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1、分子生物学期末复习总结郭 红 双一至八、内容梗概：【细菌的基因转移四种机制】1.接合(conjugation):当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移。2.转化(transformation)通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型.3.转导(transduction):是通过噬菌体将基因从供体转移到受体细胞的过程。4.细胞融合（cell fusion）:由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。【感受态细胞】受体细胞经过一些特殊方法（如电击、CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允
2、许外源DNA分子进入的状态。【转座子（transposon）】1.概念：是在基因组中可以移动的一段DNA序列，可以转移到细胞基因组的任何位置。2.转座作用：一个转座子由基因组的一个位置转移到另一个位置的过程称为转座或移位，或异常重组。3.转座特点： 能从基因组的一个位点转移到另一个位点（又称跳跃基因）； 不以独立形式存在； 转座子编码自身的转座酶； 转座的频率很低； 转座作用可引起基因表达内容的改变甚至失活。【插入序列(IS) 】最简单的转座子只含有与转座有关的酶基因，不含有任何宿主基因（包括抗药性基因），常被称为插入序列。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。【DNA的三级
3、结构】1.一级：DNA分子中各核苷之间的连接方式和排列顺序；2.二级：DNA双螺旋结构；3.三级：DNA的超螺旋结构。【染色体的三级结构】核小体染色质染色体 九、RNA转录后的拼接与加工【核内不均一RNA（hnRNA）】1.概念：是mRNA转录的初始产物，平均分子长度为8-10Kb(2Kb-14Kb)左右，比mRNA的平均长度(1.8-2Kb)要大4-5倍。hnRNA分子经裂解和拼接，只有少部分序列转变为成熟的mRNA，其余在加工过程中被降解。2.是mRNA前体的证据： (1) hnRNA和mRNA有相同的序列； (2) hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白； (3) 两者5端都有帽子结构； (
4、4) 二者为相同的聚合酶所合成； (5) 两者的3端都有多聚腺苷尾巴。3.结构特点： (1) 5端有帽结构； (2) 3端有poly（A）尾巴； (3) 帽结构后有3个寡聚U区，每个长约 30nt； (4) 有重复序列，位于寡聚U区后面； (5) 有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧； (6) 非重复序列中有内含子区。4.加工四步骤： （1）5加帽； （2）3加尾； （3）切除内含子； （4）修饰：对某些碱基进行甲基化。【帽子结构（7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp）功能】有助于mRNA越过核膜，进入胞质；翻译起始所必要的，为核糖体识别mRNA提供了信号，并协助核糖体与mRNA结合
5、使翻译从AUG开始；保护5不被5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定性。【尾巴结构（多聚腺苷Poly（A），长约200bp）功能】1）可能与核质转运有关2）与mRNA的寿命有关 3）与翻译有关 ，增强翻译效率【核酶(Ribozyme)】1.概念：是指本质为RNA或以RNA为主且含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。2.发现：四膜虫rRNA内含子确实具有酶的催化功能，建立一种崭新的概念“核酶”。 3.与传统酶的区别： (1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA； (2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化反应。4.意义：（1）突破了酶的概念. 是一种自体催化；（2）揭示了内含子
6、自我剪接的奥秘；促进了RNA的研究。（3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。【核内小RNA（hnRNA）】1.概念：多数真核细胞核内存在的许多种类的小分子RNA，其大小在100-300nt左右，因含有较多的尿嘧啶，因而又被称为U-RNA，又称U-系列。2.核糖核蛋白（RNP）：hnRNA与几（十）个蛋白质结合形成,称作snRNP.U1,U2,U5和U4/U6snRNP参与hnRNA的剪接.【RNA编辑（editing）】1.概念：指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，丢失或转换等现象。2.特点：（1）是一种与RNA加帽、加尾、剪接不同的RNA加工形式；（2）转录后改变RNA的序列，使成熟
7、RNA的序列与基因组DNA序列不同；（3）生物学中心法则的补充，扩大了mRNA遗传信息容量。3.意义：(1)校正作用；(2)调控翻译；通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子；(3)扩充遗传信息。如，锥虫coxIII mRNA编辑后增长。【RNA种类】1.核蛋白体RNA（rRNA）:核蛋白体组分2.信使RNA（mRNA）:蛋白质合成模板3.转运RNA（tRNA）:转移RNA4.核内不均一RNA（HnRNA）：成熟mRNA的前体5.核内小RNA（SnRNA）：参与HnRNA的剪接和转运6.核仁小RNA（SnoRNA）:rRNA的加工修饰7.胞浆小RNA（ScRNA）:蛋白质内质网定位合成的信
8、号识别体组分【tRNA的加工】1.原核：tRNA初始转录本多为多顺反子（polycistron），也就是几个tRNA分子串连在一起；少数的tRNA前体为单顺反子（monocistron） 。分为四个阶段：(1) “斩头”，形成5末端；RNaseP内切酶；(2) 去尾，形成3-OH末端； RNaseF，RNaseD；(3) 缺-CCA的tRNA要用tRNA核苷酰转移酶加-CCA； (4) 修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰。2.真核：(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tR
9、NA基因；(3) 5端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4) tRNA的前体分子中含有内含子。3.真核tRNA的加工和原核的异同： 真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；? 增加了剪接内含子的过程；)都要加CCA。 【rRNA的加工】1.原核：(1)在E.coli中rRNA有7个转录单位.(2)rRNA序列是保守的,每个转录单位都含有等比例的16S、23S、5S RNA及一个或几个tRNA。(3)每个转录单位转录成单个的RNA前体分子，经剪切后变成为成熟的RNA的分子。(4)rRNA前体的加工是由RNase 负责的。2.真核：(1)18S、58S和28S rRNA基因串联形成一个转录本，初始转录本
10、为45S前体，5S RNA是和它们分开转录的，和原核的rRNA基因不同。(2)真核的rRNA没有内含子，无需剪切内含子这一步。 十、遗传密码【遗传密码】1.概念：mRNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸，这3个核苷酸称为密码，也叫三联子密码。2.起始密码子：蛋白质翻译过程中被核糖体识别并与起始tRNA结合而作为肽链起始合成的信使核糖核酸(mRNA)三联体碱基序列。大部分情况下为AUG，原核生物中有时为GUG等。 3.终止密码子:蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸(mRNA)的三联体碱基序列。一般情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。 4.反密码子：tRNA中能
11、与mRNA上的密码子互补配对的三核苷酸残基，位于tRNA反密码子环的中部。除了常在第一位出现次黄嘌呤（I），可与U、A、C三者间碱基配对。5.性质：（1）简并性：指多种密码子编码同一氨基酸的现象。对应于同一种氨基酸的几个密码子称为同义密码子。（2）普遍性与特殊性：蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用，但也有例外。（3）连续性：起始密码子决定所有后续密码子的位置，密码间既无间断也无交叉。（4）摆动性：在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以“摆动”。6.特点：(1)是三联体密码。(2)无逗号。(3)是不重叠的。(4)具有通用性。(5)具有
12、简并性(degeneracy )。(6)具有起始密码子和终止密码子。(7)反密码子中的“摆动”（wobble）。【开放阅读框架(open reading frame, ORF)】1.概念：从mRNA 5端起始密码子AUG到3端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列,一个可读框编码一个蛋白质多肽链.2.框移突变:基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失.十一、蛋白质的生物合成翻译【转运RNA（tRNA）】1.特点：存在经过特殊修饰的碱基，3端都以CCA-OH结束，这是其氨基酸结合位点。被称为第二遗传密码。2.二级结构：三叶草形；三级结构：“L”形，含氢键、次级氢键、三级氢键
13、。3.功能：（1）解读mRNA的遗传信息（2）运输的工具，运载氨基酸4.两个关键部位：（1）3端CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。（2）与mRNA结合部位反密码子部位5.种类：（1）起始tRNA：能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA。真核中，起始AUG编码的氨基酸是Met；原核中，AUG所编码的氨基酸并非甲硫氨酸本身, 而是甲酰甲硫氨酸，起始AA-tRNA为fMet-tRNAfMet 。（2）延伸tRNA：其他tRNA的统称。（3）同工tRNA：代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA。（4）校正tRNA：校正tRNA能通过改变反密码子区校正突变。【核糖体】1.概念：核糖体是
14、由几十种蛋白质和几种核糖体组成的亚细胞颗粒。它像一个能沿mRNA模板移动的工厂，执行着蛋白质合成的功能。2.结构:可解离出大、小两个亚基，每个亚基组成:rRNA+蛋白质。3.特点：有三个tRNA结合位点，位于大小亚基交界面。【相关概念】1.多聚核糖体:是位于mRNA分子链上处于不同翻译阶段的多个核糖体的复合体，在核糖体不断地想mRNA附着结合，并沿着mRNA移动且进行翻译时形成。2.核糖体循环：台联合成 的延伸是通过核糖体循环，每经过一个循环，就有一个氨基酸残基加入到肽链上，周而复始地延伸，是多肽链得以合成。包括三个反应：进位反应、转肽反应和移肽反应。3.r蛋白（核糖体蛋白）：通过共价键与rR
15、NA一起构成核糖体的两个亚基，在蛋白质的生物合成中发挥重要作用。4.SD序列：原核生物mRNA上的一段富含嘌呤碱基的序列，位于起始AUG上游10个碱基左右区域，能与细菌的16S核糖体RNA 3端反SD序列的嘧啶碱基互补配对，以引导起始AUG进行翻译。5.信号肽：指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列，是2030氨基酸残基组成的肽段，将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。6.导肽：又称转运肽或导向序列，它是游离核糖体上合成的蛋白质（都是结构蛋白）的N-端信号，与蛋白质在细胞器内的定位有关。7.翻译跳跃：核糖体对密码子的识别一般从初始AUG开始，直到终止密码
16、子为止，翻译过程严格按一个可读框进行。但也有例外，翻译中可读框发生位移，常表现为一个碱基的位移，也会出现核糖体跳过一大段mRNA后继续翻译的情况，称为翻译跳跃。8.分子伴侣：指能在细胞内辅助新生肽链正确折叠的一类保守性蛋白质，它们在序列上没有相关性但有共同功能。分为两类：伴侣素和热休克蛋白。9.顺反子：是一个遗传功能单位，一个顺反子决定一条多肽链，是基因的同义词。【翻译过程】1. 氨基酸活化：氨基酸是生物合成蛋白质的原料，氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的作用下生成活化氨基酸AA-tRNA才能被准确地运送到核糖体中，参与多肽链的起始或延伸。2. 翻译的起始：三个步骤：（1）30S小亚基与翻译起始因
17、子IF-l，IF-3的作用下通过mRNA 的SD序列与之相结合；（2）在IF-2和GTP的帮助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对；（3）带有tRNA、mRNA及3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合后，释放翻译起始因子。3. 肽链的延伸：当第一个氨基酸与核糖体结合以后，按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。注意：每加一个AA是一个循环，每个循环包括：后续AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位。4. 肽链的终止：当终止密码子出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释
18、放因子（RF）能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键，释放新生的肽链和tRNA，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。5. 蛋白质前体的加工：新生多肽链大多数是无功能的，须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。（1）N端fMet或Met的切除（2）二硫键的形成（3）特定氨基酸的修饰。氨基酸侧链的修饰包括：磷酸化（如核糖体蛋白质）、糖基化（如各种糖蛋白）、甲基化（如组蛋白、肌肉蛋白质）、乙基化（如组蛋白）、羟基化（如胶原蛋白）和竣基化等。（4）切除新生链中非功能片段6. 蛋白质的折叠：新生肽链一般首先折叠成二级结构，再进一步折叠盘绕成三维结构。【真核生物翻译的起始机制
19、与原核生物的比较】1.相同点：（1）核糖体小亚基结合荷载的起始tRNA；（2）在mRNA上必须找到合适的起始密码子；（3）大亚基必须与已经形成复合物的小亚基、起始tRNA、mRNA结合。2.不同点：（1）核糖体较大；（2）有较多的起始因子；（3）RNA具有 5端帽 子结构；（4）Met-tRNAMet不甲酰化；（5）mRNA分子5端的“帽子”和3端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。【蛋白质翻译水平的调控】1.调控过程涉及mRNA的稳定性，mRNA分子结构对其功能的控制，以及与多种蛋白质因子间的相互作用。2.mRNA5端和3端所含的非翻译区是影响翻译过程的主要调节位点。3.mRNA的polyA结
20、合蛋白在翻译中作用显著4.翻译与许多蛋白质因子自身的磷酸化修饰密切相关，如eIF-4F的磷酸化可影响蛋白质合成速率。5.终止密码子在不同的生物中有偏爱选择性。【信号肽与前导肽的特点】1.信号肽：（1）1015个疏水氨基酸；（2）N端有带正电荷的氨基酸；（3）C端接近切割点处代数个极性氨基酸；（4）C端氨基酸侧链短。2.前导肽：（1）带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较丰富，分散于不带电荷的氨基酸序列之间；（2）缺少带负电荷的酸性氨基酸；（3）羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；（4）有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）-螺旋结构的能力。十二、原核生物基因表达调控【调控水平】（1）转录水平上
21、的调控（2）转录后水平上的调控：mRNA加工成熟水平调控和翻译水平调控【指挥信号】（1）原核生物：营养状况和环境因素（2）高等真核生物：激素水平和发育阶段【转录水平调控的决定因子】（1）DNA的结构（2）RNA聚合酶的功能（3）蛋白因子（4）其他小分子配基的相互作用【分类:（主要发生在转录水平上）】1)根据调控机制（1）负转录调控：在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因活性便被关闭。调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)。（2）正转录调控：在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启。调节基因的产物是激活蛋白(activator)。2）
22、根据应答方式（1）可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。如大肠杆菌的乳糖操纵子分解代谢蛋白的基因。（2）可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。如色氨酸操纵子合成代谢蛋白的基因。【相关概念】1.顺式作用组件：由若干可以区分的DNA序列组成，并与特定的功能基因相连，组成基因转录的调控区，通过与相应的反式作用因子结合，实现对基因转录的调控。如启动子、终止子、沉默子、增强子等。其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。2.反式作用
23、因子：能直接地或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白因子，也被称为转录因子（TF）。它有非特异性和特异性之分。3.结构基因：是编码大量功能各异的蛋白质或RNA的特异DNA序列。4.调节基因：是编码那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质(调控蛋白)的特异DNA序列。5.操纵子：是原核生物DNA上的一段区域，它包括共转录到一条mRNA上的多个结构基因和这些基因转录所需的顺式作用序列，这些序列包括启动子、操纵基因和转录调控有关的序列。是转录功能的一个单位，如乳糖操纵子。6.操纵基因(operator)：是操纵子中的控制基因，在操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放
24、状态，使RNA聚合酶通过并作用于启动子启动的转录。7.阻遏蛋白：与操纵基因结合后会使其从开放状态逐渐转变为关闭状态，使转录过程不能发生。8.组成蛋白：指细胞内许多含量几乎不受外界环境影响的蛋白质，其合成速度不受环境影响，由遗传决定。9.调节蛋白：是一类特殊的蛋白质，是调节基因的表达产物，它们可以影响一种或多种基因的表达。有两种类型，即起正调节作用的激活蛋白和起负调节作用的阻遏蛋白。10：操纵子学说：是关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，内容为：在细菌基因组中，编码功能相关的结构蛋白的基因通常成簇排列在一起。例如，同一个代谢途径的酶的基因一般成簇排列。11.辅阻遏物：如果某种物质能够阻止细菌
25、产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。12.弱化子：指当操纵子被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的那一段DNA序列。如，大肠杆菌中的色氨酸操纵子。13.超级调控因子：当氨基酸全面匮乏时，由空载tRNA激活焦磷酸转移酶，诱导细菌合成鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)产生应急反应而阻断操纵子的转录。ppGpp和pppGpp即超级调控因子。【大肠杆菌乳糖操纵子（lac）】1.构成：3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。2.模型：大肠杆菌能利用乳糖作为碳源，而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为惟一的碳源时才会被合成。3.结构基因编码产物：Z编码-半
26、乳糖苷酶，Y编码-半乳糖苷透过酶，A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。4.酶的诱导：指由底物导致新合成出能分解利用该底物的酶，是低等生物的普遍现象。5.IPTG（-半乳糖苷异丙基硫代半乳糖苷）：lac操纵子的一个诱导物，不会被-半乳糖苷酶水解。6.降解物敏感型操纵子：包括代谢乳糖、半乳糖、阿拉伯糖及麦芽糖等的操纵子。7.调节子：受一种调节蛋白控制的几个操纵子构成的调节系统8.葡萄糖效应：是指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖类的利用的现象。9.cAMP:是在腺苷酸环化酶的作用下由ATP转变而来的，与CRP形成复合物cAMP-CRP结合至启动子区域后，
27、才能启动操纵子的转录。10.结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖。【色氨酸操纵子（trp）】1.构成：同样是负控阻遏系统，由7个基因分5步完成色氨酸的合成。2.各基因功能：（1）trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶；（2）trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶；（3）trpF编码异构酶；（4）trpC编码吲哚甘油磷酸合酶；（5）trpA和trpB则分别编码色氨酸合酶的和亚基。3.前导肽序列：在trp基因mRNA的5端包括AUG和终止UGA的前导区，编码了一个14个氨基酸的多肽。其第10位和11位有相邻的两个色氨酸密码子。4.弱化作用：当Trp浓度较低时，转录得到7kb的mR
28、NA；当有高浓度Trp存在时，转录仅生成140核苷酸的前导RNA。【转录后调控类型】（1）RNA自身结构元件对翻译起始的调控（2）RNA稳定性对转录水平的影响（3）调节蛋白的调控作用（4）反义RNA的调节作用（5）稀有密码子对翻译的影响（6）重叠基因对翻译的影响（7）翻译的阻遏（8）魔斑核苷酸水平对翻译的影响 【原核基因表达效率高的原因】 自然选择倾向于保留高效率的生命过程。原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应无保障，只有根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。因此，原核细胞都有一套准确地调节基因表达和蛋白质合成的机制
29、。调控多以操纵子为单位进行，将功能想过的基因组织在一起，同时开启或者关闭基因表达，达到了既经济又高效的效果。十三、真核生物的基因表达调控【调控范围】1.基因的转录（核内）和翻译（细胞质内）被核膜所隔开；2.核内RNA的合成与转运；3.细胞质中RNA的剪接和加工等。【真核与原核基因表达调控的比较】1.相同点：与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后的调控，并且也以转录水平调控为最重要；在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。2.不同点：（由两者生活方式的不同决定）原核细胞的染色质是裸露的DN
30、A，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。真核生物多为多细胞生物，细胞分化后，基因表达的情况不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。【真核与原核生物转录调控的比较】原核生物功能相关的基因常组织在一起构成操纵子，作为基因表达和调节的单元； 真核生物基因不组成操纵子，每个基因都有其自身的基本启动子和调节元件，单独进行转录；原核生物的调节元件种类较少，主要包
31、括上游的启动区域调控元件和激活蛋白(activator)以及阻遏蛋白(repressor)的结合位点； 真核生物的调节元件种类很多，包括上游调节元件，如组成型元件、可诱导元件、应答元件、增强子和沉默子以及反式作用因子如激活因子、阻遏因子等。无论是原核还是真核生物，其转录都受反式调节因子(转录激活因子或抑制因子)的调节。这类调节可在两个水平上进行：一是通过调节因子的生物合成(即对其种类和数量的调节)，其过程缓慢而持续，主要涉及到细胞的分化等；二是通过对它们进行构象转变或共价修饰(即对其活性的调节)。真核生物具有染色质结构，基因活化首先需要改变染色质的状态，使转录因子能够接触并作用于启动子，称此过
32、程为染色质改型(chromatin remodeling)。【表达调控的分类】1.按性质：（1）瞬时调控或称可逆性调控：相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。（2）发育调控或称不可逆调控：是真核基因调控的精髓部分，决定细胞生长、分化、发育的全部进程。2.按顺序：（1）转录水平（2）转录后水平：RNA加工成熟水平、翻译水平、蛋白质加工水平【DNA染色体水平的调控】1.调控范围：染色质的结构、DNA在染色体上的位置、基因拷贝数的变化、基因重组、基因扩增、基因丢失、基因重排、DNA修饰等2.染色质的结构：（1）常染色质：折叠疏松、
33、凝缩程度低，处于伸展状态，碱性染料染色时着色浅。（2）异染色质：折叠压缩程度高，处于凝集状态，经碱性染料染色着色深。（3）活性染色质：具有转录活性的染色质。（4）非活性染色质：你懂的。3.活性染色质的特点：具有DNaseI超敏感位点、基因座控制区和核基质结合区（MAR序列）。4.组蛋白：能与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够恢复转录。因而，组蛋白高乙酰化是活性染色质的标志之一，而低乙酰化常伴随着转录沉默而失活。5.甲基化：动物基因组DNA中约有27的胞嘧啶是被甲基化修饰的，形成5-甲基胞嘧啶(mC)。（1）主要形式：形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)，少量N6-甲基腺嘌呤(N6
34、-mA)和7-甲基鸟嘌呤(7-mG)（2）CpG岛：CpG二核苷酸序列通常成串出现并零散地分布于基因组中，这段序列则叫CpG岛。（3）甲基化酶：日常型（mainte-nance）甲基转移酶和从头合成（denovo synthesis）甲基转移酶。（4）抑制机制：对弱启动子来说，少量甲基化就能使其完全失去转录活性。当这类启动子被增强时，即使不去甲基化也可以恢复其转录活性。甲基化密度较高时，即使增强后的启动子仍无转录活性。（5）基因印记：由表观遗传修饰决定的，来源于双亲 ；由双亲基因组功能的不对称性所决定。6.占先模型：认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。该模型
35、用以解释解释转录时染色质结构的变化。7.核基质(核骨架)：指在真核细胞核内以非组蛋白和高分子量RNA组成的网状系统，【增强子】1.概念：存在于基因组中的对基因表达有调控作用的DNA调控元件。位置不定，结合转录因子后，可增强基因表达。 2.分类：组织和细胞专一性增强子；诱导性增强子。【绝缘子（insulator）】概念：一段长约数百碱基对，能够妨碍真核基因调节蛋白对远距离的基因施加影响的DNA序列。功能是阻止激活或阻遏作用在染色质上的传递，使染色质的活性限定于结构域之内。【Britten-Davidson模型】1.传感基因：在整合基因的5端连接着一段具有高度专一性的DNA序列。2.内容：是真核生
36、物单拷贝基因转录调控的模型，认为当传感基因和某种信号分子相互作用时，激活了整合基因的表达，产生具有生物活性的RNA或蛋白质分子；当整合基因的表达产物和受体基因(receptor gene)相互作用时，就启动了结构基因的表达。【管家基因】用以合成细胞所必需的各种成分的组成型基因，又称为管家基因(house-keeping gene)。【反式作用因子】1.三个结构域：DNA结合结构域、转录激活结构域和二聚化结构域。2.锌指结构（ZF）：是一种常出现在DNA结合蛋白中的结构基元。是由一个含有大约30个氨基酸的环和一个与环上的4个Cys或2个Cys和2个His配位的Zn构成，形成的结构像手指状。 十四
37、、病毒的分子生物学【腺病毒(Aflenovirus)】是一种典型的双链DNA病毒，球形，无包膜，直径70-80nm。感染细胞后可关闭宿主细胞某些基因的表达，大量合成病毒蛋白质，致使细胞的功能失常。【丙型肝炎病毒HCV(hepatitis）】HCV是有外膜的单正链RNA病毒，基因组长约l0000nt。【人类免疫缺陷病毒(HIV)的生活周期】吸附，侵入和脱壳，反转录，整合，病毒RNA和蛋白质的合成，装配，释放，成熟。 【长末端重复序列(LTR)】LTR具有启动子和增强子的双重功能。【亚病毒】是一类比病毒更小，结构更为简单的微生物，有的是单一的生物分子，有的是由小RNA分子与其自身编码的结构蛋白包裹
38、成小的病毒颗粒，称为卫星病毒。已知的包括类病毒、卫星RNA、卫星病毒以及朊病毒。【类病毒】是共价闭合单链环状RNA分子，无mRNA活性，也不编码任何蛋白质。【朊病毒】是一种蛋白质侵染因子，仅含朊病毒蛋白，不含任何核酸。十五、现代分子生物学技术【基因操作内容】包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等。【基因工程】1.概念：是对携带有遗传信息的核酸分子进行设计、重组和加工的分子工程，包括基因的重组、克隆和表达。（重组体DNA技术是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作。与
39、基因工程相似。）2.五个步骤：（1）获得目的基因片段（2）连入合适载体（3）转入受体系统（4）筛选重组子（5）表达外源基因3.技术特点：（1）不受亲缘关系的限制，打破了物种界限，把不同种类生物的遗传物质组合在一起，人为地将高等生物的基因(如人胰岛素基因)引入细菌，使其产生相应蛋白质（人胰岛素）。（2）可以定向地改变生物的遗传特性，通过有目的的取得某种基因，并将该基因引进原本没有这种基因的生物体，改变后者的遗传特性。（3）增加目的基因的剂量。【基因克隆】1.概念：又称为分子克隆,或重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合子，并使之在适当的宿主
40、细胞中扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。2.克隆：（1）指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系；（2）或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程。3.主要工具酶：将DNA切开的酶，如DNA限制性内切核酸酶；将四种碱基聚合的酶，如核酸聚合酶；将DNA片段连接起来的酶，如DNA连接酶；DNA片段末端修饰的酶，如末端转移酶。4.克隆载体：（1）概念：指将外源DNA片段带入宿主细胞并进行复制的运载工具。（2）种类：通常由质粒、病毒或一段染色体DNA改造而成，多为共价闭环DNA分子。（3）要求：具有自主复制起始点（ori）；携带易于筛选的选择标记，如抗氨苄青霉素(ampr)等；含有多种限制酶的
41、单一识别序列（多克隆位点mcs），以供外源基因插入；除保留必要序列外，载体应尽可能小；使用安全。5.表达载体：能控制外源基因在宿主细胞内表达的序列的载体，多为真核载体。6.穿梭载体：真核生物的克隆载体，为了便于操作常使其先在大肠杆菌中扩增，将目的基因与其构成合适的重组体后才转入真核细胞，因此一般构成穿梭载体。【DNA限制性内切核酸酶】1.命名法：取分离菌属名的首字母，种名的前两个字母，如有株名也取一个字母，当一个分离菌中不只一种酶时，以罗马数字表示分离出来的先后次序。修饰性甲基化酶标以M，限制酶标以R（R常省略）。2.命名形式：（M/R）+属（首字母）+系（首二字母）+株（首字母）+序（罗马字
42、）。如流感嗜血杆菌d株的第三种酶表示为：H in d .3.限制修饰系统:三类，I、型。（1）I型：多亚基双功能酶，对DNA的甲基化和切割由同一个酶完成。切点与识别位点随机。（2）型：甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。（3）型：两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割。4.同裂酶和同尾酶：由不同微生物分离得到的限制酶，如果识别位点和切割位点相同，则称同裂酶(isoschizomers)；如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶(isoeaudarners)。5.功能：降解外来的DNA，自身DNA的酶切位点由于修饰酶的甲基化而受到保护。【DNA连接酶】1.
43、功能：有效地使在黏性末端退火碱基对处闭合断开的磷酸二酯键连接。2.提高末端连接效率的措施：提高 DNA连接酶浓度；提高DNA片段浓度；降低ATP浓度，以增强连接酶与DNA的结合；加入多胺化合物，如亚精胺(sperndine)，降低DNA的静电排斥力；加入大分子排阻物乙二醇(PEG)、强水化物三氯化六氨钴等。3.平端连接：DNA片段两末端若为相容黏性末端或平末端，连接时可以发生分子间串联，或是分子自身环化。DNA片段链短浓度较低，有利于自身环化；反之亦反。4.接头：指含限制酶识别序列的DNA片段，通常是一条回文结构的寡核苷酸，在溶液中自身配对成为双链片段。含有不只一种限制酶的末端识别序列，称为多
44、接头。【-互补（蓝白斑筛选原理）】 pUC质粒带有大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的一个片段LacZ基因，它编码-半乳糖苷酶的一个片段，而宿主大肠杆菌能编码与这个片段互补的-半乳糖苷酶的另一部分，实现互补，形成完整的-半乳糖苷酶，此酶在诱导物IPTG作用下能分解发色底物X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落呈原色（白色）。【裂解生长与溶源生长】1.裂解生长：环状DNA在细菌中多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌；2.溶源生长：噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制
45、，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。【柯斯质粒(cosmid)】1.概念：指含有cos位点的质粒，可以携带大至35-48 kb的外源DNA，而入噬菌体载体最多只能携带23 kb的外源DNA。2.用途：主要用于构建基因组文库，以获得基因组大片段DNA的克隆。【DNA克隆】1.五个基本步骤：获得目的DNA片段：从cDNA文库中筛选、PCR合成或生物公司合成；将目的片段连接到克隆载体上：用限制酶切出外源DNA和载体的相同的黏性末端后加入连接酶；将人工重组的DNA引导进入受体细胞：即转化细菌或转染病毒过程；检出目的转化子：利用含抗生素的选择培养基进行多重筛选；将目的转化子进行表达分析：大量生长后大提
46、质粒，进行酶切鉴定和分子测序。【目的基因的获取】1.途径：最常用且无需已知序列的方法是建立基因组文库或cDNA文库，从中筛选出目的基因的克隆；若基因序列已知，则用化学方法或酶法合成，或通过设计引物，用PCR方法由模板扩增获得；通过鸟枪法或差异显示和RT-PCR等方法获得。2.基因组文库：（1）概念：指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。（2）构建的五步骤：染色体DNA的片段化载体DNA的制备体外连接与包装重组噬菌体感染大肠杆菌基因文库的鉴定和扩增 3.cDNA文库：（1）概念：指细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和。（2）构建的关键：提取制备高质量的mRNA。（3）构建的五步骤：制备mRNA；合成cDNA；制备载体DNA；双链cDNA的分子克