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1、B.7. 重复剂量 (28 天) 毒性(口饲)1.测定方法1.1引言见引言B部分1.2定义1.3测定方法原理测定物质以渐变的剂量每天给测定动物口饲，每组一个剂量标准共持续28天。在喂食的这段时期内每天仔细观察动物有否中毒迹象。在测定阶段中死去的动物要进行验尸，而测定结束后宰杀仍活着的动物并进行解剖。这种方法强调了作为一种独特端点的神经病学作用，而压制了对动物进行仔细临床观察以此来获取足够多信息的需要。这种方法应确定化学物质的神经毒素潜能，这能保证在这方面更深入的调查研究。另外，这种方法可能给出有关免疫学作用和再生器官毒性迹象的暗示。1.4. 测定方法描述1.4.1.准备工作随机分配年轻健康的动
2、物到对照组和测定组。笼子的放置可能造成的影响必须减至最小。要确认每个动物并在测定开始前将它们置于笼中至少五天，以使之适应实验室环境。测定物质或通过管饲法或经由食物或饮水喂食。口饲喂食方法取决于研究目的和物质的物理、化学性质。如有必要，测定物质要溶解在或悬浮于合适的溶剂。推荐一旦有可能，首先考虑使用水溶液或悬浮液，其次是油溶液或乳状液（如谷油），最后才是其他溶剂溶液。对于除水以外的其他溶剂必须知其毒性，测定物质在溶剂中的稳定性也需探明。1.4.2. 测定条件1.4.2.1. 动物样品倾向于使用啮齿目的鼠，尽管其他啮齿目动物也可使用。实验室通常仍使用的品种是年轻健康的成年动物。雌性动物需是从未生育
3、过的的或未怀孕的。在动物断奶后尽可能早地开始给其喂食药剂并且无论如何要在动物九周大以前开始。在研究刚开始时，要减少使用的动物间体重的差异并且不超过每种性别平均体重的20%。一旦重复口饲剂量研究作为一个初试到一个长期研究来进行，那么应在这两个研究中使用来源于同一种源的合适动物。1.4.2.2. 数量和性别在每个剂量水平使用至少10只动物（5只雄的5只雌的）。如果考虑到中期的死亡，就必须在研究完成前在动物数量上增加预计要死掉的个数。另外，一个附属的10只动物组（每种性别各5只）可每天喂以最高剂量水平的测定物质持续28天并在喂食结束后的14天中进行对恢复性或毒效持续性或毒效滞后表现的观察。1.4.2
4、.3. 剂量水平一般来说，至少使用三个测定组和一个对照组。除了不喂食测定物质外，必须以对待测定组动物相同的方式来对待对照组动物。如使用某种溶剂来喂食测定物质，则对照组动物需接受使用的最高剂量的溶剂。如果从其它实验数据的评估得知1000mg/kg bw/d的剂量不足以产生任何作用的话，就可进行一个极限测定。如果无法得到任何合适的实验数据，可进行一个范围结果研究以此来帮助选定将使用的剂量。剂量水平的选择需考虑到任何存在的毒效以及可获得的有关测定物质或相关物质的（毒药的）运动实验数据。最高的剂量水平是根据能诱导毒性作用而不致死或重伤的目的来选择的。此后剂量水平的依次递减应根据能验证任何有关剂量大小的
5、反应以及在最低剂量水平不应有任何可见的不好现象（NOAEL）这一原则来选择的。在设定递减的剂量水平时，通常2-4个交叉区间是最理想的。而另外的第四个测定组最好在相间的剂量水平间使用很大区间（如大于10的因子）。对于通过饮食或饮水喂食的情况来说，保证含有的测定物质不影响正常营养或水平衡这一点是很重要的。当测定物质通过食物喂食时，不管是基于动物体重的恒定的食物浓度（ppm）还是恒定的药剂量水平都可采用；必须详细阐明在上述二个选择中选择使用的那种方案。对于经由管饲法喂食的情况，必须每天以类似次数喂给药物并根据需要调整以此来保证一个恒定的基于动物体重的药物剂量水平。一旦重复的剂量研究被作为一个初试到一
6、个长期研究来进行，在两次研究中应使用类似食谱。1.4.2.4. 极限测定 如果有一个通过食物或饮水喂食的测定，也使用了这个研究描述的过程，其剂量水平是至少1000mg/kg体重/天或在饮食或饮水中占相等的百分比（根据体重确定），而不产生任何可观察到的毒效并且如果来自结构上相关物质的实验数据显示无法得到毒效，那么使用三个剂量水平的全面研究可能不需要了。这个限制测定在除了从人类接触显示应使用更高剂量水平的情况下应用。1.4.2.5. 观察期观察时期为28天。计划要进行追踪观察的附属组中的动物要持续至少14天不喂食药剂，以此检查毒效的滞后反应现象或毒效的持续性或恢复情况。1.4.3. 测定步骤在28
7、天的时间内每周七天要天天喂食动物以测定物质。每周五天的喂药法有待证明。当测定物质经有管饲法喂食时要使用一根胃管或合适的插管把单一药剂喂给动物。一次喂给液体的最大量是由动物样品的大小决定的。喂食量不能超过1ml/100g体重，除非在水溶液情况下最多可超过2ml/100g体重。除了那些在更高浓度下会产生恶化作用的刺激性或腐蚀性物质外，必须通过调整浓度来减少喂食量的不同，以保证在所有剂量水平上恒定的量。1.4.3.1. 综合观察综合的临床观察每天必须进行至少一次，最好是每天相同时间、次数并考虑在喂药后达到预期作用的顶峰时段进行。要记录下动物样品的健康状况。每天至少两次观察所有动物以得到发病率和死亡率
8、。一旦发现濒死动物以及处于严重危险或病痛的动物，要移出去人道的宰杀并验尸。在第一次接触前对所有动物进行一次详细的临床观察并且在之后一星期内也至少进行一次。这些观察需在笼子外的一个标准场地进行且最好每次都在同一时间。要仔细做记录，最好使用由测定实验室清楚定义的记录系统。努力确保减少测定环境的差异，并且最好由不知情人士来进行观察。迹象记录包括了但不仅限于皮肤的，毛皮的，眼睛的，粘膜的，分泌物的以及排泄和自发活动的变化（如眼泪分泌过度，瞳孔大小，异常的呼吸方式）。在步态，姿势，反应，以及抽筋或僵硬动作（如过度增长，重复循环）或怪异行为（如自残，倒步走）的表现上的变化也要记录下来。在接触的第四周，要进
9、行对不同类型刺激（如听觉的，视觉的，本体感受的刺激）的感觉反应以及紧握力量和肌肉运动活性的评估。在文献上给出了可执行过程的更多细节（见引言B部分）。当研究室作为由初试研究转向为后来的次长期（90天）研究来进行时，就可以忽略在第四个接触周内进行的功能观察。在那种情况下功能观察需包含在接下来的研究中。另一方面，从重复剂量测定的功能观察中得到的实验数据可以增加随后次长期研究选择药剂量水平的能力。例外的，对于那些在其他方面显现出毒性迹象已达到明显妨碍功能测定施行这一程度的组，功能观察也可忽略。1.4.3.2. 体重和食物/水的消耗所有的动物每星期必须称重一次。消耗的食物和水至少每周称量一次。如果测定物
10、质经由水喂食，每星期称量饮水至少一次。1.4.3.3. 血液研究接下来的血液测定需在测定的最后进行：血球密度，血球蛋白浓度状态，红血球数量，全部的和不同的白血球数量，血小板数量以及凝血时间的测量。血样应从一个标记的位置采集，且是刚好在宰杀动物之前或作为宰杀动物过程的一部分进行，并在合适的条件下储存血样。1.4.3.4. 临床生物化学为了研究在组织中的尤其是在肾和肝的主要毒性作用而进行的临床生化探究需在这样获得的血样上进行：这些血样是刚好在宰杀动物之前或作为宰杀动物过程的一部分采集的（除了那些濒死的和/或并发死亡的）。推荐在采血前对动物进行整夜禁食对于许多在血清或血浆中的测量来说，最好是整夜禁食
11、，这一点对于葡萄糖来说尤其显著。主要原因是由于不进食产生的更多的变化会掩盖更多微妙细小的现象并造成解释上的困难。另一方面，整夜禁食可能会妨碍动物一般的新陈代谢以及影响每日在测定物质中的接触，尤其在喂食研究中。如果采用整夜禁食方案，临床生化研究就应在研究第四周的功能观察后进行。血浆或血清测定需包括钠，钾，葡萄糖，全部胆固醇，尿素，肌酸酐，全部蛋白质，白蛋白，以及至少两种与肝细胞作用有关的酶（如丙氨酸转氨酶，天门冬氨酸转氨酶，碱性磷酸酶，-谷氨酸酶和山梨糖醇脱氢酶）。额外的酶（肝的或其他器官的）以及胆汁酸的测量在一定情况下能提供有用信息。接下来的尿检可随意在研究的最后一周内进行，使用定时收集的尿液
12、；外观，体积，特定重力，ph值，蛋白质，葡萄糖以及血液/血细胞。另外，要考虑用以探究广泛组织损伤的血清标记的研究。如果测定物质的已知性质可能或猜想会影响到包括钙，磷酸盐，甘油三酸酯，特定激素，以及乙酰碱酯酶在内的新陈代谢概况的话就要进行另一些研究。对于处在特定种类或基础上的物质，上述这些都需要确认。总的来说，有必要根据动物种类和由给定物质产生的被观察的和/或期待的作用来制定一个弹性方案。如果前期的基础实验数据不够充足，要在开始之前就要考虑由血液学的临床生化学的变异得出的结论。1.4.3.5. 身体解剖研究中所用的所有动物都要接受一次完整仔细的包括了体表所有通气口以及头盖骨的，胸部的和腹部的空腔
13、及其内容物的检查的身体解剖。所有动物样品的肝脏，肾脏，肾上腺体，睾丸，附睾，胸腺，脾脏，脑部以及心脏需整理成任何相连的合适的组织。并且在切割下来后要尽可能早地称量它们的湿重以防止变干。以下组织需保存在对于组织类型以及打算接下来进行的历史病理学检查来说都是最合适的固定环境中：脑部（包括大脑，小脑以及连接部分区域）脊髓，胃，小肠和大肠（包括派尔集合淋巴结），肝，肾，肾上腺，脾脏，心脏，胸腺，甲状腺，气管，肺（用固定剂填充并浸没保存），性腺，附属性器官（如子宫，前列腺），泌尿膀胱，淋巴结（最好是一个覆盖了服药路经的淋巴结和另一个远离服药路经来覆盖系统作用的淋巴结），末梢神经（髋部的或胫骨的）最好临近
14、肌肉以及一段骨髓（或者二者选其一地，一段新鲜骨髓抽取）。临床的及其他结果可能暗示检查额外组织的必要性。同样，任何根据已知测定物质性质被认为有可能成为目标器官的器官也要保存。1.4.3.6. 组织病理学检查必须对所有对照组和高剂量组的动物样品的保存器官做全面的组织病理学检查。如果在高剂量组中观察到与喂药有关的变化，这些检查就要扩展到所有其他剂量组的动物。检查所有组织损伤器官。当使用一个附属组时需像对待测定组那样对其组织和器官进行组织病理学检查。2. 实验数据需提供个体实验数据。另外所有实验数据需总结成表格形式，内容包括每个测定组在测定开始时的动物数量，测定期间自然死亡或因人为因素杀死的动物数量和
15、死亡时间，表现出中毒迹象的动物数目，对观察到的包括开始时间，持续时间以及中毒作用的严重程度的中毒迹象的描述，有器官损坏现象的动物数量，损伤类型和显示每种损伤类型现象的动物所占百分数。如有可能，数字结果应按照一种合适的且被广泛接受的统计方法进行评算。应在测定设计阶段选择统计方法。3. 实验结果报告实验结果报告如果可能，实验结果报告应该包含下列信息：实验动物：- 动物的种/属；- 动物样品的数量，年龄和性别；- 来源，饲养环境和食物等；- 在测定开始时以及此后的每周，直至测定结束时动物个体的重量。测定条件：- 如果溶剂不是水，合理的选择介质。- 剂量水平选择的理论依据。- 有关测定物质的组成/食物
16、配置品的细节，包括配置品达到的浓度，稳定性和均匀性。- 对测定物质管理的细节。- 如果可行，要求从食物/饮用水中测定物质的浓度（ppm）到实际剂量（mg/kg体重/天）。- 食物和水质的细节。结果：- 体重/体重变化。- 食物消耗，水消耗。（如能得到）- 依照性别和剂量水平的毒效应实验数据，包括毒性表现。- 自然，严谨和持续性的临床观察结果（不管是否能被反复）- 感觉活动，控制能力和肌肉运动的评估。- 相关基础水平下的血液学测定。- 相关基础水平下的临床生化测定。- 死亡时的体重和器官重量实验数据。- 验尸结果。- 组织病理学结果的详细描述。- 吸收实验数据。（如果可测）- 对结果适当的统计处理。对结果的讨论。结论。4.参考文献方法类似于 OECD TG 407.