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1、白姑鱼中日群体遗传分化研究刁苏劲(浙江海洋学院渔业学院, 浙江 舟山 316004)摘要 白姑鱼（Argyrosomus argentatus）属鲈形目，石首鱼科，白姑鱼属，为暖温性近底层鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋西部海域，我国沿海均有分布，是产量较高的重要经济鱼类。在东黄渤海和南海北部，白姑鱼的分布范围较广，从河口、海湾和沿岸浅海至水深110m陆架海域均有出现，以渤海湾、长江口、台湾浅滩和海南岛以东陆架区(包括整个粤东陆架区,以下简称陆架区)分布为主。为阐明白姑鱼不同地理群体的遗传结构和遗传变异，对白姑鱼青岛群体(5尾)、上海群体(4尾)、广州群体（5尾）和日本有明海(5尾)群体，共19
2、个个体的线粒体DNA (mitochondrial，mtDNA)的细胞色素b (cyt b) 基因片段序列进行分析，共获得四个群体cyt b基因片断500bp的一致序列。在所获得的19个个体中总共检测到9个单倍型，各单倍型的变异全部是转换或颠倒, 无插入和缺失。(A+T )含量平均值为49.9925%，日本有明海群体最高，为50.27%, 大于(G+C )的含量49.73%，(G+C)含量平均值为50.0075%，最高则是广州和青岛群体。核苷酸多样度以青岛群体最高,为0.00680.0050，其它两个中国群体较低，最低的日本有明海群体则只有0.00150.0016。有明海群体的FST值很大，为
3、0.830到0.906之间，而中国的三个群体的FST值均很小，为-0.1022到-0.0424。成对的FST值清楚地表明白姑鱼的群体遗传结构分化主要在中日群体间。系统树显示存在中日两个完全隔离的地理分支。本研究结果有力地表明白姑鱼种群在黄渤海和东海之间有很高频率的种群间基因交流，但中日间存在非常有限的基因交流。关键词 中日；白姑鱼；遗传分化；线粒体DNA Genetic variation of white croaker（Argyrosomus argentatus）populations in China and JapanDiao Sujin(Fishery School of Zhej
4、iang Ocean University, Zhoushan, Zhejiang, 316004) Abstract The white croaker (Argyrosomus argentatus) belongs to the Perciformes, Sciaenidae, and white croaker Genus. It is a kind of warm water ground fish, widely distributes among the Indian Ocean and the west Pacific Ocean, including China coasta
5、l waters, and is one of the important high-yield economical fishes for China. White croaker distributes widely in the yellow Sea, East China Sea and northern South China Sea. It can be commonly seen in estuaries, bays, coastal waters and shallow seas deeped to 110 m above the continental shelf, main
6、ly in the Bohai Bay, Yangtze River estuary, Taiwan bank and the shelf in the east of Hainan Island (Including the whole continental shelf area in the east of Guangdong, shortted in “shelf area” below). In order to clarify the genetic structure and evolutional relationship among different geographic
7、white croaker populations, 19 individuals collected from 4 populations: Ariake Sea(5 individuals ), Guangzhou(5 individuals ), Shanghai(4 individuals) and Qingdao(5 individuals) were studied in this paper. 500bp consensus sequences were obtained based on the analysis of cytochrome b (cyt b) gene fra
8、gments of the mitochondrial DNA (mtDNA). Nine haplotypes were found in this research, all variations are resulted from reversing and transformation, no gene inserting and missing. The average value of (A+T) percentage is 49.9925%, the highest value 50.27% appeared in the Ariake Sea samples, which is
9、 larger than the (C+G) value of 49.73%. The average value of (C+G) is 50.0025%, and highest value appeared in Qingdao and Guangzhou samples. The highest nucleotide diversity value is 2.80001.7686 in Qingdao samples, and the lowest value is 0.00150.0016 in Ariake Sea samples. The FST values between A
10、riake Sea and China populations were very large, ranging from 0.830 to 0.906. However, The FST values among China populations were negative, between -0.1022 to -0.0424. The pairwise FST value clearly shows that the genetic variation is mainly occurred between the Chinese and Japanese groups, and the
11、 neighbor joining tree also shows there are two totally separate clades. It firmly proves that genetic flow frequency of white croaker populations in Huanghai Sea, Bohai Sea and East China Sea is very high, but very low between Chinese and Japanese waters.Keywords China and Japan; White croaker (Arg
12、yrosomus argentatus); Genetic variation; mitochondrial DNA白姑鱼中日群体遗传分化研究1 前言1.1 白姑鱼简介白姑鱼（Argyrosomus argentatus）属鲈形目（Perciformes），石首鱼科（Sciaenidae），白姑鱼属（Argyrosomus），为暖温性近底层鱼类，广泛分布于印度洋和太平洋西部海域，我国沿海均有分布，是产量较高的重要经济鱼类1。在东黄渤海和南海北部，白姑鱼的分布范围较广，从河口、海湾和沿岸浅海至水深110m陆架海域均有出现，以渤海湾、长江口、台湾浅滩和海南岛以东陆架区(包括整个粤东陆架区,以下简称
13、陆架区)分布为主，此外还分布于印度-西太平洋区的波斯湾和阿拉伯海从阿曼到印度的西海岸；中国南海和印度尼西亚、爪哇外海也有分布3。栖息于热带海洋沿岸泥沙质底部，深度10-60米。生殖季节结群向近海洄游。大部分2龄性成熟（少数1龄），绝对生殖力为2.3万19.0万粒。产卵期为春季直夏初，卵浮性。肉厚而细嫩。隶属白姑鱼属，本属吻圆钝，吻褶完整；吻上孔3个，吻缘孔5个。颏孔细小，一般6个，有时4个。鳃盖骨后上方具2个扁棘。鳔前部圆形，前端不突出成囊，具2427对侧肢；侧肢一般具腹分支，不具背分支。耳石腹面有蝌蚪形印记（印记尾区呈T字形），我国产5种。近海暖水性中下层鱼类，体呈椭圆形，一般体长20厘米左
14、右、体重200400克、口大，上颌与下颌等长，上颌牙细小，排列成带状向后弯曲，下颌牙两行，内侧牙较大、锥形，排列稀疏额部有6个小孔，无颜须、体被栉鳞，鳞片大而疏松，体侧灰褐色，腹部灰白色。尾鳍楔形，胸鳍及尾鳍均呈淡黄色。喜栖息于海水澄清、水深40-100米、底质为泥或泥沙的海区。捕食性鱼类，喜食端足类、头足类、虾类、蟹类及小型鱼类，还食少量蛇尾类。2龄鱼大部分性成熟并参加生殖洄游，生殖期间常发出咯咯声，产浮性卵，球形，卵径0.73-0.8毫米。集群产卵，产卵后分散索饵，属重要经济鱼类3。图1-1 白姑鱼示意图Fig.1-1 Picture of White croaker (Argyrosom
15、us argentatus)白姑鱼每年有两个产卵期，分别为春季的34月和秋季的1011月,春季为主要产卵期；陆架区的主要产卵期为58月，其中6 月为全盛期。目前,有关经济鱼类生物学的分析已有相关报道，而关于白姑鱼的生物学特性方面则未见报道。本文利用近年来与1964 和1992 年调查相比，当前南海北部陆架区和北部湾白姑鱼自然死亡系数均小于往年，而捕捞死亡系数则相反。由参数E (开发率)可以看出，进入20 世纪90 年代以来，开发率不断增大。同20 世纪60 年代相比，当前资源的开发力度大大加强了。2 龄以上的鱼所比例在北部湾和大陆架中分别仅为为4.15 % 和12.14 % ，而20 世纪60
16、 年代的资源调查中，2 龄以上的比例在北部湾和大陆架区域分别占62.19 %和71.15 %。由于过度捕捞,南海北部白姑鱼资源群体结构简单化、小型化，性成熟提前，幼鱼和补充群体已成为渔业生产的主要捕捞对象。白姑鱼最适开捕年龄应大于1190 龄，相应地开捕体长为211 mm；而陆架区则大于1195 龄，相应地开捕体长为168 mm。1.2 遗传多样性及其研究方法 从远古时代进行动物驯养、植物栽培起，人类就开始了对生物遗传多样性的利用和认识。但是科学地总结并提高到理论高度进行系统化的首推达尔文。他引用大量资料论证 “在家养状况下的变异”，说明了栽培植物和家养动物种内丰富的显然是可遗传的，并称之为多
17、样性（Diversity）。在随后出版的动物和植物在家养下的变异一书做了更全面详尽的论述7。达尔文还进一步讨论了自然状况下的变异，虽然当时孟德尔遗传定律尚未被世人所知，但他根据野外观察认为，很多野生生物的个体差异是遗传的。变异是如此丰富和普遍，他专门写了“可疑的物种”一节，特别提到得康多尔（A de Candolle）关于栋树的著作7，其中对变异的频率还进行了统计。达尔文正是在总结遗传多样性的基础上提出了进化理论。 1900 年孟德尔遗传规律被广泛证实以及随后用生物统计方法对微小差异的遗传分析，为群体遗传学奠定了基础。Fisher、Haldane和Wright的学说要点是群体内突变产生不同的基
18、因型，即遗传多样性，自然选择和遗传漂变改变基因频率导致物种形成，后来被称为新达尔文主义。20年代摩尔根染色体遗传学及后来发展成的细胞遗传学为群体遗传学理论提供实验证据，例如Dobzhansky对果蝇自然群体染色体倒位的研究2。1975 年Southern发明DNA片段经琼脂糖电泳按分子大小进行分离后转移到硝酸纤维素膜上用标记的探计进行DNA-DNA杂交可以检测出同源片段的技术。DNA序列多样性开始可以检测出，即限制片段长度多态性（RFLP）。证明DNA有比蛋白质更丰富的多样性8。Saiki 1985 发明聚合酶链式反应（PCR）后，快速检测DNA多样性的方法如随机扩增多态DNA（RAPD）和D
19、NA扩增指纹（DAF）在1990 年问世。生物基因图谱和DNA全序列分析正在有组织地进行，完全检测生物遗传多样性有了可能8。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分。广义地讲，遗传多样性就是生物所携带遗传信息的总和；狭义上，则指种内不同群体和个体间的遗传多态性的程度，或称遗传变异4。遗传多样性是生物多样性的核心问题，蕴藏于物种内或种间的分子、细胞和个体水平的遗传变异，是遗传多样性的基础，也是物种保持进化潜能的基本条件，与生物多样性的形成、消失和发展休戚相关。遗传多样性是物种进化的本质，也是人类社会生存和发展的物质基础。遗传多样性的研究无论是对生物多样性的保护，还是对生物资源的可持续利用，以及未来世
20、界的食物供应，都有重要的意义。遗传多样性的研究工作是生物多样性就地保护的基础。遗传资源的保护和利用，不仅是生物多样性保护的关键因素，也是大农业持续发展的需要，关系到世界未来的食物供应问题9。 最早的蛋白质凝胶电泳（Smithies, 1955）是淀粉凝胶电泳（简称SGE，下同）分离人的血清蛋白，并有不同人群有不同的蛋白谱的报道，氨基酸顺序不同的蛋白质因所带电离基团的不同而有不同的净电荷，在电场中显示不同的淌度而相互分离，用染蛋白质的染料可以显示出来7。不久，Hunter和Markert（1957）用酶组织化学染胶片，发现了酶的多分子形式，称为同工酶（Isozyme）4。同工酶电泳技术是遗传多样
21、性研究的主要手段之一，凝胶电泳技术结合酶的特异性染色用于遗传变异的研究可以说是遗传多样性研究乃至进化研究史上重要转折点，30多年来利用同工酶技术已对大量生物群体的遗传变异进行了广泛研究，同工酶技术目前仍是遗传多样性研究的主要方法。它们可以表现特定的差异，从而鉴别不同的基因型，间接的研究基因的变异5。蛋白质电泳的原理是利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色反应，通过检测DNA表达产物电泳谱带的不同来显示蛋白质（同工酶）在遗传学上的多态性。同工酶电泳的应用掀起了群体遗传学的一场革命，因为基因流、等位基因频率等对于群体生物学至关重要的参数均可由若干个同工酶座位信息的组合得到。同工酶电泳技术除了
22、用于遗传多样性研究外，还用于品系鉴定和遗传结构等方面有大量的研究。RFLP法的基本步骤是用限制性内切酶消化从生物中提取的DNA（模板DNA）为不同长度的片段，用琼脂糖电泳分离开，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上，然后用专一序列的标记DNA（探针DNA）在膜上与模板DNA杂交。最后用自显影或显色或发光分析显示与探针同源的DNA片段。因为限制酶识别专一的碱基序列，因此，DNA序列的变异会导致酶切点的消失或增加，限制片段的长度发生变化显示多样性。RFLP为Grodzicker等1974年所创(Grodzicker et al., 1974)6，是最早的分子标记，1980年Bostein首先提出了利用RF
23、LP作为标记构建遗传图谱(Botstein et al.，1980)10。RFLP作为第一代DNA分子标记开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。RFLP的探针来源主要是基因组DNA(gDNA)克隆和cDNA克隆两种。cDNA探针的保守性较强，故许多同科物种可以通用，是研究物种起源演化的较好探针，但是这类探针检测多态性频率较低。RFLP在渔业上的应用研究仅次于同工酶，是在以DNA为基础的分子生物技术学中研究最早，应用最广，文献资料最多的技术。Saiki（1988）用耐热的DNA聚台酶完善了聚合酶链式反应。第一步是用专一的一对引物（寡脱氧核苷）与变性的模板DNA形成部分双链（退火3865
24、）。第二步是聚合酶催化从引物开始的DNA合成，即延伸阶段（4575），第三步把合成的双链DNA再变性（8897）为两条单链模板，模版DNA加倍。再经过一个退火、延伸和变性周期，模版增加到4倍。通过30个周期，模版DNA扩增百万倍。Williams等（1990）用单个人工合成的随机排列的10 个碱基作为引物进行各种生物DNA扩增，用琼脂糖电泳可以检测到丰富的多态性，称为随机扩增多态DNA（RAPD），原理是这种短引物能同时识别模版DNA上不止一个同源位点，同时扩增几个DNA片段，Caetano-Anolles等（1991）改变扩增的条件，用更短的引物（6-9）碱基进行DNA扩增，然后用PAGE及
25、银染显示扩增产物，得到极高水平的多样性，称为DNA扩增指纹（DAF）。类似的方法还有扩增片段长度多态性（AFLP）和微卫星DNA标记（Microsatellite） 7。这些方法不经过花费时间的杂交阶段，所用的模版DNA量从微克级降到纳克甚至皮克级（1微克=103纳克=106皮克），大大节省时间、实验材料和实验费用。1.3 线粒体DNA及其作用DNA分子是遗传物质的载体,其自身拥有丰富的变异；每个 DNA分子的碱基顺序构成了 DNA分子的特异性，DNA序列的差异和多态性为遗传分析提供了更直接、更完全的信息22。在进化历程中，变异首先发生在 DNA分子上,然后表达在蛋白质分子上,最后表现在形态水
26、平上。DNA分子序列的每一个碱基都是一个相对独立的特征,因此,直接分析 DNA核苷酸组成上的变异,以 DNA分子序列提供的信息为依据,是遗传多样性研究中最准确、最有效的分析方法。近几年来由于PCR技术的广泛应用,配之以全自动测序仪和高灵敏度的荧光检测手段,使得DNA序列分析成为一种快速而方便的常规手段。DN序列分析除了可用于高级分类阶元群的系统学研究外,近年来用于群体水平的研究也逐渐增多。以DNA序列为核心的分子标记中最重要的是表达序列标定 (Expressed sequence tags,EST标记)、核DNA片段序列多态及线粒体DNA(mtDNA)多态性标记,前者是对核基因组的标记,而后者
27、则是对细胞器(线粒体)基因的标记。EST标记主要是在cDNA文库中随机筛选克隆,并进行单向测序(Singie pass sequencing )而产生的250-800bp的核苷酸序列片段。由于 EST 来源于cDNA克隆,因此它部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式。核DNA片段序列多态性标记,用于核DNA片段序列多态分析的主要是核糖体RNA基因,是高度复制的串联序列单位,它由18S、5.8S 、28S 以及被5.8S所分隔的基因转录间隔区ITSI和ITS2共同组成。其中的转录间隔区是核基因组中进化较快的DNA片段,由于ITS 区序列在科以下阶元的分类中有非常明显的优势,而18S序列
28、的高度保守性,又使它成为科以上水平系统演化研究中最常采用的基因序列。自80年代以来,线粒体DNA(mtDNA) 分析在动物进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护学领域得到了广泛应用(权洁霞, 等，1992；戴继勋, 等，1997)19。鱼类具有同其它脊椎动物一样的基因序列且较为保守，鱼类线粒体基因组包括13 个蛋白质编码基因、2 个rRNA 基因、22 个tRNA 编码基因和1 个非编码区。鱼类线粒体 DNA大小在15.2Kb-19.8Kb之间，同核DNA相比,mtDNA编码效率较高，mtDNA基因组结构非常紧凑，进化速度快，一般认为mtDNA的进化速率是核基因的5-10倍，mtDNA是
29、母系遗传，故有效种群大小为核DNA两性遗传方式的1/ 4 ,因此较少的样本能反映群体结构22。目前有关线粒体DNA多态性检测方法主要有直接测序方法和限制性内切酶法。直接测序方法是根据研究目的测定mtDNA全序列或部分基因片段，用于比较不同物种或个体间相关序列的差异，从而进行种群遗传结构或进化关系的研究。此法可以获得大量可靠数据，但技术要求高，花费大，尚不适合大群体和大样本的遗传、进化研究。但是，由于其可以直接揭示生物的本质，随着相关技术的发展和改进以及测试费用的降低，该种方法可能成为mtDNA多态研究的主要方法；限制性内切酶法：该方法利用识别特定碱基序列的限制性核酸内切酶对mtDNA进行单酶、
30、双酶或不完全酶消化，并采用琼脂糖凝胶电泳将各消化片段分开，测定它们的迁移距离，计算各片段的大小。分析结果可确定限制酶在mtDNA上的消化座位的位置，构建出该mtDNA的限制性酶切图谱21。鱼类mtDNA是一种共价闭合环状的双链DNA分子, 结构比较简单, 仅编码少量蛋白质, 呈母系遗传, 且进化速度快, 其碱基置换率为核DNA的510倍, 从而增大了种群间及近缘物种间的遗传差异, 使之易于被检测, 因此, mtDNA 为研究种群遗传结构和差异提供了一种灵敏的检测方法。另外, mtDNA不同的区域进化速度存在差异, 用mtDNA检测地理隔离在鱼类群体间产生的遗传差异, 是近年来鱼类分子遗传学研究
31、的热点之一16。线粒体细胞色素b (Cyt b)基因是目前线粒体中结构和功能了解得最为透彻的基因之一, 进化速度适中, 是线粒体DNA上的蛋白质编码基因, 适合种群水平差异的检测, 而且容易为保守序列扩增, 研究最为广泛, 是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记, 其中的一个基因片段就包含了从种内到种间乃至科间的进化遗传信息, 在系统进化和分类研究上有较强的适用性。为阐明三者之间的遗传多样性和进化特点,有必要使用合适的相对稳定的分子标记来研究。线粒体DNA (mitochondrialDNA, mtDNA)是核外DNA, 由于它具有分子结构简单、母系遗传、进化速率快、缺少重组等特点,已成为群体
32、遗传结构、地理变异、系统发育及物种特性研究等领域的有效的分子标记, 其做为群体遗传分析的工具具有广泛的优点22。细胞色素b (cytochrome b，cyt b)基因的结构和功能在mtDNA 的13个蛋白质编码基因中被了解的最为清楚,且进化速度适中,因此其在鱼类群体与进化遗传学中的应用较为广泛。同其它脊椎动物一样,鱼类线粒体DNA (mtDNA)是共价闭合双链环状DNA,包括一条重链(H链)和一条轻链(L 链),是细胞核外具自主复制转录和翻译能力的遗传物质。由22个tRNAs基因、2个rRNA基因(12SrRNA和16SrRNA)、D - Loop 区及13个疏水性蛋白质多肽基因组成。与核D
33、NA相比,鱼类mtDNA具有分子小、结构简单、具有恒定的信息容量、基因排列具有相对稳定性、编码效率高、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点,是一个相对独立的复制单位。已成为鱼类群体遗传与系统演化研究的重要分子标记。在无背景资料的情况下,为了获得较为客观的生物间进化关系,一般主张选择mtDNA不同区域或整个mtDNA 全序列进行分析研究的方法22。目前，过度捕捞、海洋环境污染和海洋生态环境的不断恶化已经使白姑鱼种群资源面临枯竭的危险（周发林等，2001）14。近年来，东海区白姑鱼的渔获量急剧下降，2000年的渔获量从历史最高的20000吨跌至220吨。此前的研究多集中于白姑鱼种群的生物学特
34、征，而对白姑鱼种群遗传结构的研究较少，因此使白姑鱼种群资源的保护、发展和可持续利用措施的制订相对滞后17。线粒体DNA为测定生物种群遗传结构、判别种群归属的方法之一，已经在多种海洋鱼类上开展过研究，研究表明相同水域间的种群基因结构分化可能会因为洋流影响和个体迁徙而随时间的推移慢慢降低，或者遗传分化的影响会随着时间的推移而得到强化。从海洋自身的深度和广度来看，海洋鱼类的遗传分化水平较低。海洋鱼类的浮性卵、仔鱼和成鱼的广泛分布性和在水体中自由迁移的特性大大方便了基因在种群内部的流动。然而，中日海洋鱼类种群的显著遗传差异正被不断发现，例如鲈鱼、梭鱼等。本研究主要通过线粒体DNA细胞色素b基因研究了中
35、日白姑鱼种群的基因结构和遗传分化，实验结果将有助于对白姑鱼种群资源的保护和管理17。2 材料方法2.1 材料来源白姑鱼样品于2005年410月采自黄海（青岛）、东海（上海）和南海（广州）以及日本有明海，鱼体肌肉取出并立刻冷冻至，并运至实验室。每个地点的样品鱼取5条（其中东海区样品鱼为4条）共计19尾进行分析。2.2 样本组DNA提取按传统法（酚/氯仿抽提法）从肌肉中提取基因组DNA的详细方法和步骤如下11：（1）将样品放入离心管剪碎，加入600L STE （10mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1mol/L EDTA，pH 8.0；1%m/v SDS），于振荡器上震荡均匀。（2）
36、加蛋白酶K（20 g/L）15L,终浓度0.5 g/L，颠倒混匀，于50烘箱内培育过夜（8小时）。（3）烘箱内取出后凉至室温：加600L（pH 8.0）平衡酚，温和颠倒混匀至乳浊（10min）。离心（12000g，10min），小心吸取上清至另一干净离心管。 （4）加等体积的反应液。各反应液体积比为苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀10min，离心（12000g，10min），小心吸取上清至另一干净离心管。（5）加等体积氯仿：异戊醇（24：1）, 颠倒混匀10min，离心（12000g, 10min），小心吸取上清至另一干净离心管。加入2倍体积的预冷乙醇，颠倒混匀，-20存放2小时
37、以上。 （6）离心（10000g, 10min）产生白色沉淀，轻柔倒去乙醇，再加入300L 75%的预冷酒精，缓慢颠倒洗涤DNA沉淀，再离心（10000g，10min）。 （7）重复步骤（6）（注：不要将DNA沉淀倒掉）。 （8）将DNA样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥 (视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间)，加入适量TE（10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH8.0）溶解，置4C冰箱待用或长期保存于-20C待用。2.3 PCR扩增、产物纯化及测序使用本实验室设计的特异性引物扩增白姑鱼线粒体cyt b基因14，引物序列如下：L14734: 5-AAC CAC CGTTGTTATT
38、CAACT-3，Cyt b: 5-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3。PCR反应液体积为25L，其中包括50 mmol/ L KCl ，10 mmol/ L TrisHCl，pH8.3，MgCl2 1.5mmol/L，各种dNTP200mol/L，Ex Taq酶1.25units，每个引物各0.2mmol/L，模板DNA1L，加灭菌蒸馏水至25L。PCR反应在Eppendorf Mastercycler 5333扩增仪上进行。PCR反应条件为：94预变性3min，然后进行40个循环，每个循环包括9445s，5045s，721min，最后72延伸10min。以上反应均用阴性对照来检
39、查是否有DNA污染。取1.5L扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。每个样品取2L检测，对于扩增效果良好的样品进行回收。回收时用1.5%的琼脂糖凝胶，150V电压电泳分离，用小量胶回收试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）进行回收和纯化，回收步骤如下：（1）紫外透射仪割下含目的DNA条带的琼脂糖块，放入1.5mL离心管中。（2） 按每100 mg琼脂糖加入300L S1液的比例加入S1液，置50温浴30 min，使琼脂糖完全融化。每5 min颠倒混匀一次。（3）当目的片段500bp时，省略此步。（4）将融化的琼脂糖溶液移入吸附柱，10000g离心30s
40、。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入收集管中。（5）向吸附柱中加入500L W1液，静置1 min后，10000g离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。（6）重复步骤（5），10000g离心1min。（7）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入30L T1（2mM Tris）液，静置1 min后，12000g离心1 min。将1.5ml离心管（DNA）储存于-20C待用。DNA 模板（纯化后PCR 产物）2L（约20-50ng）；引物1L（3pmol/uL）；BigDye-DNA sequencing Kit 2L （PE ABI公司的BigDyeTM Termin
41、ator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer)）。反应总体积5L。96变性10 sec，50退火5 sec，60度延伸4min，循环25次，然后4保温。所有测序PCR均在PE9700热循环仪上进行。测序反应产物的纯化步骤如下：（1）测序反应结束后，据测序反应体系按照测序反应混合物：75%异丙醇=1：4的比例加入75%异丙醇，涡旋混匀，避光静置20min。（2）2750 g 离心30min，将96孔板倒置于吸水纸上，50g 离心1min。（3）据测序反应体系按照测序反应混合物：75%异丙醇=1：8的比例加入75%异丙醇，2750 g离心10min。（4）将96孔
42、板倒置于吸水纸上，50g离心1min。（5）加入25-30L去离子水溶解，瞬时离心，于ABI3700测序仪测序。反应在PCR扩增仪上经94预变性5 min后进行30个循环, 每个循环包括94 1 min, 56 1 min,72 1 min, 最后于72延伸7 min。PCR产物由美国ABI 公司3700 型全自动序列分析仪,进行双向测序,以确保DNA 序列的可靠性，并在导师的指导下，由本人对测序结果用DNAstar、DNAsp、Arlequin和MEGA等软件进行统计分析。2.4 数据分析 用Dnastar软件（ Dnastar ， Madison ， WI ，美国）对测得序列进行编辑、排序
43、比对。通过MEGA(molecular evolutionary genetics analysis, Kumar 等，1993)软件统计所测序列的碱基组成，计算不同个体间的遗传距离，并构建UPGMA系统树。用DNASP（DNA Sequences polymorphiwm）软件进行多态位点数（S）、核苷酸多样性（Pi）、平均核苷酸差异数（K）等遗传多样性参数的计算。3 结果3.1 单倍型及核苷酸多样度表3-1 白姑鱼群体的遗传多样性参数Tab. 3-1Parameter of genetic diversity of 4 populations of A. argentatus群体样本数量单
44、倍型数单倍型多样度平均核苷酸差异数核苷酸多样度有明海520.60060.17530.60000.56220.00150.0016广州520.60000.17531.20000.90850.0029 0.0026上海420.8333 0.22242.50001.68550.00600.0049青岛530.90000.16102.8000 1.76860.00680.0050总计1990.8480+0.00460.0125+0.01110.0111+1.9020表3-2 白姑鱼群体的单倍型分布频率Tab. 3-2Haplotype frequences of 4 populations of A.
45、 argentatus单倍型编号有明海广州上海青岛H10322H 20010H30010H40001H50001H 60001H73000H82000H 90200测序得到白姑鱼的cyt b基因片段长度为402bp，在19个样本鱼个体中总共检测到9种单倍型。各单倍型间的变异全部是转换或颠倒, 无插入和缺失。核苷酸多样度以中国青岛群体最高,为2.80001.7686，其它两个中国群体较低，最低的日本有明海群体则只有0.00150.0016。其中日本有明海样本含有单倍型H7和H8，而中国样本中则全部不含这两种单倍型；中国白姑鱼群体中的主要单倍型为单倍型1，此外广州群体还含有单倍型9，上海群体还含有
46、单倍型2和3，这说明在中国白姑鱼群体内的遗传分化也是存在的。群体内的遗传距离为-0.1022至-0.0424之间，群体间的遗传距离为0.8300至0.9063之间。青岛白姑鱼群体与上海白姑鱼群体之间的遗传距离为-0.0424, 上海白姑鱼群体与广州白姑鱼群体间的遗传距离为-0.1022, 而青岛和广州白姑鱼群体之间的遗传距离为-0.0870。中日白姑鱼群体的平均遗传距离为0.8638，提示群体间分化是总变异的主要来源。3.2 碱基组成经过MEGA3.0软件计算，四个群体内的碱基组成如下图所示。日本有明海群体中的C含量显著高于中国群体，青岛、广州、上海群体中碱基C的平均含量为34.23%，比日本
47、有明海群体中的碱基C含量少了近1%。青岛和广州群体的碱基含量最为接近，只有0.05%的差异，而上海群体的碱基组成则介于有明海和广州之间。从地理角度来看，中日白姑鱼群体的遗传分化程度也与碱基组成的百分比有一定关系。图3-1中日白姑鱼群体的碱基含量百分比Fig. 3-1 Base ratio in 4 populations of A. argentatus in China and Japan49.40%49.50%49.60%49.70%49.80%49.90%50.00%50.10%50.20%50.30%50.40%C+GA+T有明海广州上海青岛图3-2 中日白姑鱼群体的配对碱基含量百分比Fig. 3-2 Base pairing ratio in 4 populations of A. argentatus in China and Japan在所调查的四个群体中，碱基组成有着明显的区别。日本有明海群体的白姑鱼碱基组成中(A+T )含量最高，为50.27%, 大于(G+C )的含量49.73%，而白姑鱼群体的（A+T）平均值为49.9925% ，(G+C)含量平均值为50.0075%。（G+C）碱基含量最高的则是广州和青岛群体，均为50.12%。下图是各样本鱼基因的主要变异位点图。结果