《谷胱甘肽过氧化物酶.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《谷胱甘肽过氧化物酶.doc（13页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、 本科生毕业论文（设计）题 目:谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响 姓 名:于南学 院:生命科学学院专 业:生物科学班 级:生物科学101班学 号:13210101指导教师: 师亮 职称: 讲师2013年5月20日南京农业大学教务处制目录摘要3关键词3Abstract3Key words3引言31 材料与方法411 材料4111 菌种4112 CYM培养基4113 PDA固体培养基4114 试剂4115 主要仪器设备412 实验方法4121 ROS的测定4122 NBT测定4123 DAB染色5124 菌株对氧化物耐受性的检测5125 胞内
2、Ca2+的荧光检测5126 三萜的测定5127 菌丝分叉检测52 结果与分析621 GPX沉默转化子胞内ROS含量上升622 NBT染色显示GPX沉默转化子胞内超氧根离子含量上升623 DAB染色显示GPX沉默转化子胞内H2O2含量下降724 GPX沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降725 GPX沉默转化子胞内Ca2+的含量下降926 GPX沉默转化子菌株的三萜含量下降：1027 GPX沉默转化子菌丝的分叉数减少103 讨论12致谢12参考文献14谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）对灵芝生长发育中的活性氧物质（ROS）的改变及理化性的质影响生物科学101 于南指导教师 师亮摘要：谷胱甘肽过氧化
3、物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 及HO2、OH- 等。生物体为了减少过氧化物质对机体的伤害，会通过GPX基因来调控体内过氧化物质的含量。本次试验就是通过GPXi（沉默）后测定真菌ROS信号通路中相关理化性质的改变例如：ROS的含量；ROS调控的钙离子浓度等变化；菌株耐氧能力的改变。关键词：GPXi；ROS；Ca2+；三萜；分叉The influence of Glutathione peroxidase (GPX) on reactive oxygen species (ROS) and the
4、physical and chemical properties change during the growth and development of ganoderma lucidum Student Majoring in Biology Yu NanTutor Shi LiangAbstract：Glutathione peroxidase (GPX) an important peroxide decomposition enzyme that is widely exist in organic cells. ROS is a series reactive oxygen spec
5、ies in the process of metabolism, which produced by Aerobic cells, including: O2 -, H2O2 , HO2 and OH-. In order to reduce the body damage caused by peroxide material the organism adjusts the content of ROS by controlling Glutathione peroxidase (GPX). Our experiments test the change of the fungal RO
6、S signal pathway and the change of physical and chemical properties by making the GPX gene silent, such as the content of ROS, Calcium ions concentration and the tolerant ability to oxidizing substances.Key words: GPXi; ROS; Ca2+ concentration; Ganoderic acids; bifurcation引言灵芝是非常珍贵的药用真菌，性微温，气特殊，味微苦涩
7、。始载于汉代神农本草经，被认为能“益心气，安精魂，补肝益气，坚筋骨”，列为上品。本草纲目认为灵芝有“滋补强壮，延年益寿”“利关节，治耳聋”等功效。2000年出版的中华人民共和国药典收载灵芝（赤芝、紫芝）子实体为法定中药材，药典中规定的中药材是赤芝或紫芝的干燥子实体2。同年，灵芝作为10种中草药之一也被收载于美国出版的美国草药药典和治疗概要中，灵芝在国内和国际医药学界的地位可见一斑。灵芝在分类系统上是隶属于真菌门(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层担子菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aph
8、yllophorales)，灵芝菌科(Ganodermataceae)，灵芝属(Eanoderma)3。灵芝中含有多种有效化学成分，包括灵芝多糖、三萜化合物、核苷化合物和生物碱类化合物等，其中三萜类化合物由于其广泛的药理活性已受到普遍关注，研究表明灵芝中三萜化合物具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗HIV、抗组织胺释放、保肝护肝等作用4谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。在动物细胞中GPX的活性中心是硒半胱氨酸，其活力大小可以反映机体硒水平。但在真菌细胞中关于GPX的这方面还不清楚。但可以确定的是它能使有毒的过氧化物ROS还原成无毒的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及
9、功能不受过氧化物的干扰及损害。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇,包括：O2-、H2O2 、HO2、OH-。 低浓度的ROS 可以促进转录因子的激活以及对细胞增殖、分化有积极作用。但是中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。生物体为了减少ROS对机体的损害会利用多种物质将其分解，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）就是其中之一。而ROS对生物体的影响还不止于此。已有研究表明，ROS的积累可以影响Ca2+的含量5。研究发现，在动物细胞中ROS能够与钙信号通路进行互作，激活钙通道，增加钙离子向胞内的流入进而影响钙信号传递。其中，钙离子作为生物体内重要的第二信使参与多
10、种生物学功能。但是此类调控机制在真菌是否依然适用却有待考证。但可以确定的是，Ca2+的含量可以影响三萜的含量6。此类调控在细菌、真菌、植物的抗逆及促进次级代谢产物积累方面都发挥了重要作用8-10。本课题从检测GPX沉默菌株中胞内ROS的含量和钙离子含量以及GPX沉默菌株对氧化性物质的耐受能力等几方面来研究GPX对ROS的影响。1 材料与方法11 材料111 菌种将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保藏的菌种G20，URA3，GPXi1(G1)， GPXi3(G3)，GPXi4(G4)，GPXi5(G5)，GPXi7(G7)，GPXi9(G9)，GPXi10(G10)，GPXi11(G11)。
11、112 CYM培养基1麦芽糖，2的葡萄糖，0.2酵母提取物，0.2蛋白胨，0.05MgSO4.7H2O，0.46KH2PO4。113 PDA固体培养基去皮土豆200g（切块煮沸30min，8层纱布过滤取滤汁），葡萄糖20g，定容至1000mL，加入2%琼脂，高压灭菌30min后使用。114 试剂冰醋酸、高氯酸、香兰素、95%乙醇、无水乙醇、荧光增白剂、NBT、DBA。115 主要仪器设备分光光度计、烘箱、分析天平、天平、超声波清洗仪、摇床、28 恒温培养箱、无菌超净台、高压蒸汽灭菌锅、小型种子打碎机、恒温水浴锅等。12 实验方法121 ROS的测定将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种
12、G20,，URA3，G1，G3，G4，G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，在载坡片上滴上DCFH-DA染料菌丝染色20min，在荧光显微镜下观察并拍照。122 NBT测定取适量CYM液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中，在培养皿中加入适量的NBT染液轻轻摇匀使之充分浸没菌菌丝球。在光照下染色2h后观察不同菌种的菌菌丝球边缘染色情况并拍照比较。123 DAB染色将CYM液体培养基中培养好的菌丝球于培养皿中，在培养皿中加入适量的DAB染液轻轻摇匀使之充分浸没菌丝球。在光照下染色8h后观察不同菌种的菌落染色情况并拍照比较
13、。124 菌株对氧化物耐受性的检测将每一种菌株分别接种到加入VK3和KO2的PDA平板上并设置一组对照，在培养箱中培养3-4天后取出。比较同一菌株的菌落在不同培养基上的形态差异并拍照记录。测量菌落的直径大小并记录。125 胞内Ca2+的荧光检测将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，将长有菌丝的盖玻片取下，载玻片中间地上Fluo-3AM染料，盖上盖玻片，分别在4C和37C下染色1h。置于荧光显微镜观察并拍照。126 三萜的测定（1）将C
14、YM固体培养基上的菌株分别接种至对应的液体CYM培养基震荡培养7天，收集菌丝，置于60C烘箱过夜烘干至恒重，次日将其研磨成粉状装于1.5 mL离心管中。（2）精密称取烘干的样品0.2 g，用95%乙醇浸泡样品，并定容至10 mL，超声波破壁2 h，每20 min摇动一次，取1 mL于1.5mL离心管，于4000 rpm的离心机上离心10 min，取上清备用。（3）空白制备：精密吸取0.1 mL蒸馏水于10 mL具塞试管中。（4）样品的测定：精密吸取上清0.1 mL于10 mL具塞试管中，加香草醛0.2 mL，高氯酸0.5 mL，加盖振荡混匀，于60 C水浴中保温20 min，此时预热分光光度计
15、，取出后迅速用冰水冷却（10 min）；之后加入5 mL冰醋酸，加盖振荡混匀，然后于550 nm处测吸光值。（5）计算公式：W = CV1/MV2 100%C （g）从标准曲线上查得样品分解液的三萜含量V1（mL）样品定容体积V2（mL）比色测定时所称取的浅样分解液体积M（g）样品质量W（%）灵芝三萜含量127 菌丝分叉检测将南京农业大学生命科学院应用真菌实验室保存菌种G20，URA3，G1，G3，G4， G5，G7，G9，G10，G11接种到CYM固体培养基上。将盖玻片灭菌后斜插入菌丝生长的培养基中，待菌丝爬到盖玻片，将长有菌丝的盖玻片取下，载玻片中间地上荧光增白剂染料，盖上盖玻片，染色20
16、min。置于荧光显微镜观察并记录分叉。2 结果与分析 21 GPX沉默转化子胞内ROS含量上升将菌株接种在CYM培养基中，在接种后四天观察活性氧的积累情况。使用DCFH-DA 染料染色。DCFH-DA是一种过氧化氢的荧光探针，染色后在荧光显微镜下检测菌丝亮度的差别，绿色荧光染色表明了活性氧的积累，亮度越高表明ROS 含量越高。通过观察可知，在荧光下经过基因沉默的各个菌种的亮度明显高于未经沉默的G20和URA3（CK）。说明GPXi菌株ROS含量高于G20与URA3（CK)，也就说明GPX沉默后胞内ROS含量会上升。图1 灵芝菌丝细胞质中ROS的荧光检测22 NBT染色显示GPX沉默转化子胞内超
17、氧根离子含量上升NBT染料是对超氧根离子（O2-）染色，经过NBT染色过后的菌丝球颜色越深就说明超氧根离子含量越高。如图所示，沉默后的菌株的菌丝球明显比G20、URA3（CK）的菌丝球颜色颜色深，即说明GPX沉默转化子胞内超氧根离子含量上升。 图2 NBT染色后灵芝菌丝球的颜色变化情况23 DAB染色显示GPX沉默转化子胞内H2O2含量下降 DAB染料是对菌丝中的H2O2染色，染色后菌丝球颜色的深浅反映了H2O2含量的高低。如图所示，G20、URA3（CK）菌丝球的颜色明显比沉默后的菌株的菌丝球颜色深，即说明其H2O2含量高于GPX沉默后的菌株。图3 DBA染色后灵芝菌丝球的颜色变化情况24
18、GPX沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受力下降VK3和KO2是两种氧化性很强的物质。将实验菌株分别接种至加入这两种物质的PDA培养基中培养四天后取出。判断菌株对氧化性物质的耐受力可以通过观察菌落的直径大小来判定。如图所示，可以看出加入VK3的培养基中的菌落直径与CK培养基中菌落的直径变化并没有显著差异。但是加入KO2的培养基中的菌落直径则明显变小，而且GPXi菌株菌落直径明显小于G20和URA3（CK），即说明GPX沉默转化子的菌株对氧化性物质的耐受性下降。图4 CK平板中菌落的大小图5 加入VK3后菌落直径的变化情况图6 加入KO2后菌落直径的变化情况如图7所示，Y轴为菌丝的相对生长速率（%
19、），也就是CK培养基中菌株的直径与对应VK3培养基中菌株菌丝直径之差与CK菌株直径的比值。通过数据软件处理分析发现不同培养基培养的菌株之间差异不显著。但是与G20相比G4，G5，G9，G10，G11（P0.01）差异极显著，G3, G7(P0.05)差异显著。图7 VK3对菌株相对生长速率的影响（* P0.05；* P0.01）如图8所示，通过数据分析软件分析可以得以看到，G1, G3, G4, G5, G9（P0.01）差极显著，G7, G11（P0.05）差异显著。即说明GPX沉默后的菌株对氧的耐受性降低。 图8 KO2对菌丝相对生长速率的影响（* P0.05；* P0.01）25 GPX
20、沉默转化子胞内Ca2+的含量下降胞内钙离子含量检测用钙离子荧光探针 Fluo-3AM 法测定。Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。绿色荧光显示了细胞溶质中游离的钙离子，荧光亮度越高说明钙离子含量越高。如图所示。GPX沉默的各个菌种的亮度明显暗于G20和URA3(CK)。这就说明GPX沉默菌株细胞内Ca2+含量少于G20和URA3(CK)，也就说明了GPX基因的沉默会使细胞内Ca2+含量下降。图9 灵芝菌丝细胞质中Ca2+的荧光检测26 GPX沉默转化子菌株的三萜含量下降：对三萜测定数据进行分析，如图所示，G1，G3，G9（P0.05）差异显著，而G4和G11（P0.01）差异极显
21、著。说明GPXi基因沉默后的灵芝三萜合成量明显低于G20和URA3（CK），也就说明了该基因影响了灵芝三萜的合成。图10 菌株三萜含量的检测（* P0.05；* P0.01）27 GPX沉默转化子菌丝的分叉数减少 用荧光增白剂对菌丝染色在在荧光显微镜下拍照并观察，如图11所示，沉默菌株分叉数明显少于野生型G20和URA3。图11 灵芝菌丝的分叉荧光检测为了检测菌丝分叉之间的距离，本实验对每个菌株统计了50对菌丝分叉之间的距离。Y轴代表平均分叉距离，X轴代表供试菌株，距离越小表示分叉越多。从图所示，GPX沉默后的菌株平均分叉距离明显大于G20和URA3，而且经数据软件分析，G1，G7，G10，G
22、11（P0.05）差异极显著，G3，G4（P0.01）差异显著。这就说明GPX沉默后的菌株分叉数目减少。图12 菌丝分叉的定量分析(* P0.05；* P0.01)3 讨论我们以实验室构建好的GPX基因沉默灵芝菌株和野生型灵芝菌株为材料，经过无菌操作分别接种到CYM固体培养基、CYM液体培养基、PDA固体培养基上来研究GPX沉默对灵芝菌株ROS的改变及相关理化性质的影响。在本实验中，我们发现在GPX沉默以后，胞内总ROS含量会上升。这是由于GPX对ROS有降解的作用。当GPX沉默后，灵芝细胞内对ROS的降解能力会降低，就会导致细胞内的ROS积上升。这与前人研究结果相符。NBT是对菌丝球超氧根离
23、子染色，从实验结果可以看出，GPXi菌株超氧根离子含量高于G20和URA3。这是由于H2O2和O2-是灵芝ROS代谢途径的两个中间产物，而GPX的沉默会直接对H2O2的代谢的其中一条途径发生阻断，导致H2O2积累。O2-则是生成H2O2的底物，H2O2的积累会导致相关酶活力的下降，使底物O2-含量升高。DAB是对菌丝球的H2O2染色，从实验结果看出，GPXi细胞中H2O2含量少一些。其结果与之前的报道有出入。这可能因为细胞中的ROS代谢是比较复杂的过程，据研究，GPX的沉默会直接对H2O2的代谢的其中一条途径发生阻断，但H2O2代谢还有其它的途径。GPX途径被阻断后，短时间内H2O2的含量会暂
24、时积累上升，而H2O2含量上升是否会加强其它的途径加强对H2O2的分解，还需要我们的进一步研究。综合以上几点可以说明在真菌细胞中GPXi会对ROS的含量造成影响。用含有不同的氧化性物质（VK3、KO2）培养基培养菌株我们可以清楚地看到如下结果。对于加入VK3的培养基培养出的菌株来说，虽然其菌落直径与CK培养基中的菌落直径对比并没有什么区别，但是从外形上观察可清楚的看出经过VK3处理的菌落明显比CK疏松。至于VK3是否会对菌株的生长产生影响还需要进一步实验说明。用KO2处理后的菌株可以明显的看出其菌落的直径减小。而且在处理组可以明显看到G20和URA3（CK）的菌落直径明显大于GPXi菌株。这就
25、说明了GPXi菌株对氧化性物质的耐受性降低。同具氧化性的这几种物质处理菌株但是却得到了不太相同的结果可能是由于这几种物质的性质和结构不同。对于GPX、ROS、Ca2+之间的关系我从Ca2+含量、菌丝分叉三萜含量，三个方面做了实验得到了以下结果。通过对细胞内三萜含量的检测我们可以看到GPX沉默后的三萜含量明显要低一些，与已知三萜含量与Ca2+含量是成正比报道相符。已知，Ca2+含量与菌丝分叉数成反比。通过对菌丝分叉检测可以清楚地看到，经过GPX沉默后的菌株与G20和URA3（CK）相比分叉明显减少。这与前人的报道有出入。这可能是因为菌丝的分叉是由许多因素造成的，调节菌丝分叉可能出现其他的途径或者
26、方式，在现实验的条件下，钙离子对其影响不显著。致谢本次实验在生命科学学院的师亮老师和李晨旸师姐的悉心指导下进行。师老师为人风趣幽默，知识渊博，做事严谨，一丝不苟。李晨旸师姐对有着雄厚的科研知识和严格的实验态度和熟练的实验技术。虽然平时都很忙但是还是给了我极大的鼓励与支持，耐心的指导我的毕业实验。让基础较为薄弱的我的实验技能有了很大的提高。从论文选题到搜集资料再到最终的实验，老师和师姐都事无巨细的给了我很大的支持与建议。在此我要特别对你们表示深深的感谢。参考文献：1 李时珍.本草纲目M.北京：人民卫生出版社，1987：577.2 Chinese Pharmacopoeia Commission.
27、 Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China Part I Beijing: China Medical Science Press, 2010: 174.3 邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学M.北京：中国林业出版社，1983.4 Huie CW, Di X. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically active components J. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,
28、 2004, 812: 241-257.5 Bang-Jau You, et al. Effect of solid-medium coupled with reactive oxygen species on ganoderic acid biosynthesis and MAP kinase phosphorylation in Ganoderma lucidum J. Food Research International, 2012, 49: 634-640.6 Zhang, W. X., & Zhong, J. J. Effect of oxygen concentration in
29、 gas phase on sporulation and individual ganoderic acids accumulation in liquid static culture of Ganoderma lucidum J. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2010, 109: 37-40.7 Tang, Y. J., & Zhong, J. J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganod
30、erma polysaccharide and ganoderic acid J. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 32: 478-484.8 Mittler, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance J.Trends in Plant Science, 2002, 7: 405-410.9 Vasconsuelo, A., & Boland, R. Molecular aspects of the early stages of elicitation of secondary
31、 metabolites in plants J. Plant Science, 2007, 172: 861-875.10 Zhao, J., Davis, L. C., & Verpoorte, R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites J. Biotechnology Advances, 2005, 23: 283-333.11 Takemoto, D., S. Kamakura, S. Saikia, Y. Becker, R. Wrenn, A. Tanak
32、a, H. Sumimoto & B. Scott. Polarity proteins Bem1 and Cdc24 are components of the filamentous fungal NADPH oxidase complex J. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108: 2861-2866.12 杨海龙, 吴天祥, 章克昌. 灵芝酸的分子结构与生物活性的关系J. 无锡轻工大学学报,2002, 21 (3) : 249-253.13 Shi L, Ren A, Mu DS, et al. Current progress in the stu
33、dy on biosynthesis and regulation of ganodericacidsJ. Applied Microbiology and Biotechnology. 2010, 88(6): 1243-125114 Xu, Y. N., & Zhong, J. J. Impacts of calcium signal transduction on the fermentation production of antitumor ganoderic acids by medicinal mushroom Ganoderma lucidum J. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1301-1308.13