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1、第十三章 核酸化学内 容41 核酸的概念和重要性 13942 核酸的类别、分布和组成 139421 类别 139422 分布 140423 组成 14043 核苷与核苷酸 143431 核苷 1434311 核苷的结构 1434312 修饰核苷 144432 核苷酸 1444321核苷酸的结构 1454322 核苷酸的性质 1474323 核苷酸的重要衍生物 14744 核酸的结构 150441 核酸的一级结构 1504411 核酸分子中核苷酸之间的连接键 1504412 与核酸结构研究有关的工具酶 1504413 DNA一级结构的测定 1534414 RNA一级结构的测定 155442 DN
2、A的二、三级结构 1554421 DNA的二级结构（双螺旋结构） 1554422 DNA的三级结构 157443 RNA的二、三级结构 15945 核酸的性质 164451 性状和溶度 164452 分子大小 164453 吸收光谱 164454 变性、复性与杂交 1654541 变性 1654542 复性 1654543 杂交 167455 沉降 167456 降解 16746 核酸的生物学功能和实践意义 168461 核酸与遗传信息的传递和表达 1684611 DNA是基本遗传物质 1684612 RNA在传递遗传信息上的作用 1704613 反转录 170462 核酸与蛋白质的生物合成
3、170463 核酸结构改变与生物变异 171464 DNA与细菌转化 172465 核酸与病变 1724651 核酸与遗传性疾病 1724652 核酸与病毒 173466 DNA的损伤和修复 174467 基因重组与遗传工程 174468 克隆（clone）与克隆化（cloning） 175469 核酸及其水解产物在人类生活上的实践意义 17647 核酸的分离、合成和鉴定原理 177471 分离和纯化 177472 合成 177473 鉴定和含量测定 178总结性思考题 178提要及学习指导 本章主要介绍核酸的化学本质、结构和功能 总的要求是：1了解核酸的化学本质及DNA和RNA在组分、结构和
4、功能上的差异。2弄清楚嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸和核酸在分子结构上的关系。3了解核酸的结构和它们的性质、功能的相互关系。4认识核酸在生物科学上的重要性及其实践意义。在学习本章时要注意：核苷酸是核酸的基本组成单位，应以腺嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸为代表，彻底弄清楚核苷酸的化学结构和化学性质。为了学好核苷酸的结构，首先要结合有机化学把嘌呤和嘧啶的基本结构搞清楚，同时也要把核酸中存在的腺嘌呤、鸟嘌呤同嘌呤核的关系，胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶同嘧啶核的关系以及D-脱氧核糖同D-核糖的关系搞清楚，最好能记熟。注意嘌呤（指腺嘌呤、鸟嘌呤）、嘧啶（指胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶）同核糖（或脱氧核糖）在哪个部位连接成核
5、苷。核苷如何同磷酸连接成核苷酸（包括核苷二磷酸、核苷三磷酸），核苷酸又如何连接成一级结构的核苷酸链。并要特别注意核酸的二、三级结构中碱基的配对规律。从分析比较核酸分子的组成和结构上的特点，进而联系它们的性质和生物功能。41 核酸的概念和重要性核酸最早是在1868年由瑞士的一位年青科学家米歇尔（F.Miescher）发现的，他当时从外科绷带的脓细胞中分离出细胞核，再从细胞核中分离得到了一种含磷很多的酸性化合物，称它为核素（nuclein），实际上就是我们现在所指的核蛋白。从实验结果知道，核蛋白初步水解后可产生蛋白质和核酸。核酸水解后产生多个分子的核苷酸，因此，核酸又称多核苷酸。核苷酸水解后产生磷
6、酸及核苷，后者水解产生核糖（或脱氧核糖）、嘌呤或嘧啶。由此可知，核酸是核蛋白的组分之一，是单核苷酸的多聚体（多核苷酸），呈酸性，最初从细胞核中发现，故称核酸。核酸对生物遗传和蛋白质生物合成皆有重要功用，对肿瘤和许多其他疾病的发病也有重要作用。42 核酸的类别、分布和组成421 类别 核酸分核糖核酸（简称RNA）与脱氧核糖核酸（简称DNA）两类。RNA中又分mRNA、tRNA和rRNA3种。信使RNA（messenger RNA，简称mRNA）约占总RNA的5左右，为单链结构，不同细胞的mRNA的链长和相对分子质量的差异很大，其功用为将DNA的遗传信息传递到蛋白质的合成基地（核糖体）。新合成的肽
7、链的氨基酸顺序即根据mRNA所传递的信息来决定的。转移RNA（transfer RNA，简称tRNA）约占细胞总RNA的1015，在蛋白质生物合成过程中起转运氨基酸到核糖体和翻译的作用。tRNA有很多种，已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。tRNA分子的大小很相似，链长一般在7388个核苷酸之间，最长的有93个核苷酸（大肠杆菌Ser-tRNA）。相对分子质量一般约为25000。核糖体RNA（ribosomal RNA，简称rRNA）约占全部RNA的80%，是核糖体的核酸，因此得名，其结构为单链螺旋，不稳定。原核细胞的rRNA有23S、16S和5S 3种，真核细胞的rRNA有28S、18S
8、，5.8S和5S 4种。rRNA的功用尚不甚清楚，但必须与蛋白质的生物合成有密切关系，很可能与新合成的蛋白质粒子聚合成具特定构象的蛋白质分子有关。DNA 分腺嘌呤-胸腺嘧啶型（A-T型）和鸟嘌呤-胞嘧啶型（G-C型）。前者含腺嘌呤和胸腺嘧啶较多，后者含鸟嘌呤、胞嘧啶较多。422 分布 DNA主要存在于细胞核的染色质（chromatin）中，线粒体和叶绿体中也有。90的RNA存在于细胞质中，10存在于细胞核中。rRNA 主要存在于核糖体内。423 组成 RNA与DNA皆含氮碱（嘌呤、嘧啶）、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸。DNA与RNA组分上的异同见表4-1。一般而论，RNA与DNA成分的差别仅在
9、于糖和一个嘧啶。在DNA分子中以D-2-脱氧核糖代替了RNA的D-核糖，以胸腺嘧啶代替了RNA的尿嘧啶。这些成分与核酸的结构和性质都有关系。在讲核酸的结构和性质之前有必要对核糖、嘌呤碱、嘧啶碱的结构和性质作扼要陈述。一、核糖及脱氧核糖 RNA所含的糖为D-核糖，DNA所含的糖为D-2-脱氧核糖，其结构式如第141页所示。D-核糖与浓 HCl和甲基间苯二酚混合后，加热呈绿色（因核糖与酸作用产生糠醛，糠醛与甲基间苯二酚和FeCl3作用呈绿色）。D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热呈蓝色（因D-2-脱氧核糖与酸作用产生-羟基-酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色）。此二反应可作RNA和DNA的测定基础。二
10、、嘌呤碱 为核酸中的嘌呤类物质，主要为腺嘌呤和鸟嘌呤两种，次黄嘌呤与黄嘌呤是腺嘌呤的代谢产物。三、嘧啶碱 核酸中存在的嘧啶碱有胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶3种，它们的结构式如第142页所示。DNA含胸腺嘧啶，不含尿嘧啶，RNA则相反。在高等植物、胸腺和小胚DNA中尚含有少量5-甲基胞嘧啶。几种大肠杆菌（E.coli）、噬菌体的DNA中发现5-羟甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。几种细菌DNA中已证明含少量6-甲氨基嘌呤。这些稀有的微量碱基衍生物称稀有碱基（minor base）或修饰碱基（modified base）。这类碱基大多数是甲基化碱基，也有硫代，甲硫代、乙酰化及带各种侧链的碱基。必须注意的是：含酮基
11、的嘧啶碱和含酮基的嘌呤碱皆有酮式和烯醇式互变异构现象而且处于平衡状态，书写时用任何一种皆可。例如上面所举的鸟嘌呤和尿嘧啶的结构式就各有上列两种形式，其他含酮基的嘌呤和嘧啶类推。由于变成烯醇式后，OH的H可以解离，因此呈酸性，此种异构现象与核酸解离有关。嘧啶碱与嘌呤碱分子中皆有共轭双键，对紫外线（波长260nm左右）有强烈的吸收能力。每一碱基各有其特殊的紫外线吸收光谱，因此可利用此性质鉴定不同的碱基。由于有的碱基环状结构上带有OH基（烯醇式），有的环上含有=N结构，其解离常数各不相同（烯醇式羟基可解离释放H+，呈酸性，=N可接受H+而变为=N+H，呈碱性），紫外线吸收光谱因而随pH的改变而改变。
12、嘧啶碱和嘌呤碱较稳定，不被稀酸、稀碱破坏，和苦味酸可结为晶体。嘌呤碱还可被银盐沉淀，这对于嘌呤碱和嘧啶碱的分离和鉴定皆有裨益。43 核苷与核苷酸用核酸酶水解核酸可得到核苷酸。RNA和DNA各得4种核苷酸。核苷酸经核苷酸酶水解又产生核苷和磷酸。由这些事实可见核苷酸必然为核酸的组成单位，而核苷与磷酸又必然为组成核苷酸的基本物质。这种关系可表示如下：431 核苷 从核苷酸水解产物中分别发现有几种核苷（表4-2）。4311 核苷的结构 由于用核苷酸酶水解核苷酸产生核苷，而用酸或核苷酶水解核苷酸又可得嘧啶（或嘌呤）和核糖磷酸酯，可知嘧啶和嘌呤在核苷酸（或核酸）分子中是与核糖或脱氧核糖相连接成核苷，核苷的
13、糖基是与磷酸连接成核苷酸。经用X射线衍射分析证实嘌呤核苷是嘌呤第9位N与核糖或脱氧核糖第1位碳相连。嘧啶核苷则由嘧啶第1位N与糖第1位碳相连。最典型的核苷可用以下二式代表：腺苷、鸟苷、胞苷和它们相应的脱氧核苷以及脱氧胸苷的结构式可照例类推。核糖核苷糖基的第2、3或第5位和脱氧核苷糖基的第3或第5位上的羟基皆可分别磷酸酯化，产生不同的核苷酸异构体。天然核酸只有5-核糖磷酸酯。4312 修饰核苷 也称稀有核苷。核酸分子中存在的核苷，除表4-2所列8种常见的正常核苷外，还有许多种修饰核苷，包括由修饰碱基与核糖或脱氧核糖及由正常碱基与修饰核糖（如2-O-甲基核糖）组成的核苷以及碱基和糖连接方式特殊的核
14、苷三类。现各举一例如下：修饰核苷常用缩写代号表示，其方法通常是将碱基取代基、取代位置和取代基数目写在核苷单字代号（例如A）的左边，用小写英文字母代表取代基例如用m代表甲基，用数目字表示取代基的位置和数目，写在取代基代号（例如m）右上角的数字（例如2）为取代基在核苷分子碱基环上的位置，写在右下角的数字，为取代基的数目，如仅有一个取代基，“1”字不写例如m2A即表示腺苷的嘌呤环第2位的一个H被甲基取代了。同理，A表示腺苷嘌呤环上的第6位有两个甲基取代基，即N6，N6-二甲基腺苷。在核糖上修饰的核苷，即核苷的糖分子中OH基的H被其他基团取代后的产物，例如2-O-甲基核苷，其表示方法即在其核苷单字代号
15、（例如A）的右边加上代表取代基的小写字母代号，例如m，成为Am。Am的全名为2-O-甲基腺苷。即腺苷的核糖第2位上OH基的H被甲基（m）所取代。少数修饰核苷直接用单字代号表示，如5，6-二氢尿苷用D表示，假尿苷用表示，肌苷用表示。其他修饰核苷的结构将于第443节讲RNA的二、三级结构时再作补充。432 核苷酸 核苷酸是核苷的磷酸酯，由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖和磷酸所组成。含核糖的核苷酸称核（糖核）苷酸，含脱氧核糖的核苷酸称脱氧核（糖核）苷酸。RNA和DNA的基本核苷酸有下列几种（表4-3）：此外，胸腺DNA中尚有少量5-甲基胞嘧啶脱氧核苷酸；在大肠杆菌、噬菌体DNA中含5-羟甲基胞嘧啶脱
16、氧核苷酸。还有含6-甲基腺嘌呤脱氧核苷酸的DNA4321 核苷酸的结构 核苷酸是核苷的磷酸酯，其分子中糖与碱基（嘌呤碱或嘧啶碱）的连接方式完全与上段所述核苷的结构相同。现在要讨论的是磷酸如何与核糖或脱氧核糖相连。核糖基的第2、3和第5碳位上皆有自由羟基，可分别与磷酸连接生成3种核糖一磷酸酯异构体。同理，D-2-脱氧核糖的第3和第5碳位上的自由羟基亦可与磷酸结合成两种脱氧核糖一磷酸酯。因此，腺嘌呤核糖核苷酸的核糖第1碳位上的-OH基即是与嘌呤的第9位氮相连，而核糖基与磷酸结合所成的磷酸一酯就有腺嘌呤-9-D-核糖-2-磷酸酯、腺嘌呤-9-D-核糖-3-磷酸酯和腺嘌呤-9-D-核糖-5-磷酸酯3种
17、（式-）。同样，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸分子中的脱氧核糖基的第1碳位的-OH基与胞嘧啶第1位的N相连，而其第3或第5位的OH基则与磷酸结合成胞嘧啶-1-D-脱氧核糖-3-磷酸酯或胞嘧啶-1-D-脱氧核糖-5-磷酸酯（式-）。同理，其他核苷酸如鸟苷酸、胞苷酸及尿苷酸等亦各有3种磷酸一酯。各种脱氧核苷酸如脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸及脱氧胸苷酸等，亦各有2种磷酸一酯。上述核苷酸的结构是经有机合成法证实了的。自然界存在的自由核苷酸主要为5-磷酸酯。表示磷酸同核苷糖基碳位连接的方法是将标志有关碳位的数字如2、3或5加入有关核苷酸的名称之内。例如磷酸与腺苷糖基的第5位碳元素连接所成的核苷酸腺嘌呤-9-D-核糖-5
18、-磷酸酯，称5-腺苷-磷酸。如不表明磷酸与核苷糖基碳位连接的关系，则可泛称腺苷酸（AMP）。其他核苷酸的命名可照此类推。动植物细胞中的核苷酸除以上述链式磷酸酯结构存在外，还有环式结构，即核苷酸的5-磷酸与核糖C-3的羟基结合成环，例如环AMP（代号cAMP）和环GMP（代号cGMP）。cAMP经磷酸二酯酶水解即产生5-AMP。cAMP为若干激素作用的媒介物。因为某些激素对靶细胞的作用可改变cAMP的合成速度，cAMP浓度的变化又影响细胞的通透性和酶的活性，从而使细胞因某一种激素而产生特异反应。因此cAMP对某些代谢作用（糖、脂代谢）起一定的调节作用。cGMP亦广泛分布于各种组织中，但浓度很低。
19、其功用尚不很清楚。目前一般认为cGMP也和激素的作用有关，对调节代谢、细胞发育（如淋巴细胞增生）和DNA合成都有关系。cGMP的作用同cAMP有相互制约的关系。有实验指出，cAMP/cGMP的比率在调节过程中比它们各自的浓度更为重要。有关cAMP和cGMP的功用将在以下有关各章中（激素和代谢）再作讨论。cAMP和cGMP不是细胞中仅有的环核苷酸，最近已有人从组织中发现cIMP和cCMP，这说明体内使核苷酸环化的环化酶不止一种。4322 核苷酸的性质 一般物理性质 核苷酸为无色粉末或结晶，易溶于水，不溶于有机溶剂，具有旋光性。在酸性溶液中不稳定，易破坏，在中性及碱性溶液中很稳定。 互变异构现象
20、凡碱基上有酮基的核苷酸有酮式和烯醇式的互变异构现象。酮式和烯醇式两种互变异构体常同时存在，并处于一定的平衡状态。在体内核酸结构中酮式占优势，这对于核酸分子中氢键的形成是很重要的。 紫外吸收 由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，所以碱基、核苷及核苷酸在240290nm波段有一强烈的吸收峰，其最大吸收值在260nm附近。不同的核苷酸有不同的紫外吸收曲线，因此可用紫外分光光度法作核苷酸的定性和定量测定。 核苷酸的两性解离和等电点 核苷酸分子既含磷酸基，又含碱基，是两性电解质，在不同pH值的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成两性离子，有等电点。图4-1为4种核苷酸的解离曲线。在腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和
21、尿苷酸中，pK1是由于第一磷酸基PO3H2的解离，pK2是由于含氮环（碱基）上=N+ H的解离，pK3是由于第二磷酸基PO3H-的解离，pK4是含氮环上烯醇式羟基的解离。从核苷酸的解离曲线中可以看出，在第一磷酸基和含氮环解离曲线的交叉处，带负电荷的磷酸基与带正电荷的含氮环数目相等，这时溶液的pH值即为此核苷酸的等电点。在等电点时，上述核苷酸主要以两性离子形式存在，核苷酸的PO3H-基在溶液pH值小于pI时即开始与H+结合成PO3H2，因此，=N+H数量比PO3H数量为多，核苷酸带正电荷。反之，当溶液的pH值大于pI值时，=N+H上的H+解离下来，核苷酸即带负电荷。尿苷酸的碱基碱性很弱，实际上测
22、不出其含氮环的解离曲线，故不能形成两性离子。核苷酸中磷酸基在糖环上的位置对其pK值略有影响，由于静电场作用，磷酸基与碱基之间的距离越小，其pK值应越大。例如2-胞苷酸的pK1值为4.4，比3-胞苷酸的pK1值4.3为大。4323 核苷酸的重要衍生物 生物体内的自由核苷5-磷酸可以在第5位上进一步磷酸化而产生核苷二磷酸和核苷三磷酸。例如腺苷-磷酸（AMP）可以磷酸化成腺苷二磷酸（ADP）和腺苷三磷酸（ATP）。同样，其他核苷5-磷酸也可进一步磷酸化成相应的核苷二磷酸和核苷三磷酸。在生理上较重要的核苷酸衍生物为ADP、ATP、GTP（鸟苷三磷酸）、UDP（尿苷二磷酸）和CTP（胞苷三磷酸）。ADP
23、、ATP与机体的能量转换有关，GTP参与蛋白质和腺嘌呤的生物合成，UDP参与糖的互变作用，CTP在磷脂的生物合成中起主要作用。此外，生物体中还有一些核苷酸衍生物或类似核苷酸的化合物，如尿苷-5-二磷酸葡糖（UDPG）在代谢中作为辅酶以供给葡萄糖；烟酰胺核苷酸、核黄素腺嘌呤二核苷酸和辅酶A等都参加氧化还原和其他代谢（将见酶和代谢各章）。思考题1试写出cCMP、GTP、UDP和UDPG的结构式。2RNA与DNA所含的核苷酸有何区别？嘌呤核和嘧啶核的标号（即元素的数序）是如何标记的？核苷酸及其衍生物，不仅在理论上有其重要性，在生产和生活实践上亦日趋重要。粗制混合核苷酸（RNA的降解产物，如肌苷酸（次
24、黄苷酸）及5-鸟苷酸可用于食品工业，作助鲜剂。由于实践需要，我国已逐渐在生产核苷酸和ATP。目前生产ATP的方法主要是利用谷氨酸发酵的“下脚”（谷氨酸菌）和白地霉（Geotrichum candidum Link）作原料，在适当条件下将原料所含的RNA水解成核苷酸混合液，再经分离（用离子交换法）即可得AMP。然后用酵母菌使AMP磷酸化即可得ATP。新近发现核苷酸的衍生物中还有一些与蛋白质生物合成有关或对基因转录有调节功用，例如：5-5相连的二核苷多磷酸化合物如A5PPPP5（简称AP4A）是1966年发现的。在原核生物中，AP4A是在蛋白质合成的第一步即氨基酸活化时形成的，并能代替ATP使氨基
25、酸活化，使氨基酸接到tRNA上去，因此认为AP4A可能是体内的一种调节因子。在哺乳动物中AP4A与细胞生长速度之间有明显的联系，很可能是一种起促进作用的信号分子。它的结构式如下：鸟苷四磷酸（PPGPP）和鸟苷五磷酸（PPGPPP）是1969年发现并弄清结构的多磷酸鸟苷酸。它们参与细菌基因转录的调节作用。PPGPP的结构式如下：44 核酸的结构本节将讨论核酸的一级结构和二、三级高级结构。441 核酸的一级结构4411 核酸分子中核苷酸之间的连接键 有很多实验证明在RNA和DNA分子中核苷酸之间的连接皆是磷酸二酯键，而且是由一个核苷酸的核糖或脱氧核糖第5位的磷酸与另一核苷酸的核糖或脱氧核糖第3位的
26、OH基相连成3，5-磷酸二酯键，简称C3OPOC5键。RNA和DNA的多核苷酸皆无支链。下列二式表示两类多核苷酸链的部分结构。核酸的多核苷酸锭可用简写法表示，例如DNA的结构可简写如下。简式的读向是由左向右，上面的简式应读为：P5A3P5C3P5G3或PAPCPG式中A、C、G分别代表腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤，竖线代表戊糖，对角线中间的P代表连接两个核苷酸的磷酸二酯键，3、5分别代表核糖和脱氧核糖的3-OH和5-OH基。碱基顺序是53，代表特定的化合物，是不允许颠倒的。新近在动、植物和细菌DNA中发现有3个脱氧胞苷酸和45个胸苷酸连续排列在一起的事实，可见不同种DNA的多核苷酸链的核苷酸排列次序
27、各有不同。4412 与核酸结构研究有关的工具酶 与核酸结构研究有关的工具酶有核糖核酸酶类、脱氧核糖核酸酶类、非专一性核酸酶类等。1核糖核酸酶类 这是一类水解RNA的酶，它们广泛存在于动、植物和微生物中，常用的有牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1。牛胰核糖核酸酶 简称RNase A或RNaseI，它存在于牛胰中，1940年已制得结晶。它只作用于RNA，不作用于DNA。相对分子质量为14000，最适pH为7.08.2，十分耐热。RNaseA是具有高度专一性的内切酶，其作用点为嘧啶核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键，生成3-嘧啶核苷酸或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，如第152页图所示。（图中的Pu表
28、示嘌呤碱，Py表示嘧啶碱）。RNA分子中的部分多核苷酸链结构DNA分子中的部分多核苷酸链结构水解的机理与碱对RNA的降解十分相似，都要经过环状2，3-核苷酸这一中间物，最终产物为3-核苷酸。核糖核酸酶T1 简称RNaseT1，这是从米曲霉中分离得到的一种内切酶，相对分子质量较小，耐热、耐酸，具有比RNaseA更高的专一性，其作用点为鸟嘌呤核苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为3-鸟苷酸或以3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，如第152页图所示。2脱氧核糖核酸酶类 这是一类水解DNA的酶，常用的有牛胰脱氧核糖核酸酶、牛脾脱氧核糖核酸酶和限制性内切酶。牛胰脱氧核糖核酸酶 简称DNase，此酶无碱基专一
29、性，它切断双键DNA或单链DNA成为以5-磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为四个核苷酸。需镁离子，最适pH78。牛脾脱氧核糖核酸酶 简称DNase，此酶也无碱基专一性，它降解DNA成为以3-磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为6个核苷酸。最适pH45，需0.3 mol/L钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。限制性内切酶 （restriction endonuclease）简称限制酶（restriction enzyme），这是一类对DNA具有碱基专一性的内切酶，主要从细菌、霉菌中分离得到，是DNA顺序测定、基因分离和基团体外重组等研究中十分重要的工具酶。这类酶主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，但不
30、降解自身细胞的DNA，因为自身DNA酶切位点上经甲基化修饰而受保护。限制性内切酶有较高的碱基专一性，能识别DNA分子上特定的碱基顺序，并在特定的位点切割。一般识别顺序包含46个碱基对，切点的位置绝大多数位于识别顺序内，只有极少数在识别顺序外。大多数限制性内切酶的识别顺序具有回文结构（palindromic structure），回文结构也称反向重复序列（inverted repeats），是指DNA分子中，在一个假想轴的两侧，某些碱基序列之间有反向重复关系。加之大多数限制性内切酶对两条DNA链进行交错切割，所以切割后形成末端为单链的互补顺序，即粘性末端（sticky ends或cohesive
31、 ends）。也有一些限制性内切酶在同一部位切断DNA，形成平整末端（blunt ends或flush ends）。下面以大肠杆菌中分离得到的EcoR和嗜血流感杆菌中分离得到的Hind为例。EcoR的识别顺序为GAATTC，Hind的识别顺序为GTPyPuAC，切点如图中箭头所示。3非专一性核酸酶类 常用的有蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶，它们是非专一性的核酸外切酶。蛇毒磷酸二酯酶 既能作用于RNA也能作用于DNA，它是从多核苷酸链的3-羟基端开始，逐个切开5-核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得5-核苷酸。牛脾磷酸二酯酶 既能作用于RNA也能作用于DNA，它是从多核苷酸链的5-羟基端始，逐个切开
32、3-核苷酸与相邻核苷酸之间的酯键，得3-核苷酸。4413 DNA一级结构的测定 1965年Robert Holley首先用测蛋白质氨基酸序列的方法（重叠法）测定了酵母丙氨酸tRNA的序列，由于操作烦琐，用来测相对分子质量大的核酸序列困难很多，因此1977年，A.Maxam与W. Gibert，提出了测定DNA序列的化学断裂法（chemical cleavage method）。同年F. Sanger提出了双脱氧法（dideoxy method）又称末端终止法（chain-terminator method）或酶法。两法都是用不同的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成若干带放射性标记的长、短不等
33、的片段，然后用测DNA片段的相对长度来推测核苷酸的顺序，即利用凝胶电泳使各种片段分离，再用放射自显影法显影，从放射自显影图谱读出被测核苷酸的序列。两种方法的基本原理相同，其差异仅在于制备核苷酸片段的手段不同。化学断裂法 利用一种多核苷酸激酶在被测DNA样品的5端羟基上标记32P，然后根据碱基所在位置分为G、G+A、T+C和C4组，采用不同专一性试剂修饰碱基，使每组样品在其特定碱基位断裂，即得长度不同的核苷酸片段（表4-4）。将上述4种处理所得的混合核苷酸片段同时在分辨率很高的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶上进行电泳分离，通过放射自显影，即可从4个反应的电泳图谱上推知被测样品的核
34、苷酸顺序。双脱氧法 Sanger发明的双脱氧法，是用2，3双脱氧核苷三磷酸（2，3-ddNTP）为核苷酸链合成的抑制剂，根据DNA复制原理制备各种核苷酸片段。这种方法要求有单链的DNA模板和与之互补的引物（primer），然后用DNA聚合酶进行互补链的合成，从互补链的核苷酸序列，即可推知被测核酸的核苷酸序列。这个方法可分别在4个小管中进行，每一反应管中都含有被测多核苷酸的单链作为模板，一个序列已知的引物，一种DNA聚合酶（polymerase）和4种含不同碱基的核苷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP），其中一种是有标记的。然后再加2，3-双脱氧核苷三磷酸作为核苷酸链合成的末端终止剂。在
35、适当条件下进行互补链的合成。由于新参入的核苷酸只能同新生链3端的OH连接，而23-双脱氧核苷三磷酸核糖基的2，3位OH的氧都已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的参入就有两种可能性，一种是4种核苷酸的任何一种经DNA聚合酶的作用参入新生链，使链继续延伸而成为与模板DNA的互补链。另一可能性是2，3-双脱氧核苷三磷酸参入，使新生链的合成反应终止。由于两者参入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。最后通过A、T、G和C4组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。再根据碱基配对原则，可推知被测多核苷酸链的全部核苷酸序列。此法准确快速，被研究核酸工作者广泛
36、采用。以上两种测DNA核苷酸序列的方法，本书只作原则性介绍，具体操作方法，需要者可参考有关方法的专著或原著。4414 RNA-级结构的测定 上述两类测DNA分子中核苷酸序列的方法稍加修改都可用来测RNA的核苷酸序列。新近有人对上述两法作了如下的修改：即先用逆转录酶（也称RNA指导的DNA多聚酶）将被测RNA逆向转录为互补DNA（cDNA），然后按照上述测DNA序列的化学断裂法或末端终止法进行序列测定。比较最简便的方法还是直接用化学断裂法（直读法）作RNA序列的测定。442 DNA的二、三级结构4421 DNA的二级结构（双螺旋结构） 通过用X射线衍射法（一种研究晶体结构的方法）研究DNA，Wa
37、tson与Crick提出了DNA的双螺旋结构模型（图4-2），这个模型显示DNA结构的下列特点：DNA分子是由两条多脱氧核苷酸链组成 每条链的骨干是由磷酸二酯基通过3，5键与两个核苷的呋喃型-D-脱氧核糖基连接而成（参阅DNA分子中核苷酸的连接）。这两条链都是右手螺旋，以相反方向围绕同一个轴盘绕，形成右手螺旋的双螺旋结构。碱基对之间的堆积距离（stacking dis-tance）为0.34nm，每10个核苷酸形成螺旋的一转，每一转的高度为3.4nm。碱基在螺旋内，其平面与中心轴垂直，磷酸在外（图4-2），螺旋的平均直径为2nm。两条链由碱基对之间的氢键相连，在空间上可能的碱基对只有腺嘌呤与胸
38、腺嘧啶以及鸟嘌呤与胞嘧啶，所以两条链是互补的。一条链上的碱基次序由另一条链上的碱基次序来决定。这点在DNA的复制过程中具有极大的重要性。DNA分子所含嘌呤碱基的总数等于嘧啶碱基的总数，而且腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相同，鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相同，这是符合多种DNA的分析结果的。DNA两螺旋多核苷酸之间的碱基以一定规律两两对应形成特定的碱基对，碱基对之间以氢键相连维持构象。Pauling和Corey指出，腺嘌呤和胸腺嘧啶之间是由两个氢键连接，而鸟嘌呤和胞嘧啶之间则由3个氢键连接（图4-3），碱基的配对规律是一链的嘌呤碱与另一链的嘧啶碱相连，而且必须是腺嘌呤与胸腺嘧啶相连，鸟嘌呤与胞嘧啶相连。腺
39、嘌呤与胸腺嘧啶的比值和鸟嘌呤与胞嘧啶的比值皆近于1。每链可含有腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸及胸苷酸等4种核苷酸，但各种核苷酸的排列次序是极复杂和多样化的。双核苷酸链模型虽不表示链中核昔酸的排列次序，但表示了两链必须具有相对应的碱基排列次序。Watson-Crick的DNA模型的正确性新近已得到许多实验证实和作了些补充。DNA双螺旋的种类 Watson-Crick的DNA双螺旋结构是DNA钠盐纤维在相对湿度为92时的一种状态，属B型DNA双螺旋。用X射线衍射分析研究DNA结构时，因DNA钠盐纤维样品相对湿度或盐的种类等条件不同，双螺旋结构的特征也不相同，通常用A、B、C3种类型，它们有共同的特点，即均
40、为右手螺旋，糖-磷酸骨架位于外边，碱基在内部。不同的是每圈螺旋所含的碱基对、螺距和碱基倾角等不同（见表4-5）。细胞内天然状态的DNA几乎都以B-DNA存在，DNA与RNA分子中的双螺旋区以及DNA-RNA杂交分子在溶液中的构象与A-DNA很接近，目前尚无证据说明生物体内有C-DNA存在。左手螺旋DNA的发现 1979年美国人A.Rich根据用X射线衍射法分析人工合成的，具有特殊顺序的脱氧六核苷酸（dCGCGCG）的结果，发现脱氧六核苷酸（dCGCGCG）片段以左手螺旋存在于晶体中，从而推论到自然界中有左手螺旋DNA存在。他们并认为具（CG）n结构的DNA溶液从低盐浓度到高盐浓度时，右手螺旋D
41、NA会转变为左手螺旋DNA。右手螺旋DNA与左手螺旋DNA一般处于动态平衡。左手螺旋DNA与右手螺旋DNA有明显不同，左手螺旋DNA分子中磷原子的走向为锯齿（zigzag）形（图4-4A），因而被称为Z-DNA，右手螺旋DNA称B-DNA（图4-4B），以别于Z-DNA。左手螺旋DNA分子中每12个核苷酸组成一个左手螺旋，螺距为4.46nm，直径为1.8nm，比右手螺旋DNA（B-DNA）的直径（2nm）略细。碱基对偏离螺旋轴心而比较靠近螺旋分子外表，呈现碱基比较暴露的状态。Z-DNA中的鸟嘌呤为顺式，核糖的C-3外露，而右手螺旋DNA分子中的鸟嘌呤为反式，核糖C-2为外露。左手螺旋DNA是另
42、一种稳定而有特定的DNA结构。左手螺旋DNA的功用还不清楚，据Rich的看法，可能与基因的调控有关。思考题：试列表说明右手螺旋DNA（B-DNA）与左手螺旋DNA（Z-DNA）的主要区别4422 DNA的三级结构 实验指出，DNA的双螺旋二级结构在某些情况下可进一步变为开环形（图4-5A）、闭环超螺旋形（图 4-5B）及发夹（hair pin）形（图4-5D）的三级结构。超螺旋在碱性（pH 12.6）及100可变为线团结构（图4-5C）。开环双链DNA可视为是由直线双螺旋DNA分子的两端连接而成，其中一条链留有一个缺口；闭环双链超螺旋分子结构则可能由于双链环形DNA结构因某种分子力学上的关系扭
43、曲而成。双链超螺旋结构紧密，当其链上出现裂口，即可变为松散的开环双链DNA。DNA变性后，在反向重复序列时可形成发夹形结构。原核细胞生物所含的发夹形DNA很少，真核细胞生物含发夹形DNA很多。真核细胞生物所含的DNA的三级结构还有一个特点，即细胞染色体DNA中有许多重复出现的核苷酸序列，称重复序列。19591966年有人发现某种病毒（X174）的DNA是单链结构，而且这条单链两端还可自身闭合成环状的三级结构，19661967年也有人在某些病毒（如兔、人乳头瘤和多瘤病毒）的DNA中发现有环状双链DNA。在动物细胞线粒体内也存在有环状DNA。在人白血病白细胞线粒体中存在有环状和链状两种形式的DNA
44、。根据现有的科学证据，可以说在自然界中单链环状DNA是不常见的，而环状双链DNA则广泛存在。DNA也可聚合成二聚体和三聚体。443 RNA的二、三级结构 近年来由于分离RNA的方法的改进，为X射线衍射法研究RNA提供了方便，使RNA的构象得到了比较清楚的衍射图谱，但其高级结构尚未完全清楚。根据RNA的某些理化性质和X射线衍射分析，证明大多数RNA分子是一条单链，链的许多区域自身发生回折。回折区内的多核苷酸段呈螺旋结构。约有4070的核苷酸参与这种螺旋的形成，因此，RNA分子实际上是一条含短的不完全的螺旋区的多核苷酸链（图4-6A）。由于链的回折使可以配对的碱基，如A与U，G与C在螺旋区内相遇成
45、对。配对的碱基之间形成氢键，不能配对的碱基形成突环（图4-6B）。1tRNA的结构 tRNA的碱基配对与图4-6B所述的有些特殊，它的每一个碱基可有一个以上（13个）的配对碱基（表4-6）。大肠杆菌、小麦和酵母菌的tRNA结构都已弄清楚。根据碱基排列顺序的测定和碱基配对原则，R.W.Holley建议下列的酵母菌tRNA（tRNAAla ）的二级结构模型为三叶草形如图4-7。图4-7所示酵母丙氨酸tRNA的二级结构模型，因形似三叶草，因而得名。实际上tRNA的二级结构一般是由4臂4环所组成。上臂（）是由dRNA3末端和5末端附近的7对碱基所组成，称氨基酸接受臂。其3端的C-C-A核苷酸段是接受氨
46、基酸的部位。下臂（）与反密码子环相连，环的顶端有由-G-C3个核苷酸组成的反密码子，这个臂因而称反密码子臂。反密码子是识别mRNA上密码子的机构。左臂（）与含二氢尿嘧啶的环相连，右臂（）与一个含有TC顺序的环和一个可变环（或称额外环）相连。可变环的核苷酸数目变化较大，随不同tRNA而异。tRNA分子中含有2021对碱基对，由于其双螺旋结构所占比例甚高，对称性强，故tRNA的稳定性甚强。三叶草形结构是一般tRNA所共有的。从图4-7可见tRNA所含的核苷除A、G、C、U4种正常碱基的核苷外，还含有几种修饰核苷（，T，H2U，m，m2G，mG）。图4-7表示的tRNAAla结构已得到证实，已知的几种tRNA的二级结构都与这个结构