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1、实验一 熟悉组织培养实验室（理论）一、植物组织培养概念是指将植物的离体器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（如体细胞、生殖细胞花粉等）以及去除细胞壁的原生质体，放在离体无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在人工配制的培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。由于是在离体条件下进行的，故又可称为离体培养。二、植物组织培养的特点1、植物基础学科研究的良好系统 与植物学、细胞生物学、生物化学、植物生理学、微生物学、植物遗传育种、生物制药等课程密切相关，为各学科的研究提供了基础知识、理想的离体研究条件。2、生物技术的基础 21世
2、纪是生命科学的世纪，而生命科学的巨大作用是要依靠新的技术方法的推动才得以实现。新技术：生物技术；核心是植物基因工程，基础是植物组织培养。3、经济高效、管理方便、利于自动化 场所一定 温度、湿度、光照等条件一定 试验和生产均微型化和精密化 便于实现流水作业 利于生产管理 避免微生物的干扰与破坏4、技术含量高、试验误差小、人工控制能力强 外界影响小 条件基本均一 全年时间都可试验与生产 处理间误差小5、生长周期短、生长速度快、试验重复性好 人工控制，缩短大量时间 工厂化大生产 苗木优质，技术先进 较少受外界条件影响，试验重复性好6、实验材料经济、来源单一 实验材料的遗传性是否一致，决定实验是否成功
3、 来源单一，遗传背景一致 取材少，培养效果好 繁殖快7、缺点 设备复杂、投入资金多、电能消耗大 对人员技术要求高 对试验场所要求高三、组织培养方法根据培养方式不同，可以分为固体培养和液体培养；根据培养物量的多少，可以分为大量培养和微量培养；根据培养过程中是否需要光，可以分为光培养和暗培养；根据培养方法的不同，可以分为平板培养、微室培养、悬浮培养和单细胞培养等；根据培养器官的不同，可以分为花药培养、胚珠培养、根培养和茎尖培养等。总之，植物组织培养的分类方法很多，但无论哪种方法均为在无菌条件下的离体培养。四、研究内容研究离体培养条件下，细胞或器官所需要营养条件和环境条件；细胞或组织器官的形态发生规
4、律；植物材料的快速大量繁殖；细胞融合方法和机理；再生个体的遗传和变异；种质资源的离体保存机理和方法；动物克隆技术原理等；改良生物品种，创造新的生物种类，为人类造福。五、组织培养的生理依据依据是细胞全能性（cell totipotengcy）学说。其内容为：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。六、组织培养的应用前景与趋势随着组织培养技术的日益完善，其应用也越来越广泛。主要应用领域有以下几个方面：1、植物的快速繁殖 我国离体繁殖技术的开发应用起步于20世纪80年代初。上海的康乃馨（上海园林科研所）北京的切花菊（原北京农业大学园艺系组织与细胞培养室）广州的香
5、蕉河北的杨树2、脱除病毒 改善作物的生长状态 生产无病毒苗木 提高产品质量与产量国际热带农业研究中心（IITA）、国际马铃薯研究中心（CIP）、亚洲蔬菜研究中心（AYRDC）均是以生产无病毒苗木为中心课题的。3、培育新品种 生产符合人们需要的特性的新品种如：杂交水稻（袁隆平）、手指玫瑰（韩国，2006）4、植物种质资源的保存 种质资源目前受到严重的破坏 人类需求的多样化5、人工种子的研究 1984年，罗士韦向我国介绍人工种子 1987年，人工种子纳入我国国家高技术发展计划（863计划）如：胡萝卜、苜蓿、莴苣、芹菜、小麦、水稻、西洋参、云杉、百合等30余种。6、次生代谢产物的生产 在医药、食品行
6、业中应用较多如：鸭脚树种子愈伤组织中提取利血平用于降血压人参根愈伤组织中提取强心配糖体治疗心脏病红豆杉细胞中提取紫杉醇用于抗癌药物七、植物材料的特点在无菌条件下培养的植物离体材料称为外植体。即第一次接种所用的植物组织、器官等一切材料。包括顶芽、腋芽、茎段、茎尖、形成层、皮层、花序、花瓣、胚珠、叶片、叶柄、花粉、根、表皮组织、胚、胚轴、子叶、胚根、块茎、原生质体等。1、植物幼年期与成年期比较幼年期植物： 生长快、呼吸强、核酸和蛋白质代谢快成年期植物： 代谢和生理活动较慢、光合速率和呼吸速率下降 基因可能会发生变异，细胞器DNA数量增加幼年期植物的切段比成年期植物的切段容易生根同株植物幼年到成年转
7、变是由茎基部向顶部转变2、外植体种类A、带芽的外植体 顶芽、腋芽、根茎连接处的萌孽等B、胚 自然状态和试管中的精卵融合受精后形成的各时期的胚特点：带有极其幼嫩的分生组织细胞C、分化的器官组织 可经诱导过渡到脱分化状态 嫩茎、嫩叶、形成层、根、花瓣、花萼、珠心等二倍体组织D、花粉及雌配子体中的单倍体细胞 只有体细胞一半的染色体 经过减数分裂后完全复壮八、外植体的选择1、种质的选择 易于离体培养的种类、品种或类型 生产上或研究上意义比较大的种类、品种或类型 考虑褐化问题2、外植体的增殖能力 在培养基中筛选增殖能力最强的材料；在培养中，还要考虑不同基因型植物所需要的特殊培养基3、外植体的大小一般选择
8、的外植体大小可以在0.51cm左右；太大，易污染；太小，不易启动或启动仅仅产生愈伤组织；用于脱毒培养的植物材料应在0.20.5cm左右；仅诱导愈伤组织的外植体，材料大小并无严格限制4、外植体的年龄和着生部位幼年植物的外植体比成年的易培养同株植物，基部幼年期比顶部易培养较低部位的外植体比上部的外植体易启动培养5、取外植体的季节和时间 春夏季节取材灭菌容易 秋冬季节难以成活 雨季湿热季节取材不易成功 晴天比阴雨天取材好 晴天下午比上午取材好6、木本材料的特殊性 高度分化，深休眠习性 多年生植物，纯系比较难于获得 年龄效应比较明显，高年龄材料不易培养 位置效应明显，不同取样部位，培养结果不一 经常要
9、幼化处理 杂菌污染严重九、无菌材料的获取外植体带菌是培养过程中污染的主要原因之一；建立无菌外植体，获得无菌培养材料是至关重要的1、防治外植体带菌的措施 A、外植体预先培养 方法一： 先清洗外植体，水培使其抽枝，然后以新枝条作为外植体 方法二： 室外采集的外植体在无菌条件下暗培养，待有黄化枝条长出后，取其作为外植体，表面消毒，再培养B、避免阴雨天在田间采取外植体 一般晴天下午采集比早晨采集污染少 植物表面经日晒，杀死大部分细菌和真菌C、对外植体内部有污染的材料，要取材料的深层组织2、用于外植体表灭菌的常用化学药品 消毒目标： 既要消灭材料上的病菌，又不损伤植物材料考虑因素： 药剂对各类菌类的杀灭
10、效果 植物材料对杀菌剂的忍耐力 药剂浓度、处理时间、取材部位常用药品： 乙醇：70%75%，时间不超过30s；较强的杀菌力与穿透力，浸润组织材料 升汞（HgCl2）：0.1%0.2%，时间610min左右；无菌水冲洗45次后方可接种 环境污染物；特殊装置回收次氯酸钠：商品名“安替福民” 浓度2%10% 处理时间1530min 无菌水冲洗34次即可漂白粉：含次氯酸钙10%20% 饱和溶液上清液处理时间2030min 易清洗，对组织损伤小过氧化氢（H2O2）浓度6%12% ；对材料损伤小；易除去；多用于叶片灭菌溴水：浓度1%2%，处理时间510min硝酸银：浓度1%，处理时间1530min，有污染 为了更好的达到灭菌效果，常在上述药剂中添加表面活性剂来更好的浸润整个组织常用表面活性剂： 吐温80（Tween80）或吐温20（Tween20）：使用浓度为0.1% 在外植体灭菌时，还时常借助磁力搅拌、超声波等法，来更好地进行灭菌。3、灭菌方法