《HIV检测方法.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HIV检测方法.doc（11页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、HIV实验室诊断人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)及其相关标志的检测是预防HIV感染和艾滋病临床治疗中重要的环节，在艾滋病的防治工作中具有重要作用，如艾滋病的诊断、HIV感染的诊断、血源及器官供体的筛选、流行病学调查、艾滋病病人及HIV感染者的病情动态观察、临床治疗疗效考核以及HIV疫苗的安全性和效果鉴定等。HIV感染标志分为病毒标志、免疫标志和相关标志三大类。病毒标志是指直接从HIV感染者体内分离出病毒或检出HIV组成成分(抗原或核酸)。免疫标志是指HIV感染所产生的HIV抗原、抗体等免疫物质。相关标志是指HIV感染后与艾滋病病情进展有密切关
2、系的某些标志，如CD4细胞、CD8细胞，2微球蛋白、有关细胞因子等。这些标志的测定可为HIV感染及临床疗效的考核提供极为重要的诊断、治疗和预后指征。目前HIV抗体的检测是艾滋病实验室检测中最常用的方法，因为HIV抗体是患者感染HIV后最容易检出并且持续时间最长的免疫学标志，而且抗体的检测方法大多简便、经济，易于推广应用。在介绍各种HIV实验室诊断方法之前，为了使实验室工作人员能够有效地确保结果准确、可靠、优质，我们必须对作为一种感染因子的HIV以及由它所导致的致命性危害有基本的认识。实验室工作人员应特别注意病毒的结构、抗原组成，人体的免疫反应，诊断试验的基本原理、试验结果的解释，以及为了准确而
3、有效地提供实验诊断所必需的质量保证措施。如果由于缺乏技术专长或基本知识而造成不正确的试验结果是不可原谅的。现将有关内容扼要介绍如下：一、人类免疫缺陷病毒(HIV)概述（一） 艾滋病病原体的发现和命名年份事 由命 名1981美国首先在洛杉矶男性同性恋中发现5例以往很罕见的卡氏肺囊虫肺炎和26例卡波济氏肉瘤患者，这些病人均表现有严重的免疫缺陷，但原因不明。1982年将这种新的疾病命名为“获得性免疫缺陷综合征”Acquired Immuno Deficiency Syndrome，AIDS，即艾滋病1983从艾滋病流行学资料分析很可能是由病毒引起的。法国巴斯德研究所Montagnier等首先从多发性
4、淋巴结病综合症病人分离到一种新的逆转录病毒淋巴结病相关病毒Lym phadenopathy Associated Virus，LAV1984美国国立癌症研究所Robert Gallo等报道从艾滋病病人活检组织分离到一种新的逆转录病毒与其以前发现的HTLV-1和HTLV-不同。人类嗜T淋巴细胞型病毒Human T-cell Lymphatropic Virus type，HTLV-1984美国加州大学分离出艾滋病相关病毒AIDS Related Virus， ARV1986国际病毒分类委员会将上述病毒统一命名为人类免疫缺陷病毒Human Immunodeficiency Virus， HIV19
5、86Montagnier等又从西非病人体内分离出一种具有相似生物学特性，而致病性、抗原性及分子生物学特征有明显差别的新病毒。新发现的病毒命名为HIV-2，原来发现且已广泛流行的HIV称HIV-1。(二)HIV病毒的形态结构、分类和分型HIV病毒是带有包膜的RNA逆转录病毒，在分类上属于逆转录病毒科中的慢病毒亚科。目前发现有HIV-1和HIV-2两型。现已将HIV-1分为M组，共10个亚型(A-J)和O组，HIV-2也至少有6个亚型（A-F）。在我国流行的是HIV-1，检测到的亚型有8种之多，其中B亚型几乎见于我国各个地区，而C亚型主要见于我国西南和西北地区，E亚型则多见于东南沿海和西南边境地区
6、。HIV病毒呈球形或卵圆形颗粒，直径100-140mm，具有包膜。包膜是在病毒出芽释放过程中获得的。从脂质膜上延伸出来的刺和园头是糖蛋白(gp)。病毒颗粒内部为核心，具有蛋白质衣壳，里面有两个相同拷贝的核酸(RNA)和病毒的三种酶：逆转录酶(RT)、整合酶和蛋白酶。HIV基因组(RNA)含有9个基因，可分为结构基因和调节基因。结构基因包括gag、pol和env3个，皆为调节基因。(三)与诊断技术密切相关的HIV抗原由三个结构基因编码的HIV-1抗原如下：1、gag蛋白：位于病毒颗粒内核心部位，主要有分子量为55000道尔顿的蛋白质(P)，称P55。P55抗原是前体蛋白，在感染过程的早期产生，尔
7、后裂解成其他核蛋白，包括P24、P17和P15等。2、env(包膜)糖蛋白：包膜抗原皆为糖蛋白(gp)，根据分子量分别称为gp160、gp120和gp41。gp160是前体蛋白，是在感染过程中产生的一种成份，随后裂解成gp120和gp41。gp120是外膜蛋白，组成外膜的72个刺突和园头。gp41为跨膜蛋白。二者共同参与病毒与突主细胞CD4分子的粘附。3、pol(聚合酶)蛋白质：包括P66(RT)、P51和P31(整合酶或核酸内切酶)。尽管HIV-1和HIV-2抗原之间有交叉，但它们也有各自的特异性抗原。大多数交叉反应是由抗核心抗原的抗体所致，因为这二种不同病毒的gag抗原是非常保守的。各自的
8、这些特异性抗原在HIV-1和HIV-2是相似的，但分子量可略有不同。例如，HIV-2的跨膜蛋白抗原称为gp36，而某些人则称之为gp41，又如主要的核心抗原为P24，但在HIV-2又称P26。(四)HIV感染的生物学和免疫应答机体感染HIV后，HIV能够侵袭许多带有CD4表面抗原的细胞(称CD4+细胞)，主要有T4淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树状细胞和胶质脑神经细胞等。CD4是gp120的受体。由于感染HIV，细胞表面表达大量包膜糖蛋白，可以与周围细胞发生细胞膜融合，形成多核巨细胞。通过这种方式在细胞间播散病毒，可免受抗体的作用。HIV感染引起T4细胞明显减少的机理主要由于：1、HIV直接杀
9、伤T4细胞；2、细胞融合间接地损伤 T4细胞；3、HIV感染 T4细胞，发生抗原性变化，引起自身免疫，通过调理吞噬作用损作T4细胞，T4细胞表面表达gp120位点处吸着特异性抗体，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）损伤T4细胞。另外，由于T4细胞免疫功能损伤，B细胞对各种抗原产生抗体的功能也受到影响，使整个机体免疫功能严重破坏，导致各种机会性感染性疾病的发生。T4细胞计数是反映临床症状的敏感信息，因此T4淋巴细胞总数200/mm3是诊断AIDS的重要指标。人体能对HIV的侵入产生抗体应答，通常是在HIV感染2-10周内机体产生抗体。但也有极少数人感染数月乃至数年后仍测不出抗体，故阴性
10、结果并不说明受检者绝无感染。绝大多数人在感染过程中都会对各种病毒抗原成份产生免疫应答，抗体滴度可高达1：50000，但也可以很低。感染早期（血清阳转时）及病程后期（免疫缺陷）时，抗体滴度均较低。低滴度抗体血清学反应较弱，如果测定方法不够灵敏，可能导致假阴性结果。值得注意的是，并非每个HIV感染者对其所产生的免疫应答都完全相同。如某些人可能对P24有较强的应答。如果检测试剂主要是测定抗gp41的抗体，它就不太可能对仅有抗P24和gp120抗体的血清得出阳性结果。抗gag蛋白（P55、P24）抗体通常在感染早期即出现，抗env和pol产物的抗体同时或稍后产生。感染后至抗体出现前有段间歇期（2-6周
11、，可长至3个月）称“窗口期”。大多数病毒感染者都有IgM抗体产生，但HIV感染者中似乎不完全有IgM应答。对于有IgM抗体应答者，在窗口期检出IgM抗体是有益的。HIV基因组可整合到宿主细胞DNA上使机体终身带有病毒，但机体可能很多年不出现症状，成为HIV无症状感染者，只是查血时发现抗HIV阳性。尔后，在某些因素作用下，病毒被激活后并开始大量复制出现症状和各种合并症，则发展成艾滋病病人，HIV病毒很容易发生变异这是研制有效疫苗的主要困难之一。二、HIV实验室诊断人体感染HIV后，血液中最先出现HIV抗原，然后很快消失直到疾病后期才重新出现。几周后出现IgM抗体并很快消失，此后,IgG抗体出现并
12、一直存在。因此，HIV感染的实验室诊断以抗体检测为主，病毒及相关抗原的检测为辅。抗体检测分为初筛试验和确证试验两种，初筛试验为阳性的血清必须进一步确证，确证为阳性的方可报告为HIV感染阳性。多聚酶链式反应(PCR)主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。（一）标本收集 HIV感染者血清标本的收集按常规方法进行，静脉抽血，不加抗凝剂。标本在室温或4冰箱静置24小时，待血清析出后作抗体检测。污染标本可短时间离心后取上清液作检测，但解释结果时应慎重。用于检测HIV抗原的血液样本
13、与检测抗体的样本的处理有所不同，根据需要，血液样本需进行核酸处理。采用定量PCR方法检测病毒含量时，加入肝素的血浆，检测的RNA含量较未加肝素的血浆样本高。检验人员应注意自身的防护，在未证实之前，所有的标本均应当作“阳性”标本看待。（二）HIV抗体的初筛检测初筛试验的要求是敏感性高，理论上要求达到100%，尽可能避免漏掉可能阳性的对象，相对来说，对特异性要求不是太严，允许有少量假阳性，这些假阳性可以通过重复试验和确证试验排除。HIV抗体初筛检测的方法很多，如酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、明胶颗粒凝集实验(gelatine
14、particle agglutination assay, PA)、乳胶凝集实验(latex agglutination assay, LA)、各种快速检测实验(rapid tests)、放射免疫实验(radio immunoassay)等。这些实验使用的抗原早期是完整病毒的裂解产物，称为第一代试剂，这种抗原常常由于含有宿主细胞的成分而出现假阳性反应，为了获得可接受的特异性而稀释标本使试剂的敏感性也有所下降，同时这种抗原制备和纯化都比较困难，危险性大。第二代试剂使用重组或合成多肽HIV抗原，选择与免疫反应相关的抗原决定簇，敏感性和特异性均有所提高，这类抗原制备也更为安全、容易、重复性好。应该注
15、意的是重组抗原有时由于含有载体的组分而出现假阳性结果，多肽抗原由于缺乏合适的立体构象有可能使敏感性下降从而导致假阴性。使用重组或合成多肽抗原制备的双抗原夹心法试剂盒常常被称为第三代试剂，这种试剂可以检测针对HIV抗原的所有抗体亚类，包括IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，同时不需要将标本过度稀释来保证特异性，因而具有较高的敏感性。第四代试剂除使用重组或合成多肽抗原外还包被了P24抗体，可同时检测抗原和抗体。 1酶联免疫吸附实验 酶联免疫吸附实验（ELISA）是最常见的HIV抗体检测方法，它具有准确性高、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批量标本的检测，是献血员
16、筛选和临床诊断最常用的方法。 （1）方法和原理：使用最多的ELISA方法是间接法，这种方法的原理是将HIV抗原包被到微孔板或其他固相载体上，如标本中含有HIV抗体，则抗体就会和固相载体上的HIV抗原结合，洗涤去除未结合的非特异性抗体，加入酶标记的抗人免疫球蛋白抗体与HIV抗体结合，形成HIV抗原HIV抗体酶标记的抗人免疫球蛋白抗体复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值(optical density, OD)，与判断标准进行比较，就可以得出标本中HIV抗体是阳性或阴性的结果了。间接法使用的标记抗体通常是抗人IgG，为了提高敏感性有时也加入抗人IgM。这种方法的特异性由包被于固相
17、载体上的HIV抗原决定，相对来说特异性不高，存在非特异性问题。另一种常用的ELISA方法是双抗原夹心法，将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与抗原结合形成复合物，由于抗体的双价或多价性，它同时还能与其他抗原结合，加入酶标记的同一类HIV抗原分子时，后者就会与固相载体上的抗体结合，形成HIV抗原HIV抗体酶标记HIV抗原复合物，最后加入底物发生酶催化的显色反应，测定光密度值，与判断标准进行比较，就可以得知标本中HIV抗体是阳性还是阴性。还有一种ELISA方法是竞争法。它的主要特点是酶标记抗体是特异性的HIV抗体。标本中的HIV抗体与酶标记HIV抗体竞争固相载体上的HIV抗原，操作时同
18、时加入标本和酶标记HIV抗体，如标本中的抗体浓度高，酶标记HIV抗体就不能与固相载体上的HIV抗原结合或结合得很少，显色反应就较弱，相反，如标本中的HIV抗体含量很少或没有，大量的酶标记HIV抗体将与固相载体上的HIV抗原结合，显色反应就很强。因而在竞争法中，光密度值与标本中的抗体含量呈负相关关系。这种方法是将标本与酶标抗体同时加入，需时更短，另外这种方法具有较好的特异性。（2）结果的判断：ELISA方法是根据临界值(cut off value, CO)判断结果的。临界值是将检测的阳性和（或）阴性对照的OD值代入厂商提供的计算公式计算出来的判断阳性和性结果的界值。对于间接法和双抗原夹心法，标本
19、OD值与临界值的比值大于等于1（SCO1）为阳性；对于竞争法，标本OD值与临界值的比值小于等于1（SCO1）为阳性。2从尿液中测抗体尿液艾滋病病毒（HIV1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（CalypteTMHIV-1尿液EIA）是酶免疫测定方法在体外检测尿液中HIV1抗体。此法用于实验室辅助临床HIV感染诊断。在确定标本HIV1抗体的结果之前，根据美国疾病控制中心推荐的HIV抗体的诊断步骤，此项检测重复阳性的标本，用卡里普特公司的剑桥生物HIV1尿液Western Blot试剂盒进行确诊。近年与血液检查相比，尿液检查有多种优点。在尿液中一般不存在HIV病毒。卡里普特公司的剑桥生物HIV1尿液West
20、ern Blot试剂盒，可对于尿液EIA重复阳性标本做确认实验。尿液艾滋病病毒（HIV1）抗体酶联免疫诊断试剂盒（calypteTMHIV-1尿液EIA）是利用重组的HIV1表面抗原在尿液中检测HIV1抗体。微孔板的孔中包被gp160膜抗原。把尿液标本或对照与标本缓冲液一起加入孔中温育。如果标本中存在HIV1膜抗原的抗体，它们将与孔中的抗原结合。标本缓冲液用来减低孔中其它蛋白及抗体对孔壁的非特异性结合。通过洗涤去除未结合的物质。然后加入碱性磷酸酶标记的羊抗人免疫球蛋白抗体并温育。酶联物与孔中结合到抗原的HIV1抗体结合。洗涤去除未结合的酶联物，然后加入底物（p-NPP）。如标本中含有HIV1抗
21、体，酶将使孔内液体由无色变为黄色，颜色的强度与标本中抗体含量成正比。反应用EDTA终止，用酶标仪在405nm处测吸收峰而读取结果。试剂盒中包括阳性及阴性对照，每板应做2个阳性对照及3个阴性对照，将阴性对照平均吸收值加0.18得到cutoff值，标本是通过与Cutoff值比较来判断是否为阳性或阴性。第一次检测阳性标本应用同一标本再重复检测，如果重复检测仍为阳性，标本为重复阳性标本。重复阳性标本用卡里普特公司的剑桥生物HIV1Wester Blot试剂盒进一步确认。 3胶体金法检测HIV1/2抗体实验胶体金法检测HIV抗体是一种不需要任何仪器设备的血清血浆检测法，它利用免疫层析分析原理来快速检测血
22、清血浆中是否含有HIV抗体，从而用于判断人体是否受到HIV1型HIV2型病毒感染。（1）方法和原理 试剂盒采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术来定性检测血清血浆中是否含有HIV抗体，试剂盒含有被事先固定于膜上测试区（T）的重组HIV抗原和质控区（C）的抗-protein A抗体。测试时，血标本滴入试剂盒加样孔（S）内，血标本中的HIV抗体与预包被在膜上的protein A胶体金结合物反应。然后，混合物随之在毛细管向上层析，在测试区（T）与固定在膜上的重组HIV抗原反应。如果血清中含有HIV1抗体或HIV2抗体，在测试区内（T）会出现一条红色条带，表明是阳性结果。如果在测试区内（T）没
23、有出现红色条带，则血清中不含有HIV抗体，表明是阴性结果。无论HIV抗体是否存在于血清中，混合物都会继续向上层析至质控区（C），质控区的抗Protein A与Protein A胶体金结合物反应出现一条红色条带。质控区内（C）所显现的红色条带是判定是否有足够血标本，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。（2）结果判定 阳性（）：两条红色带出现。一条位于测试区内（T），另一条位于质控区内（C）。 阴性（）：仅质控区（C）出现一条红色条带，在测试区内（T）无红色条带出现。无效：质控区（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。在任何情况下，应重新测试。如果问题仍然存在，
24、应立即停止使用此批号产品，并与当地供应商联系。注意：由于样本中HIV抗体滴度的不同，测试区（T）内的红色条带会显现出不同深浅的颜色。但是，本试剂盒的测试结果不能做为判定样本中抗体滴度高低的依据。4. 明胶颗粒凝集试验明胶颗粒凝集试验(PA)是一种快速的HIV血清抗体的检测方法。先将样品稀释，然后加入包被抗原的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。由于操作方便，且无需特殊仪器设备，很适合于对少量标本的检测。当血清或血浆中有HIV抗体存在时，经HIV抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体相互作用，产生肉眼可见的凝集反应。(1) 操作方法 待测血清从1：4开始作倍比稀释。 1：8血清稀释孔加251非致敏
25、粒子，1：16血清稀释孔加251致敏粒子。 设置阳性对照血清，使其终末滴度为1：128。 振荡混匀，加好盖板，室温(20)静置2小时观察结果(2)结果观察 明胶颗粒沉积在孔底，周边平滑，或形成致密圆圈为阴性结果； 孔底呈现均匀的凝集现象，或形成一个大的边缘不整齐的圆圈，为阳性结果。(3)注意事项标本应为新鲜标本，无溶血。若标本与致敏粒子、非致敏粒子均出现反应，应将标本先和非致敏粒子吸附，然后再作检测。明胶颗粒凝集试验孔号123 待检血清 血清稀释液 未致敏颗粒 致敏颗粒 稀释度25ml 25ml 75ml 1：425ml 25ml25ml 1 : 1625ml 25ml25ml 1 : 32(
26、三)、确证（确认）试验确证（确认）试验主要用蛋白印迹试验(Western Blot, WB)。蛋白印迹法是将HIV病毒蛋白用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-Polyacrylamide Gel)电泳。将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1：100，再把它直接放到硝酸纤维膜上，并静置一段时间，使其充分接触反应，血清中若含有HIV抗体，就会与硝酸纤维膜条上的抗原带相结合。经过冲洗去掉未结合的多余抗体，并加入抗人IgG酶结合物，洗去未结合的抗人
27、IgG酶结合物，加入底物，即可使有反应的抗原、抗体结合条带呈现紫褐色，这表示阳性反应。此法一般是在ELISA或其它初筛检测阳性后再用来确认。1、 结果判断a、膜条没有条带出现表示阴性（一）b、待检标本出现条带的色度小于弱阳性对照gp120带色度时表示可疑（）。c、待检标本出现的条带色度相当于弱阳性照gp120带色度但比强阳性条带的色度弱时表示（+）。d、待检标本出现的条带色度相当于或大于强阳性对照gp120带色度时表示（+）。GAG P55 ， P24， P17ENV gp160, gp120, gp41POL p65, p51, p32(1)以上三个基因组里各出现任何一条带，而且其色度在“+
28、”或“”以上者表示阳性。最近，美国CDC规定：在P24，gp41,gp120/gp160四条带中出现任何二条带者表示阳性。(2)有一个或多个条带但不符合阳性标准者表示可疑。(3)未出现任何条带者表示阴性。2、注意事项：a、每次反应之间，要充分洗净。b、反应条件是室温20-30。c、试剂条只能用镊子夹取，不能用手接触。d、每次试验需设强阳性、弱阳性和阴性对照。（四）检验程度 初筛试验每一次检测阴性者可报告阴性，若第一次检测阳性，则需进行复测，复测时（最好用不同类型的试剂）可同时测定两孔，判定方法如下： 第一次检测 第2次检测 结果判定 （-） 阴性 （+） （-）（-） 阴性 （+） （+）（-
29、）/（+） 阳性初筛阳性的标本不能发报告，必须将血样或血袋送本省（本市）艾滋病监测检验中心确认实验室进一步做确证试验。确证试验阳性者，由省（市）监测中心给送检单位发出抗-HIV阳性报告，同时上报卫生厅（局）和卫生部疾病控制司备案。确认试验阳性和可疑的血袋均需送确认实验室妥善处理，绝对不能发出使用。三、PCR在HIV检测中的应用聚合酶链反应技术(Polymerase Chain Reaction,PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是近年来发展起来的一种的短时间内大量扩增特定DNA片段的新技术。应用该方法，可很容易地查到原先那些由于DNA拷贝数少而不足以检测出来
30、的病毒DNA或其它致病基因，从而大大地推动了疾病的DNA诊断和分子克隆基因组DNA工作的发展。由于该项技术可将极微量的DNA特异地扩增上百万倍，甚至能检测到单分子或每10万个细胞中仅含1个DNA分子的样品。它是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA片段。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。此时，两引物的3端相对，5端相背。在合适条件下，由TaqDNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。这种实验过程是在温度控制下进行的，一个变性-复性-延伸
31、的过程就是一个PCR循环。PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复；延伸的产物经第二循环变性，亦与引物互补，作为引物引导DNA合成的新模板；因此，第二循环后延伸的模板由第一循环的4条增为8条，依此类推，以后每一个循环后的模板均比前一个循环增加1倍。理论上讲PCR扩增DNA产量是呈指数上升的。PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速、简便、对起始材料质量要求低等特点。 PCR用于检测HIV的优点如下：1.与传统检测抗体的方法相比，其灵敏度和特异性更高，从而对HIV的定量检测提供了有效的手段；2.不依赖于宿主的免疫反应，无须等到免疫系统对HIV产生抗体后才能检定宿主受HIV感染的状态，这有利于对血
32、清阳转以前标本的检测和对阳性母亲所生婴儿的HIV感染的调查；3.对潜伏状态的HIV的检测不依赖于HIV在宿主细胞的生长活性。综上所述，PCR是对HIV核酸检测的有效手段，是对HIV病毒分离、血清学抗体检测方法的必要补充。在HIV感染的确诊和艾滋病诊断中，核酸的检测对病原活动的监控更加有效方便，因为核酸复制的有无和数量是体内病毒复制情况的直接反映。多聚酶链式反应(PCR)主要用于检测血浆中HIV的RNA含量，目前主要用于预测母亲将HIV传染给胎儿的可能性以及新生儿的HIV感染状况。此外，尚可用于判断病人的预后及监测抗病毒治疗的效果。 四、艾滋病病原学诊断中的几个问题。1、明确不同实验方法的意义和
33、适应范围：HIV血清学检测分为初筛和确证两类。初筛实验出现的阳性结果，应再次重复实验，若仍为阳性，则应用确证实验去证实，只有确证实验是阳性的标本方可报告为HIV抗体阳性。另外，能引起艾滋病的病毒分为两型，即HIV-1和HIV-2，两型病毒间只有少部分抗原有交叉（主要是Gag基因编码的核蛋白）。因而各型病毒试剂只能有效地检测出同型病毒的抗体。2、针对HIV感染不同时期选用不同的检测手段。HIV原发感染后的两周内，用任何方法均无法查到病毒的存在，2周后出现病毒血症，此时可用抗原检测方法、检查病毒抗原或测定病毒逆转录酶活性，而不能用血清学方法，因为抗体要到感染后6-8周才会出现。此后就只能用抗体检测
34、方法，直到艾滋病的出现，因为在这段时间HIV抗原很难从血清中查到，待发展到艾滋病阶段时才会重新出现。3、HIV抗体测定的灵敏度、特异度和预测值： 表1 HIV抗体测定的灵敏度、特异度和预测值检验结果抗体情况总 计阳性有真的阳性（a）无假的阳性(b)所有阳性试验（a+b）阴性假的阴性(c)都有抗体真的阴性（d）都无抗体所有阴性试验（c+d）总 计（a+c）(b+d)(a+b+c+d) 敏感性：是指在有抗体存在的标本中，检出抗体的准确性。敏感性低的试验将有许多假阴性。敏感性=a/a+c特异性：是指在没有抗体存在的标本中，检测其抗体缺失的准确性。特异度低的试验将有许多假阳性。特异性=d/b+d理想的
35、是，一种试验应当具有100%的敏感性和100%的特异性。但实际上，没有一种生物试验能满足这样的要求。但在敏感性和特异性最高的试验方法当中现行的HIV检测方法还是可取的，在理想的实验室条件下，许多市售的HIV抗体试验方法的敏感性和特异性都在99%以上。除非由于检验人员造成人为误差，这种检验方法所固有的特性是不会出现明显改变的。阳性试验预测值（PPV）a/a+b阴性试验预测值（NPV）d/c+d试剂的敏感性和特异性可以衡量它的优劣，但并不能决定一个测定结果正确与否的可能性大小，后者是由测定的预测值决定的。一个测定的阳性或阴性预测值，即这个阳性或阴性的结果是真阳性或真阴性的可能性。这除与所用试剂的优
36、劣有关外，还取决于测定对象本身患病率的高低。如表2所示，一个阳性HIV血清检测结果的真实性，对旧金山同性恋人群可高达99.88%，而对正常人则为18.94%，反之，一个阴性结果的真实性对前者不足90%，而对后者则高达99.997%。表2 ELISA法HIV-1抗体测定的预测值人 群预 测 值阳 性阴 性旧金山同性恋人群99.8889.06美国非高危人群18.9499.997 因而我们在实际检测工作中，对我国普通公民初筛试验结果阴性的预测值是非常高的,即可初步排除HIV感染的可能性，而出现阳性结果，则必需慎之又慎，要严格经蛋白印迹等确定实验证实后方可报告。相反，对来自疫区的外国人或在疫区长期居住
37、的归国人员可疑阴性结果，则不能轻易放过，以免因漏诊而造成严重的后果。4、 HIV抗体检测反应强度与HIV感染的概率许多HIV抗体检测方法除了是一种定性实验外，还同时是一种半定量实验。这可表现于测定不同稀释度的血清的反应性，得出阳性血清的最高稀释度，而ELISA方法则可根据光密度（0D）值的强度直接确定。反应性越强的血清，含有HIV抗体的可能性也就越大。例如，表3中的HIV感染率为30/10万的正常献血员，中等强度反应时，HIV抗体阳性概率仅为1.13%，而在高强度反应时该概率则激增到86.1%，与同样强度的来自HIV感染率极高的吸毒人群（45000/10万）的概率相近。表3 HIV感染机率与E
38、LISA反应强度的关系 人 群 HIV感染率 ELISA反应强度(%) ( /10万) 低 度 中 度 高 度非高危献血员 30 0.0007 1.13 86.1高危献血 95 0.0022 3.48 95.2军 人 150 0.0036 5.39 96.9吸毒者 45000 1.91 96.6 99.9 注：（1） 数字表示相应强度反应的血清中含有HIV抗体的概率（%）；（2） 低度为OD1，中度为1OD6。5、检测结果的处理，如果在HIV检测中发现了阳性结果，一方面应立即按国家法定乙类传染病上报程序迅速上报。对已成年患者应通知本人，并向其说明阳性检测结果的意义以及HIV感染与艾滋病之间的关系，同时还要忠告他（她）有义务不从事可将病毒传给他的活动。另一方面，检测单位也有责任为患者保密，以使其在原来的环境中生活下去。这不仅仅是出于对患者的人道，避免因无知而产生的歧视，同时也是有效控制艾滋病蔓延的重要保证。可以想象，如果艾滋病病人或HIV感染者一经发现，就被赶出单位、学校、家庭，还会有谁再来做检侧。这样势必会使携带HIV的人潜伏于社会无法被发现，艾滋病将传播得更快、更广。 （湖北省疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心）11