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1、SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定摘要目的探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的分离和鉴定方法及其意义。方法以经体外培养及10JAM褪黑素药物干预的内皮祖细胞差异表达蛋白质为研究对象，分别采用TricineSDSPAGE和双向凝胶电泳方法进行差异蛋自分离及结果比较，以FTICRMS二级质谱鉴定。结果经TricineSDSPAGE分离后，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTICRMS分析，质谱鉴定为微管蛋白一a3(吻合度评分为87)。经双向凝胶电泳分离后，于凝胶近酸性端、分子量在7295kD之间区域，选取蛋白表达量较高的一点，质谱鉴定其为人热休克蛋
2、白90一Q(吻合度评分为91)。结论在本文结果中，TricineSDSPAGE对于大致3570kDa范围的蛋白分离较清晰、重复性好，且样品用量少。2-DE对最低上样量有较严格要求，但它能提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋自点，且对较大分子量蛋白的分离效果更佳。电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱分辨率高且质量稳定性较好。关键词：SELDI；TricineSDSPAGE；双向凝胶电泳；质谱SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorptionionizationtime of flightmassspect
3、romet巧)，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法。该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道【1,2】。本课题组前文3，41研究建立了SELDI蛋白质芯片技术检测体外培养细胞蛋白质差异表达方法，发现与传统方法比较，SELDI技术对于5kDa以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。但经SELDI技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。本研究在前文基础上进一步以内皮祖细胞(endot
4、helial progenitor cells，EPCs)细胞培养及褪黑素药物干预为研究对象，探讨以SELDI蛋白质芯片筛选后的细胞差异表达蛋白的进一步分离和鉴定方法及其意义。1.1研究对象采用10M褪黑素作用于培养至第7天并经免疫组化鉴定人脐血来源的EPCs，37、5CO2条件下培养24小时后，经细胞裂解提取的细胞总蛋自(样品于一80。C贮存)，分别采用TricineSDSPAG双向凝胶电泳方法进行分离蛋自及结果比较，采用二级质谱鉴定。2方法2.1差异蛋白质电泳方法选择2.1.1 TricineSDSPAGE分离蛋白(1)溶液的配制：TricineSDSPAGE的凝胶由不同分子组成的丙烯酰胺
5、和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合而成。其中浓缩胶由3C丙烯酰胺储存液配成4的丙烯酰胺溶液聚合而成，夹层胶由3C丙烯酰胺储存液配成10的丙烯酰胺溶液聚合而成，致密胶由5C丙烯酰胺储存液或6C丙烯酰胺储存液配成165的丙烯酰胺溶液(添加或不添加365尿素)聚合而成。凝胶配方如下表。丙烯酰胺储存液配制：(D3C丙烯酰胺储存液：将489丙烯酰胺和159甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。5c丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解479丙烯酰胺和259甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。6C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解4659丙烯酰胺和3Og甲叉双丙烯酰胺成100ml溶液。样品缓冲液：样品缓冲液由4SDS、12甘油、5
6、0mmolL Tris、2巯基乙醇(vv)，及少许溴酚蓝组成，pH68。考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G一250 100mg，95乙醇50mL，磷酸100mL，加双蒸水定容至1000mL，用Whatman 1号滤纸过滤，4X2保存。考马斯亮蓝脱色液：甲醇100mL，冰醋酸100mL，纯水定容至1L。TricineSDSPAGE蛋白质电泳溶液：正极缓冲液(i0)：121149Tris溶于400mL重蒸水，用10molL HCI调至pH89，定容至500mL。负极缓冲液(10 X)：将60559 Tris、89589 Tricine及59 SDS溶于400mL重蒸水中，加水至终体积为500mL。凝胶缓
7、冲液(3X)：将18159 Tris、159 SDS溶于400mL重蒸水中，用ImolL HCI滴定至pH845，再加水稀释至500mL。(2)灌胶：灌胶前，各种丙烯酰胺溶液分别加入10aL过硫酸氨和ilaL TEMED，随即灌胶。先灌下层的致密胶，再覆盖以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以聚合形成三明治式的不连续梯度凝胶。(3)点样：取10laL蛋白质标准品，10pM药物干预后细胞提取蛋白，煮沸5min使蛋自质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。(4)电泳：内槽加负极电泳缓冲液，外槽加正极电泳缓冲液，形成TrcineSDSPAGE电泳系统，20mA恒流电泳3h。考马斯亮兰染色后，用甘油
8、溶液孵育，并用凝胶成像仪成像。212双向凝胶电泳分离蛋白(1)用2D cleanup试剂盒抽提蛋自样品(除杂)(2)用双向电泳蛋白定量试剂盒测定样品浓度(3)双向电泳分离样品I第一向等电聚焦(IEF)将上述除杂后的样品，加水化液振荡溶解，放入标准型胶条槽中。选用7cm IPG胶条，从酸性端(标“+”端)一侧剥去保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条阳极端朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免产生气泡，最后放下IPG胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。IPG胶条上覆盖适量Immobiline DryStrip覆盖油，盖上盖子。将标
9、条槽的尖端背面阳极与IPGphor仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背与IPGphor仪器的阴极平台接触。设置IPGphor仪器运行参数：EttanTM IPGphor IITM Prot#3File 7cm(20，50AStrip)Step1 Stp 30V 14hStep2 Stp 200V lhStep3 Stp 500V lhStep4 Grd 1000V lhStep5 Grd 2000V lhStep6 Grd 5000V lhStep7 Stp 5000V 15000(vh)Step8 Stp 200V 3hStep9 Stp 0V END配制平衡胶条所需溶液：4X分离胶缓冲液(1
10、5M TrisHCI，pH88和04(wvSDS)：4559Tris和lgSDS溶于200mL去离子水中，用6N HCl调节pH到88，最后用去离子水将体积补足到250mL，加入25mg叠氮钠并过滤。平衡缓冲液(005M TrisHCl，pH88，6M尿素，30(wv)甘油和2(WvSDS)：1809尿素，1509甘油，109 SDS和167mL分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将体积补足到500mL。溴酚蓝溶液：25mg溴酚蓝溶于10mL分离胶缓冲液中。IPG胶条的第1次平衡：取出IPG胶条放入玻璃管中，加入使用前加入25mgDTT的25mL平衡缓冲液和125BL溴酚蓝溶液，用Parafilm
11、封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。IPG胶条的第2次平衡：加入使用前加入100mg碘乙酰胺的25mL平衡缓冲液和125BL溴酚蓝溶液，用Parafilm封口，在振荡仪上振荡15min，倒掉平衡缓冲液。用去离子水润洗IPG胶条1秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上数分钟，以去除多余的平衡缓冲液。IPG胶条的转移：将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG胶条轻轻向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。加入分子量标准蛋白质：分子量标准蛋白质溶液与等体积的1琼脂糖溶液混合后
12、，加入到IEF上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。用琼脂糖密封液封顶：用少量的密封液(约1一15mL)使IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。II第二向SDSPAGE溶液配制：丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺溶液(308T，26C)：30(WV)丙烯酰胺和08甲叉双丙烯酰胺的水溶液。将3009丙烯酰胺和89甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离子水将体积补足到1000mL。分离胶缓冲液(15M TrisHCI，pH86和O4(wv)SDS)：90859 Tris和29 SDS溶于400mL去离子水中，用6N HCI调节pH到86，最后用去离子
13、水将体积补足到500mL，加入50mg叠氮钠并过滤。lOwv)过硫酸铵溶液：ig过硫酸铵溶于10mL去离子水中。覆盖液(缓冲液饱和的异丁醇)：混合20mL上述分离胶缓冲液和30mL异丁醇，数分钟后去掉异丁醇层。取代液(50(vv)甘油和00 1溴酚蓝水溶液)：混合250mL甘油(100) 和250mL去离子水，再加入50mg溴酚蓝，搅拌数分钟。低熔点琼脂糖溶液：含有05(wv)低熔点琼脂糖的电极缓冲液。灌胶：本实验选用分离范围为14200kD、浓度为10的SDS分离胶。其组成为：10T的均匀胶，26C，0ISDS，375mM TrisHCI，pH88。配制方法是：单体贮存液333mL、4X分离
14、胶缓冲液25mL和IOSDS ImL溶解于402mL去离子水中，灌胶前加入TEMED 33ILL和10过硫酸铵500DL。按仪器说明书装好灌胶模具，倒入凝胶溶液(本实验制备Imm厚的胶，需凝胶溶液1 0mL)。灌胶后立即在凝胶上方铺上一层用水饱和的异丁醇覆盖液，以减少凝胶暴露于氧气，形成平展的凝胶上样面。电泳：电泳槽中装满电泳缓冲液，打开温控系统，调节温度为12。C；将平衡好的IPG胶条浸入电极缓冲液中数秒；将IPG胶条小心放置于SDS胶面上，轻压使二者充分结合，上面覆盖2mL热的琼脂糖溶液(75。C)，使琼脂糖在5min内凝固；将胶盒插入电泳槽中，开始垂直的SDS胶电泳(参数设置：10mAg
15、elI 5min，之后20mAgel约5h)当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳；跑好的胶转移到染色盒里固定，准备染色。(4)硝酸银染色：银染试剂的配制：银染步骤：取出凝胶，置于固定液中，30min；弃固定液，换敏化液，敏化30min；弃敏化液，以双蒸水洗3次，每次5min；弃双蒸水，换染色液染色20rain，染色时盖报纸避光；弃染色液，以双蒸水洗2次，每次1min；弃双蒸水，换显色液显色25 min，至蛋白点完全显现为止；弃显色液，立即换终止液，终止10min；弃终止液，以双蒸水洗3次，每次5min。(5)凝胶成像仪成像22差异蛋白质的二级质谱鉴定221蛋自消化根据SELDI差异表达检
16、测结果，分别选择TricineSDS胶上53kDa左右蛋白差异表达点和2-DE胶近酸性端、分子量在7295kD之间区域表达较显著一点，用15mm切胶笔切下，置于EP管或96孔PCR板中，并记录点号及相应的位置；加50aL ddH20洗两次，10min次；加50 mM NH4HC03乙腈=1：1溶液(考染脱色液)50DL，37。C脱色20min，吸干；重复步骤，直至蓝色褪去；加乙腈501JL脱水至胶粒完全变自，真空抽干10min；加10 mM DTT(10DL 1M DTT，990pL 25mM NH4HC03配制)20pL，56水浴lh；冷却到室温后，吸干，快速加55 mM认M(551aL 1
17、M认M，945】L 25mMNH4HC03配制)20DL，置于暗室45min；依次用25 mM NH4HC03(2X10min)、25 mM NH4HC03+50乙腈溶液(2X10min)和乙腈洗(10min)，乙腈脱水到胶粒完全变自为止，真空抽干10min；将01l】glaL的酶储液以25 mM NH4HC03稀释10-20倍，每EP管加2-3DL，稍微离心一下，让酶液充分与胶粒接触，4。C或冰上放置30min，待溶液被胶块完全吸收，加25mM NH4HC03至总体积1015JL置37。C，消化过夜；加入TFA终止反应，使其终浓度为01，振荡混匀，离心。备用。222上样及打点操作质谱条件多肽
18、溶解于V(水)：V(甲醇)：V(乙酸)=49：49：2混合溶液中，将样品置于96孔板自动进样系统中，利用配有Nanospray技术(长I 5cm的Proxeonnano-ESI发射器，填充物为直径3pm的C 1 8树脂)的FTICRMS，测定样品的质谱图。流动相A为05乙酸一995水，B为90乙腈一95水一05乙酸，流速为500 nLmin，梯度洗脱。基质：溶质(CHCA 2mg)+溶剂(700ACN、01TFA)配成49L的溶液。点样：取样品(考染点IpL，银染点3pL分两次)点在anchorchip靶上，晾干。点标准品：将配好的基质溶液稀释60一70倍，用长枪头吸取约01pL基质点在晾干的
19、样品上，晾干即可。除盐：用01TFA约IpL点在靶点上再吸走，点两次。223上机检测信号：FTICRMS金属毛细管电压：2500 V；毛细管温度：110；锥孔电压：一30V，碰撞激发电压：2732 V；碰撞气体为高纯氮气，脉冲时间：250 ms。224质谱数据库检索通过Mascot软件(http：wwwmatrixsciencecomlcgisearchform)进行查询。具体参数设置如下：检索类型：肽质量指纹图谱(PMF)；种属：人类；酶：胰蛋白酶；固定修饰：C位点脲甲基；可变修饰：M位点氧化；蛋自质分子质量：不限定；肽质量偏差：+10ppm。实验结果差异蛋白质电泳方法选择1.1Tricin
20、eSDSPAGE分离差异蛋白TricineSDSPAGE分离低分子量蛋白质标准品和细胞蛋白结果见图1。图中，A为低分子量标准品，B为细胞蛋白样品(两列复孔)，C为不加药空白对照组细胞蛋白样品。如图中所示，电泳清晰的分离了低分子量蛋白质标准品，并能够分离蛋自样品条带，但由于蛋白浓度较高，并种类多，条带密集。12双向凝胶电泳分离差异蛋白双向凝胶电泳分离蛋白结果见图2。图中，左端为IPG胶条酸性端，右端为碱性端，最右侧条带示蛋白标准品及其对应分子大小，中央区为褪黑素药物干预后细胞蛋白样品的分离结果。如图，2-DE电泳根据蛋白质分子量和等电点的不同清晰地分离出数十个蛋自点，其中箭头所示为进行后续质谱鉴
21、定所选取的蛋白点。2差异蛋白质的FTMS二级质谱鉴定21在褪黑素干预组的EPC提取蛋白TricineSDSPAGE中，对应SELDI蛋白表达差异结果，在表达差异点中，选取的分子量为53kDa左右的趋势性的差异表达蛋白进行FTMS分析，得到该蛋白的指纹质谱图(如图3)，通过该质谱图进行数据库检索鉴定，该蛋白为微管蛋白一Q3，吻合度评分为87分(如图4)。22由褪黑素干预组的EPCs提取蛋白经2-DE分离后，选择胶上近酸性端、分子量在7295kDa之间区域表达较显著一点进行FTMS分析，得到该蛋白的指纹质谱图(如图5)，通过该质谱图进行数据库检索鉴定，该蛋白为人热休克蛋白90一Q，吻合度评分为91
22、分(如图6)。讨论疾病时细胞蛋自质的组成及变化与正常状态下有很大差异引，因此有效地鉴别细胞表达的蛋白变化将为疾病的诊断、监测和药物治疗作用机制提供依据16,7J。SELDI蛋自质芯片技术，是近几年迅速发展起来的用于蛋白质组学研究的一项新技术，它是在MALDI(matrixassisted laser desorptionionization)基础上改进后实行表面增强的飞行质谱，基于该技术，利用经过化学性(阴离子，阳离子，疏水或亲水性)或者生物性(抗原一抗体，配体一受体，酶一底物等)修饰的芯片，能够选择性地结合被检标本中的某些蛋白质，被结合的蛋白质添加能量吸收分子后，通过激光的作用，解离成正电离
23、子，当共通过电场时，其在电场中的飞行时间因质荷比的不同而不同，检测到的信号由高速模拟数字转换器转换并记录，最后经过TOF质谱分析的数据以蛋白分子量I$I对丰度输出，被检测蛋白质以一系列峰值的形式呈现，这些特异性波峰构成指纹图谱18-io】。SELDI蛋白质芯片技术的出现为蛋白质差异分析提供了新的有力工具，目前已应用于如多种传染病及恶性肿瘤标志物检测中11,21。在应用上具有分析速度快、样品用量少(每次分析只需要05-51aL或2000个细胞的超微量样本)、可检测的分子量范围广(可分析10kDa以下的小分子量蛋白1到250kDa左右的大分子量蛋白10，121)、检测样品无需复杂预处理可直接点样检
24、测、选择性好和高通量等优势13艺引。但SELDI技术在蛋白质精准鉴定上仍有其局限性，本课题组前文141应用SELDI蛋白质芯片技术进行培养的内皮祖细胞差异蛋白质检测研究发现，SELDI结果仅能初步鉴定差异蛋白的质荷比峰而不能准确鉴定出具体的蛋自质分子。故本研究对SELDI进行的差异蛋自的前期筛选结果，并根据所得到的SELDI差异表达峰有目的地进行后续电泳分离并利用该差异峰所提供的分子量信息指导质谱鉴定中蛋白点的选择。前期研究41中，在相对分子量1 000-300 000 Da的范围内，蛋白芯片上共捕获87个蛋白峰并有17个趋势性差异峰，本文选取其中趋势性差异较显著的两个蛋白点，分别采用Tric
25、ineSDSPAGE和双向凝胶电泳方法进行蛋白分离。TricineSDSPAGE是根据Laemmli系统改良建立的电泳方法l。在传统Laemmli系统中，小分子短肽的浓缩是较困难的，因为小分子短肽与SDS形成的复合体具有与SDS本身类似的电荷和大小，会出现短肽一SDS复合物与SDS颗粒共迁移的现象，导致分子量小于1 kDa的短肽无法取得较好的分离效果24,25。而经Schagger等报道m1改进该方法，用TrisTricine体系代替Trisglycine体系后可很好地分离分子量在1100 kDa的蛋白质。该方法降低了分离胶的pH值(pH 845)，使蛋自质的移动速度变慢，提高了电泳分辨率；其
26、次，采用不连续的电极缓冲体系和使用Tricine替代甘氨酸作为慢迁移离子，解除短肽一SDS复合物与SDS颗粒的共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果mj。本研究考察该方法的灵敏度与分辨率，结果发现大致在3570kDa范围的蛋白(例如53kDa的微管蛋白-a3)在TricineSDSPAGE中肉眼即能观察到清晰的分离条带(如图1)且重复性较理想(如图1B复孔)。与2-DE相比，TricineSDSPAGE在分离小分子量的蛋白质尤其对疏水性蛋白质上具有优势，且样品用量少，但它不能如2-DE提供分子量、等电点双重参数来更准确定位所感兴趣蛋白点，且对大分子量蛋白的分离效果不如2一DE。本研究是基于SE
27、LDI蛋白质芯片筛选结果来选择电泳方法进行蛋白分离，由于SELDI蛋白质芯片筛选即利用不同性质芯片对蛋白的特异性吸附、当结合后进行激光解离、再基于分子量差异的蛋白质分离技术，因而TricineSDSPAGE法所仅能提供的单个分子量参数的分离，与其前期SELDI筛选时即已获得的数据形成重复，它对结果具有一定的检验意义，但不能新增更多的参数指导；双向电泳技术能够通过它所提供的具体分子量和等电点的双参数信息来更加准确地定位特定蛋白点，因而能为质谱鉴定选点提供更精细的指导意义。然而由于双向凝胶电泳对最低上样量有较严格要求，即使如本实验选用小胶双向电泳也需至少保证501】g的上样量，因此为保证上样量我们
28、采用各浓度褪黑素干预组细胞所提总蛋白混合样品进行2一DE分离；同时为满足不同样品混合后仍具有有效的蛋白鉴定意义，本实验选取SELDI检测蛋自差异表达结果中各浓度组均比空白对照组表达增高的差异峰下所覆盖的分子量信息所对应的蛋白点进行鉴定。近年来随着质谱技术的不断进步，质谱分辨率越来越高，本研究蛋白鉴定采用的电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱是一种具有超高质量分辨能力的新型质谱仪，它将电喷雾离子化(ESI)技术结合于傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICRMS)。在离子源的电离技术上，ESI技术与传统的电子轰击(E1)电离、化学电离(CI)、场解析(FD)离子化技术及快原子轰击(FAB离子化技
29、术相比，具有更适于离子性极性化合物、质荷比小于4000、化学噪音低、容易获得碎片离子信息、所鉴定蛋白质分子量可达1，000，000Da等优点，但其离子源结构复杂，易受Na+、K+等金属离子干扰，且不能用于分析非极性化合物的缺点仍难以避免。在质量分析器上，与磁质谱仪、四极质量过滤器质谱仪、离子肼质谱仪相比，FTICRMS具有较扫描型质谱(磁质谱、四极杆等)高得多的灵敏度；且其感应电流检测离子的方式是非破坏性的，离子可继续被储存、分析，从而实现多级质谱分析；具有超高分辨能力和质量精确度(很容易实现几十甚至上百万的分辨率，无需内标就能达到小于2ppm的质量准确度，是现有分辨率最高且质量稳定性较好的目
30、前蛋白质和肽段测序中的顶端质谱仪。本研究中所选两种目标蛋白均为分子量均大于50kDa的极性分子，因而仅从各电离技术适用的质量范围上即可首先对排除El(小于1000Da)、CI(zJ,于1000Da)、FD(小于2000Da)、FAB(2006000Da)等的选择，而选用所鉴定蛋白质分子量可达1,000，000Da且尤其适于离子性极性化合物的ESI技术。而在质量分析器的选择上，磁质谱仪虽堪称经典，但不能较好地与离子化技术连用、且体积大造价高；四极质量过滤器质谱仪虽体积小造价低且重复性好，但分辨率较低；离子肼质谱仪动态范围窄、不便确定是否适用于目标蛋白，且易受检测器条件等多个仪器参数的影响因而重复性略差。故经综合考虑，选用FTICRMS，并经Mascot数据库检索，获得了较好的吻合度评分。综上所述，本研究以SELDI蛋白质芯片技术进行了蛋自质差异表达筛选，并进行差异蛋自的后续分离鉴定，发现采用双向凝胶电泳方法能更有效地从蛋自质混合液中分离出目标蛋白，进一步经FTICR-MS获得了较理想的鉴定结果。