白质溶液。器材试管、试管架、移液管(5mL)，微量取液器，721型分光光度计四、操作方法标准法制定标准曲线取14支试管分两组按下表平行操作表8 考马斯亮蓝标准曲线制作方法试管编号01234561mg/ml标准蛋白溶液/ml00.020.030.040.050.060.070.15mol/L NaCl/ml0.100.080.070.060.050.040.03考马斯亮蓝试剂/ml5摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色A595nm绘制标准曲线：以595nm为纵坐标标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。测定未知样品蛋白
30、质浓度 测定方法同上，通过一定的稀释方法，取合适的未知样品体积。使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。五、注意事项(1)如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520min血内测定光吸收，因为在这段时间内颜色最稳定。(2)测定中，蛋白染料复合物会有少部分吸附于比色皿壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的，测定完后可用乙醇将蓝色的比色皿洗干净。六、思考题1.如果给定的蛋白质溶液浓度不在标准曲线的范围内，你应当采取什么的措施使其适用于考马斯亮蓝染色测定法?2.测定蛋白质溶液浓度的方法还有哪
31、些？请列出三种以上。实验五 蛋白质的两性性质及等电点的测定一、 实验目的：（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、 实验原理：蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端氨基与C端羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子 两性离子 阴离子 pH pI电场中： 移向阴极 不移动 移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时
32、，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。三、 实验设备与器材： 仪器：试管架，试管：15ml6，刻度吸管：1ml4，2ml4，10ml2，胶头吸管2试剂：1、 1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。2、0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。3、0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。4、0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/L NaOH 1
33、0ml，加水至50ml,配成0.2mol/L NaOH。5、0.2mol/L盐酸：吸取37.2%（比重1.19）盐酸4.17ml，加水至50ml，配成1mol/L盐酸。然后吸取1mol/L盐酸10ml，加水至50ml，配成0.2mol/L盐酸。6、0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29ml 1mol/L NaOH，然后加水至50ml。7、0.5%酪蛋白溶液：称取酪蛋白（干酪素）0.25g放入50ml容量瓶中，加入约20ml水，再准确加入1mol/L NaOH 5ml，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5ml，最后加水稀释定容至50ml，充分摇匀。四、 实验内容与步
34、骤： 一、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加0.5%酪蛋白3ml，再加溴甲酚绿指示剂4滴，摇匀。此时溶液呈蓝色，无沉淀生成。（2）用胶头滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，边加边摇直到有大量的沉淀生成。此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。观察此时溶液颜色的变化。（4）滴加0.2mol/L NaOH 进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L NaOH，沉淀又逐渐消失。观察溶液颜色的变化。二、酪蛋白等电点的测定（1）取同样规格的试管7支，按下表精确地加入下列试剂：试剂（ml）管号12345671.0mol/L 乙
35、酸1.60.8000000.1mol/L 乙酸00410000.01mol/L 乙酸00002.51.250.62H2O2.43.2031.52.753.38溶液的pH3.53.84.14.75.35.65.9（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5%酪蛋白1ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。（3）用、+、+、+等符号表示各管的混浊度。根据混浊度判断酪蛋白的等电点。最混浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。【注意事项】缓冲液的pH值必须准确。五、 思考题：1解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。2该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？实验六 盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
36、血清蛋白质一、目的与要求学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术。二、原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯配胺(acrylamide，简称Acr)和双体(或交联剂)N，N甲叉双丙烯酰胺(methylenebisacry1amide，简称Bis)在催化剂和加速剂的作用下聚合交联成的三维网状结构凝胶。凡以此凝胶为支持物的电泳均称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis)。 聚丙烯酰胺是由丙烯酰肤和甲叉双丙烯酰脓在催化剂过硫酸胺或核黄素和加速剂N，N，N/，N/四甲基乙二胺(N，N，N/，N/tetrameth
37、yl ethylene diamine，简称TEMED)的作用下，聚合而成的。按其催化体系可将此聚合反应分为两类：第一类，过硫酸胺TEMED体系，又称为化学聚合，TEMED催化过硫酸胶水溶液产生出游离氧原子，然后激活单体，形成单体长链，在交联剂的作用下聚合成凝胶，在碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与过硫酸胺浓度的平方根成正比。此法制得的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶。 第二类，核黄素TEMED体系：此为光聚合作用。光聚合作用.通常需痕量氧原子存在才能发生，核黄素在TEMED及光照条件下还原成无色核黄素，后者被氧再氧化形成自由基从而引发聚合作用。过量氧会阻止链的增长。该法主要用于制备孔径大的凝胶
38、。核黄素对活性物质的影响较小。控制凝胶总浓度及交联度可以得到合适性能及孔径的凝胶。在操作时可根据被分离物的分子量大小选择所需凝胶的浓度范围。通常以7.5凝胶作标准胶，一般可获得较满意的效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳按其有无浓缩效应可分为连续及不连续系统。在连续系统中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要靠电荷及分子筛效应得以分离，在不连续系统中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度均不连续，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应和分子筛效应，还具浓缩效应，具有良好的清晰度及分辨率。按器材来分主要有垂直的圆盘电泳和板状电泳。样品浓缩效应 凝胶孔径不连续性：在不连续圆盘PAGE中凝胶由浓缩胶
39、和分离胶两部分组成，前者孔径大，后者孔径小，在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小，移动速度快，当进入小孔胶时，蛋白质颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢，因而在二层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在二层凝胶中均有三羟甲基氨基甲烷(简称Tris)及Hcl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH值，是缓冲配对离子。HCl在任何pH值溶液中均易解离出氯离子(Cl-)，它在电场中迁移率快，走在最前面故称为快离子或前导离子。在电极缓冲液中的甘氨酸(G1y)在pH8.3的环境中易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO-
40、)，而在pH6.7的凝胶缓冲体系中其解离度很小、仅有0.1一1因而在电场中迁移很慢，称为慢离子或尾随离子。血清中，大多数蛋白质pI在5.0左右，在pH8.3或6.7时均带负电荷在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快、慢离子之间，于是蛋白质就在快、慢离子形成的界面处，被浓缩成为极窄的区带。三者的有效迁移率顺序为：m氮a氮m蛋白a蛋白m甘a甘(m为迁移率，a为解离度)，当进入pH8.9的分离胶时甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面、然后再分成多个区带，因此浓缩胶与分离胶之间pH的不连续性是为了控制其有效迁
41、移率。在浓缩胶中要求慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品在快、慢离子界面之间被浓缩。进入分离胶后，慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。(3)电位梯度的不连续性：电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关(vmE)。迁移率低的离子在高电位梯度中可以与迁移率高而处于低电位梯度的离子具有相似的速度，在不连续系统中电位梯度的差异是自动形成的，电泳开始后由于快离子迁移率最大，就会很快超过蛋白质在快离子后面形成一个离子浓度低的区域即低电导区。低电导区就具较高的电位梯度，而高的电位梯度又使蛋白质和慢离子在快离子后面加速泳动。当快离子、慢离子和蛋白质的迁移率与电位梯度的乘
42、积彼此相等时，三者的泳动速度就相等。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳态建立后，二者之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面，即在高、低电位梯度之间形成一个迅速移动的界面。由于蛋白质的有效迁移率恰好位于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被压缩成一个狭小的中间层。 2分子筛效应 分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。经过浓缩胶的浓缩效应后，快、慢离子及蛋白质均进入pH8.9的同一孔径的分离胶中，此时高电压消失，在均一的电位梯度下由于G1y解离度增加，加之分子量较小，其有效迁移率增加，赶上并超过各种血清蛋白质。在同一孔径
43、的凝胶中各种血清蛋白分子迁移速度与分子量大小和形状密切相关，分子量小且为球形的蛋白所受阻力小移动快，走在前面，反之阻力大，移动慢，走在后面。从而通过凝胶的分子筛作用将各种蛋白质分成各自区带。 3.电荷效应 进入pH89的分离胶后，各种血清蛋白所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之则慢。 因此各种蛋白质按电荷多少，分子量大小及分子形状以一定顺序排列成一个个圆盘状的区带。此称为圆盘电泳。 PAGE的连续电泳也有很广的应用范围，但无浓缩效应，主要利用分子筛效应和电荷效应进行分离，其条件温和，对生物活性的保持有益。聚丙烯酷胺凝胶作为支持介质有一系列优点：在合适的浓度范围内，凝胶透
44、明，有弹性，机械性能好，化学性能稳定，与被分离物质不起反应，几乎无电渗作用；凝胶孔径可调节；分辨率高。目前在蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、定性、定量及小量制备、分子量测定、等电点测定等诸多领域广泛采用PAGE。 三、试剂 新鲜不溶血的动物血清 凝胶缓冲液(pH89)；取Tris366g，TEMED0.23ml,加1mol/L HCl48m1，再加重蒸水至80m1，溶解，调pH8.9,然后加重蒸水至100m1。棕色瓶4保存。 分离胶溶液(28AcrO.735Bis)：取28.0g丙烯酰胺和0.735g甲叉双丙烯酷肢，加重蒸水使其溶解后定容至100m1，过滤后置棕色瓶4保存。浓缩胶缓冲液(pH67)：取598gTris，046m1TEMED和48m1 1mo1L HCl，加重蒸水至80mI调pH值至67后定容到100mI，棕色瓶4保存。浓缩胶贮液：取10.0g Acr和2.5gBis，加重蒸馏水溶解后定容到100m1，滤后置棕色瓶4保存。过硫酸胺溶液：取分析纯过硫酸胺（AP）0.14g用重蒸馏水定容到100m1棕色瓶4保存，当天用当天配制。核黄素溶液：取4.0mg核黄素用重蒸水定容到100ml，棕色瓶4保存。40蔗糖溶液(WV)。Tris甘氨酸电极缓冲液(pH83)，取