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1、111学学 号：号：200824230120 HEBEI UNITED UNIVERSITY 毕毕 业业 论论文文 GRADUATE THESIS 设计题目：设计题目：蝴蝶兰组培快繁技术及褐变控制研究蝴蝶兰组培快繁技术及褐变控制研究 学生姓名：张长坤学生姓名：张长坤 专业班级：专业班级：08 药学一班药学一班 学学 院：冀唐学院院：冀唐学院 指导教师：翟丽指导教师：翟丽 教授 2012 年年 05 月月 29 日日 河北理工大学信息学院 - 摘 要 本研究以健康成株的蝴蝶兰花梗腋芽为外植体，采用单因素、二因素完全 随机试验设计获得蝴蝶兰无菌苗，筛选出丛生芽途径进行组织培养的各阶段的 最适培养基

2、；并且对外植体的褐变控制进行研究。研究结果如下： 1、蝴蝶兰诱导丛生芽快繁途径各阶段最适培养基 （1）中部腋芽为最佳部位，萌芽率为 80%。 （2）花梗腋芽诱导丛生芽的最适培养基为 1/2MS+6- BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L，诱导率达 80%，褐变率低。 2、对蝴蝶兰的褐变控制进行研究，结果如下： （1）对花梗腋芽进行 10d 黑暗预处理，褐变率降至为 40%。 （2）添加不同种类和浓度的抗褐变剂，均可降低褐变率，以添加 2g/L AC 效果最好，褐变率降至 30%，且不影响丛生芽的诱导。 关键词：蝴蝶兰；花梗腋芽；丛生芽；褐变；组培快繁 目 录 -I- Abstract In

3、 this study, Phalaenopsis culturing-plants induced by peduncle buds as explants from healthy and adulting plants were get in single and double factorsrandomized absolutely experiment designs, the best culture mediums in different stages were selected. The research which was on the peduncle buds cont

4、rol-browning were taken. The main results were as follows: 1、The better culture mediums of inducing tufty buds in different stages are: （1）The buds which is in the middle are the best explants，germination rate is 80%. （2）The best culture medium which induces tufty buds is 1/2MS+6- BA3.0mg/L +NAA0.2m

5、g/L，the inducing rate is 80%，the browning rate is lower. 2、The results of control-browning are as follows: （1）The darking pretreatment as long as 10 days can reduce browning rate to 40%. （2）Different kinds and concentration of Resist-brownings can reduce browning rate，2g/L AC is the best one，brownin

6、g rate is 30% and there is no bad influence to inducing PLB. Key words: Phalaenopsis; Peduncle buds; Bud clumps; Browning; Tissue culture of rapid propagation Abstract -II- 目 录 摘 要.I ABSTRACT II 第 1 章 引言1 1.2 蝴蝶兰产业的发展2 1.3 研究的目的和意义3 第 2 章 材料与方法4 2.1 材料.4 2.2 花梗腋芽诱导丛生芽的研究方法4 2.2.1 获取外植体.4 2.2.2 外植体的消

7、毒4 2.2.3 培养基及培养条件.4 2.2.4 取材部位对腋芽萌发的影响.5 2.2.5 基本培养基对腋芽萌发的影响.5 2.2.6 植物生长调节剂浓度和组合对腋芽诱导的影响.5 2.2.7 统计与分析.6 2.3 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究6 2.3.1 光学显微镜观察.6 2.3.2 黑暗预处理对褐变率的影响.7 2.3.3 抗褐变剂对褐变率的影响.7 2.3.4 统计方法.7 第 3 章 结果与分析8 3.1 花梗腋芽诱导丛生芽的研究8 3.1.1 取材部位对花梗腋芽萌发的影响.8 3.1.2 基本培养基对花梗腋芽诱导的影响.8 3.1.3 植物生长调节剂浓度及组合对花梗腋芽诱导率的

8、影响.9 3.2 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究10 3.2.1 细胞显微结构.10 3.2.2 黑暗预处理对褐变率的影响.11 3.2.3 抗褐变剂对褐变率的影响.11 第 4 章 讨论13 4.1 花梗腋芽诱导丛生芽的研究13 4.2 不同部位的外植体对花梗腋芽萌发的影响13 4.3 基本培养基对花梗腋芽诱导的影响13 4.4 植物生长调节剂对花梗腋芽诱导率的影响14 4.5 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究14 参考文献16 注 释18 谢 辞19 河北联合大学冀唐学院 -0- 第 1 章 引言 1.11.1 蝴蝶兰的形态特征和生物学特性 蝴蝶兰(Phalaenopsis spp)为兰科(Orch

9、idaeeae)蝴蝶兰属（Phalaenosis） ， 又称蝶兰，1825 年，德国的兰花分类学家布鲁梅(Mr.Blume)在柏林依据一个采 于 1750 年，由隆非(Mr.Rumph)在印度尼西亚搜集的热带兰干标本而创立了蝴蝶 兰属。由于其花在形态和结构上均与众不同，花外形具有娥蝶般的美丽，故以 拉丁字 Phalaina(蛾蝶)和 opsis(模样)组合成蝴蝶兰属(Phalanopsis)的学名， 意指其花外形似蛾蝶1。蝴蝶兰迄今已发现 70 多个原生种2（如 P.amabilis、P.corningiana、P.cornu-cervi、P.equestris 等等） ，中国产 4 种，大多

10、数分布在潮湿的亚洲地区，自然分布于阿隆姆、缅甸、印度洋各岛、 南洋群岛、菲律宾以至台湾。 蝴蝶兰花姿婀娜，花色高雅，在世界各国广为栽培。蝴蝶兰为附生兰，但 并非寄生植物，其附生物只不过是它的立足点，它们依靠吸取空气中的水分、 有机物以及树皮裂隙中的腐殖质生长。蝴蝶兰为单轴类兰花，茎短而肥厚，被 大片的椭圆形叶所遮盖，几乎无法明显的看出来。无假鳞茎，顶点为生长点， 在生长时期从顶部长出新叶片，下部老叶逐渐变枯黄脱落，叶绿色或间以深绿 色斑纹，肉质肥厚，叠套互生于短茎上；白色粗大的气生根从茎节处长出，圆 柱形或扁圆形，肉质，其根除了有吸收功能外，还具有伸长生长和光合作用的 能力。蝴蝶兰的花由三枚萼

11、片、两枚花瓣、一枚唇瓣和一个蕊柱组成。花瓣位 于花的左右，是花朵中观赏价值最高的部分，其次是三枚萼片，大部分的唇瓣 会裂成两条触角般的短须，从远处看，就像一群展翅飞翔的蝴蝶（见图 1-1） 。 图 1-1 蝴蝶兰花朵结构 第 1 章 引 言 -1- 花箭由叶腋间抽出，花朵由下至上依次开放，花色丰富，有纯白、粉红、 紫红、黄、绿、黄色带赤斑纹、白色红唇、白色红条纹等，不少品种还兼备双 色或三色，有的好像绣上图案的条纹，有的又犹如喷了均匀的彩点。每枝开花 七八朵，多的十二、三朵，可连续观赏六七十天，因此很能抓住人们的目光， 向来是花群中的主角与耀眼明星，它与卡特兰、万代兰、石斛兰并称为四大观 赏兰

12、3，素有“兰花皇后”之美称4。 蝴蝶兰杂交品种很多，经过官方认证的品种已达 10 多万个5，在生产中广 泛使用。 蝴蝶兰可以进行有性繁殖，但由于其种子细小，不含有为种子萌发提供营 养的胚乳或其他组织，在自然条件下很难萌发6，且必须依赖于共生细菌7。 利用组织培养的方法，采用花梗腋芽作为外植体，在适宜的培养基上，可诱导 出丛生芽 8。丛生芽在适宜的培养基上经过诱导、分化，也可以分化出叶，形 成小苗即分生苗。分生苗变异率低，稳定遗传了母株的特征特性，繁殖速度快， 满足市场的需求。 1.2 蝴蝶兰产业的发展 我国台湾地区地处亚热带，是蝴蝶兰野生种分布的最北界线，年均温 22.5，属高温多湿气候，冷凉

13、的冬季温度有利于花芽分化、抽梗、开花，比 其它热带或寒带国家，节省许多费用，降低成本，在环境地利上可说得天独厚， 形成台湾春天蝴蝶兰满园盛开的特有景观，李建华称台湾是“蝴蝶兰的故乡” 9。80 年代末，台湾有关人士就意识到，台湾具有丰富的蝴蝶兰资源及良好的 生长环境，90 年代初，蝴蝶兰的高经济价值促使台湾将蝴蝶兰列为多元化发展 的一个重要项目。此后，无菌播种、工厂化组培苗移栽、温室管理的自动化等 技术的发展和完善，使蝴蝶兰在 20 世纪末的最后 10 年，发展成了大面积企业 栽培的产业。蝴蝶兰也是目前台湾兰花类中产量最多、价格最高的花卉项目。 全世界约有 70 多个原生种，两个原生种分布在台

14、湾，即分布于恒春 9 半岛、台 东和兰屿的白花蝴蝶兰和分布在小兰屿的桃红花姬蝴蝶兰，之后台湾又收录了 43 个原生种，所以台湾有着丰富的蝴蝶兰种原。 台湾产的蝴蝶兰主要外销市场在日本、欧美、韩国、中国大陆及东南亚等 地。1997 年台湾出口蝴蝶兰苗 1290 吨，成株约 243 吨，切花近 6 吨，创收约 11 亿新台币9；1998 年，生产蝴蝶兰组培苗达到 7000 万株，其中较大批量的 企业是台湾最大的蝴蝶兰企业台湾糖业股份有限公司，电脑自动化控制温 室面积就达 10 万 m2，全年度的外销以日本为主要出口国，外销量为 46%，美国 市场约占 28%，韩国市场占 12%，我国大陆市场占 1

15、0%，其它市场占 4%10，台 河北联合大学冀唐学院 -2- 湾用 20 年的时间，已成为国际蝴蝶兰市场的龙头老大，基本占据了蝴蝶兰市场。 上世纪 80 年代，大陆不少研究单位就已经引进热带兰进行深入研究，并取 得一定成果。但是因产量有限，售价很高，在中国年宵花卉市场上市量只有 5 万盆，没有推广开来。90 年代，随着国际经济的复苏，许多经济活动逐渐热络， 韩国、日本以及台湾地区的外资企业进入大陆，为我国带来了信息、品种、技 术等资讯，商品化生产才得以形成。大陆本土的兰花企业也逐渐建立起自己的 生产基地，范围相当广泛，北至吉林长春，南到海南岛海口，东至山东烟台， 西至甘肃兰州，以经济强省为主，

16、以发达城市为依托，蝴蝶兰产业迅速发展， 被认定为农业生物技术之明星产业。 蝴蝶兰产业在中国的兴起不过十年，但是作为花卉业中的一个新兴类别， 蝴蝶兰一直受到中国花卉市场的喜爱。目前尽管蝴蝶兰的价格有所下降，但在 农业项目中，与其他花卉相比，利润还是比较可观的，蝴蝶兰市场仍然比较乐 观。 1.3 研究的目的和意义 当前生产中采用的蝴蝶兰品种大多为杂交种，利用种子繁殖子代的性状分 离十分严重，不能建立规格一致的商品苗；蝴蝶兰又是单茎性气生兰，植株上 很少发育侧枝，比其它种类的兰花更难进行常规无性繁殖。植物组织培养是建 立蝴蝶兰快速繁殖无性系的重要手段。 相对于蝴蝶兰的利润，蝴蝶兰的投资不大。如建设一

17、个 200m2的大棚，可 投放 4000 盆蝴蝶兰，按 85%的成活率，每盆售价 30 元计算，毛收入可达 10.2 万元，扣除种苗、建设大棚及化肥、农药、人工等费用（约 7 万元） ，则纯收入 可达 3 万多元11，用组织培养技术繁殖蝴蝶兰具有速度快、成本低，能在短期 内繁殖大量种苗并能同时完成脱毒等优点，对合理开发利用这一资源，满足消 费市场对蝴蝶兰的大量需求，发展河北省花卉经济具有重要的现实意义，所以 蝴蝶兰是一项高回报的产业。 唐山依靠丰富的矿产资源，GDP 在全国排名第 18 位，在河北省排第 1 位， 收入水平较高。而且唐山市通过创建文明城市活动，人们的生活水平和消费水 平得到了进

18、一步的提高，除了对衣食住行提出了更高的要求，对花卉的要求也 趋向于高档化、精品化，所以蝴蝶兰在唐山具有广阔的消费空间。 基于国内外研究存在着不同甚至相互矛盾的结论、蝴蝶兰因品种、外植体 不同对培养基的要求不同、蝴蝶兰在我省尤其是唐山市具有很大的发展潜力等 原因，本课题在前人研究的基础上，研究基本培养基、取材部位、激素浓度及 第 1 章 引 言 -3- 组合对蝴蝶兰诱导丛生芽的影响，筛选出适宜的培养基，为蝴蝶兰的组培快繁 技术提供理论依据和技术指导。 河北联合大学冀唐学院 -4- 第 2 章 材料与方法 2.1 材料 试验选用市场上流行的蝴蝶兰品种“熊猫”为实验材料 2.2 花梗腋芽诱导丛生芽的

19、研究方法 2.2.1 获取外植体 从市场上购买生长状况良好、未开花的成株，用干净的剪刀剪下花梗，分 段，每段中间位置留一个腋芽，芽上下各留 3cm 长的节段，用洗衣粉水浸泡 2030min，清洗后放置于自来水下冲洗 2030min，然后进行灭菌处理。 2.2.2 外植体的消毒 将冲洗好的花梗腋芽放置于烧杯中，拿到超净台上，用 75%的酒精进行表 面消毒 30s，无菌水冲洗 3 次，再用 0.1%HgCl2溶液浸泡 15min，期间不断地用 玻璃棒搅动，使其消毒彻底，然后用无菌水冲洗 56 次。用镊子将花梗芽夹到 铺有滤纸的培养皿中，剥掉苞叶，并将花梗段的两端各切去 0.5cm，使其长度 为 2

20、cm 左右，花梗基部剪成斜面，接种到固体培养基中。 2.2.3 培养基及培养条件 1、MS 培养基（附加蔗糖 20g/L，琼脂 10g/L，活性炭 2g/L，PH=5.6，以下 同） 2、1/2MS 培养基（MS 大量元素减半） 3、1/4MS 培养基（MS 大量元素减为 1/4） 4、VW 培养基培养基按常规方法配置12，分装到 100ml 的培养瓶中（预先 在 121饱和蒸汽压下灭菌 40min） ，每瓶 30ml 左右，所有培养基均在 115饱 和蒸汽压下灭菌 15min。待高压灭菌锅压力归零后，拿出培养基，轻轻摇晃， 使活性炭混合均匀，冷却后备用。培养环境温度维持在 251，光照 15

21、00lx2000lx，湿度 80%左右，每日光照 16h。 2.2.4 取材部位对腋芽萌发的影响 取材部位设 3 个处理： 第 2 章 材料与方法 -5- A1：花梗上部腋芽； A2：花梗中部腋芽； A3: 花梗下部腋芽 花梗按上、中、下部位接种于诱导花梗腋芽的培养基上，每瓶接 2 段， 每处理接种 5 瓶，共 10 个腋芽，3 次重复。分别在 15d、30d、45d 观察诱 导情况，再对实验数据进行分析，从不同取材部位的外植体对花梗腋芽诱导培 养的差异中筛选出较优外植体。 2.2.5 基本培养基对腋芽萌发的影响 将中部腋芽接种于培养基上。基本培养基设 3 个处理： B1：MS 培养基 B2：

22、1/2MS 培养基 B3：1/4MS 培养基 B4：VW 培养基 分别附加 6-BA3.0mg/L，蔗糖 20g/L，琼脂 10g/L，活性炭 2g/L， 每瓶接 2 段，每处理接种 5 瓶，共 10 个腋芽，3 次重复。分别在接种 后 15d、30d、45d 统计花梗诱导率，再对实验数据进行分析，从不同基本培养 基对花梗腋芽诱导培养的差异中筛选出较优基本培养基。 2.2.6 植物生长调节剂浓度和组合对腋芽诱导的影响 将消过毒的中部腋芽在超净工作台上接种于培养基上，采用 1/2MS+蔗糖 20g/L+琼脂 10g/L+活性炭 2g/L+植物生长调节剂组合。采用两因素完全随机试 验设计，2 个因

23、素分别是 6-BA、NAA，6-BA 设 5 个浓度，依次为 0、1.0、3.0、5.0、7.0mg/L，NAA 有 2 个浓度，为 0、0.2mg/L；6-BA 浓度 为 3.0mg/L，研究 NAA 的最佳浓度，采用单因素完全随机试验设计，NAA 设四 个浓度，依次为 0.1、0.2、0.3、0.4mg/L。每瓶 2 个，每个处理接种 5 瓶， 共 10 个腋芽，3 次重复。50d 后统计花梗诱导率，再对实验数据进行分析， 从植物生长调节剂浓度及组合对花梗腋芽诱导培养的差异中筛选出较优浓度及 组合。 表 2-1 植物生长调节剂浓度及组合对花梗腋芽诱导的影响 处理 6- BA（mg/L） N

24、AA(mg/L) 接种数 （个） 活性炭 （g/L） C100102 C21.00102 C33.00102 C45.00102 河北联合大学冀唐学院 -6- C57.00102 C600.2102 C71.00.2102 C83.00.2102 C95.00.2102 C107.00.2102 表 2-2 NAA 对花梗腋芽诱导的影响 处理6-BA（mg/L） NAA(mg/L) 接种数（个）活性炭（g/L） C3.00.1102 C3.00.2102 C3.00.3102 C3.00.4102 2.2.7 统计与分析 统计方法：萌芽率=（萌芽的花梗腋芽数/接入花梗腋芽数）100% 诱导率=

25、（诱导出丛生芽的花梗数量/接入花梗腋芽数）100% 平均出芽数=（诱导出的丛生芽数/接入花梗腋芽数）100% 2.3 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究 2.3.1 光学显微镜观察 取蝴蝶兰新鲜花梗和培养 15d 已经褐化的外植体，用锋利的刀片薄薄的切 一小段，立即放于载玻片上，用光学显微镜进行结构观察，记录并拍照。 2.3.2 黑暗预处理对褐变率的影响 将刚接种完毕的花梗腋芽进行黑暗预处理，预处理设置 4 个处理：5d 黑 暗预处理、10d 黑暗预处理、15d 黑暗预处理和 CK（无黑暗预处理） 。4 个处 理均在人工智能培养箱中进行培养，温度为 251，湿度 80%左右，CK 光照 为 1800L

26、x，每天光照 12h。30d 后统计褐变率，再对实验数据进行分析，从不 第 2 章 材料与方法 -7- 同时间黑暗预处理对褐变率的影响差异中筛选出较优暗处理时间。 2.3.3 抗褐变剂对褐变率的影响 在培养基中加入抗褐变剂，活性炭（AC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP） ，试验 设计见表 2-3，30d 后统计褐变率，再对实验数据进行分析，从不同抗褐变剂 对褐变率的影响差异中筛选出较优抗褐化剂。 表 2-3 抗褐变剂对褐变的影响的试验设计 处理抗褐变率种类浓度 A1AC1.0 A2AC2.0 A3AC3.0 B1PVP1.0 B2PVP2.0 B3PVP3.0 2.3.4 统计方法 褐变率 =（发生

27、褐变的外植体数/接种总外植体数）100% 河北联合大学冀唐学院 -8- 第 3 章 结果与分析 3.1 花梗腋芽诱导丛生芽的研究 3.1.1 取材部位对花梗腋芽萌发的影响 由表 3-1 可知，不同取材部位对花梗腋芽萌芽率影响很大。培养 15d 时， 中部腋芽的萌芽率略高于上部腋芽，未达到显著差异，但显著高于下部腋芽萌 芽率，上部腋芽萌芽率略高于下部腋芽，未达到显著差异；培养 30d 后，中部 腋芽萌芽率显著高于其它两个部位的萌芽率，上部腋芽萌芽显著高于下部腋芽， 均达到显著差异。 从表 3-1 可以看出，中部腋芽萌芽时启动最快，并且一直遥遥领先，45d 后萌芽率也最高，为 80%。从总体上看，

28、不同部位的萌芽率比较：中部腋芽 上部腋芽下部腋芽。这也许与不同部位的腋芽生长发育情况有关，未开花花 梗下部生长势最弱，萌发率低，上部腋芽虽然由于顶端优势，营养较丰富，但 发育未成熟，萌发率居中；中部腋芽分化较为成熟，生长势强，萌发率最高。 表 3-1 取材部位对花梗腋芽萌芽的影响 萌芽率 处理 15d30d45d A1：上部腋 芽 30%40%60% A2：中部腋 芽 40%60%80% A3：下部腋 芽 20%30%40% 3.1.2 基本培养基对花梗腋芽诱导的影响 许多植物的花梗腋芽是休眠的花芽，将带有腋芽的花梗茎段接种在适宜的 人工培养基上，在外源激素的诱导下可以转化为营养芽，进一步发育

29、成为一个 新的小植株13。 第 3 章 结果与分析 -9- 表 3-2 基本培养基对花梗腋芽诱导的影响 不同的培养基所含盐分种类和浓度不同。B1、B2、B3 3 种培养基盐分种类 相同，浓度依次减半，VW 培养基与 MS 培养基相比，盐分种类和浓度均不同。 将花梗置于不同的培养基后，发现 B2 处理花梗腋芽启动快，15d 时变可看到腋 芽膨大，在 B2 培养基上培养，诱导率最高，为 80%，丛生芽生长情况良好。 其次为 B3，花梗腋芽启动较快，诱导率较高，为 60%，丛生芽生长状况一般。 培养 15d 时，花梗在 B1 培养基上诱导率略高于 B4，培养 45d 后，B1 上的诱 导率明显高于

30、B4，丛生芽在两种培养基上的生长状况均不良好。结果表明，蝴 蝶兰花梗腋芽诱导的较优基本培养基为 B2 培养基即 1/2MS 培养基，长势良好。 3.1.3 植物生长调节剂浓度及组合对花梗腋芽诱导率的影响 本试验观察结果表明，植物生长调节剂浓度及组合对蝴蝶兰的花梗腋芽诱 导培养有很大的影响。由表 3-3 知，C8 诱导率均显著的高于其它各个处理， 诱导率为 80%，其次为 C9 处理，高于 C3、C4、C7，但并未达到显著水平。 表 3-3 植物生长调节剂浓度及组合对花梗芽诱导的影响 处理接种数诱导率 C1:1/2MS1010% C2:1/2MS+6-BA1.0mg/L1030% C3:1/2M

31、S+6-BA3.0mg/L 1060% C4:1/2MS+6-BA5.0mg/L1040% 诱导率 处理接种数 15d30d45d 丛生芽生长状况 B11020%40%50% 花梗褐变严重，诱导率低 B21040%60%80% 腋芽启动早，诱导率高 B31030%50%60% 诱导率一般，生长一般 B41010%20%30% 诱导率低，腋芽小 河北联合大学冀唐学院 -10- C5:1/2MS+6-BA7.0mg/L1020% C6:1/2MS+NAA0.2mg/L1010% C7:1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L1040% C8:1/2MS+6-BA3.0mg/L+NA

32、A0.2mg/L 1080% C9:1/2MS+6-BA5.0mg/L+NAA0.2mg/L1070% C10:1/2MS+6-BA7.0mg/L+NAA0.2mg/L1030% 表 3-4 NAA 对花梗腋芽诱导的影响 处理接种数 （个） 诱导率 C: 1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L1060% C: 1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L1080% C: 1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.3mg/L1070% C: 1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.4mg/L1050% 由表 3-4 知，诱导率随着 NAA 浓度的增加先升高

33、后降低，处理 C诱导 率最高，与 C、达到显著差异；处理诱导率次之，虽未显著低于 C，但从诱导率考虑，处理 C即 C8 处理：6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L 的植 物生长调节剂组合为最佳组合，诱导率最高，为 80%。 3.2 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究 3.2.1 细胞显微结构 对蝴蝶兰新鲜的和褐变的外植体进行了细胞结构的观察，通过光学显微镜 观察外植体在褐变前后发生的变化。从图 3-5 可以看出，新鲜外植体（图 3- 5）的细胞结构完整，细胞饱满，胞内无有毒物质的积累，而且细胞颜色为绿色； 而发生褐变的外植体（图 3-5-2）细胞结构被破坏，细胞壁有明显的皱缩，有 的地方断裂比

34、较明显，细胞中有大量的黑色颗粒状物质，而且细胞明显失绿， 呈现黄色。 第 3 章 结果与分析 -11- 图 3-5 新鲜外植体和褐变外植体显微结构 1：新鲜外植体的显微结构 2：褐变外植体的显微结构 3.2.2 黑暗预处理对褐变率的影响 由表 3-6 可以很明显的看出，进行黑暗预处理，可以有效的降低外植体的 褐变率，15d 黑暗预处理培养褐变率最低，为 40%，15d 黑暗预处理培养褐变 率次之，为 50%，所以，黑暗预处理 10d 为最佳时间。 表 3-6 黑暗预处理对褐变率的影响 处理接种数（个）褐变率 CK1070% 5d1060% 10d1040% 15d1050% 3.2.3 抗褐变

35、剂对褐变率的影响 培养基中添加一定量的 AC、PVP 抗褐变剂能比较明显地抑制褐变，降低褐 变率，对外植体褐变率影响极显著（见表 3-7） 。 抗褐变剂种类不同，其效果也不同。在本试验中，AC 对于防止外植体褐变 效果最好，能推迟分泌物出现的时间 ，培养基变色部分的直径也变小 ，最终 降低了外植体的褐变率。添加 2mg/L 时褐变率最低，为 30%。 河北联合大学冀唐学院 -12- 表 3-7 抗褐变剂对褐变率的影响 处理接种数（个）褐变率 A11060% A21030% A31040% B11060% B21050% 第 3 章 结果与分析 -13- 第第 4 4 章章 讨论讨论 4.1 花

36、梗腋芽诱导丛生芽的研究 蝴蝶兰只有 1 个茎尖，如直接从开花植株取得茎尖或茎段，就会牺牲植株， 以花梗侧芽为外植体，不会牺牲母株，消毒容易，是较合适的部位，比茎尖、 根尖等更具有应用价值。 4.2 不同部位的外植体对花梗腋芽萌发的影响 蝴蝶兰的花梗通常有 45 个腋芽，在进行离体培养时不同位置的腋芽培 养结果有较大的差异，据资料显示，上部腋芽萌发率中部腋芽萌发率下部 腋芽萌发率，具有明显的顶端优势。刘翠兰14等人认为，除最基部第一节外， 都是花梗腋芽组织培养的好材料，而邵双、关丽杰15认为花梗第一、二节为营 养芽，第三、四节为花芽，营养芽的诱导率大于花芽的诱导率。本试验结果为： 中部侧芽萌发率

37、上部侧芽萌发率下部萌发率。这可能与花梗不同位置侧芽 的发育程度有关，下部腋芽可能与其处于休眠状态有关，上部腋芽可能因为发 育较早，已经或部分实现了花芽分化。而且用肉眼观察花梗基部侧芽的体积明 显比中、上部小，进一步进行花梗侧芽形态学的观察可能有助于解释这种现象。 4.3 基本培养基对花梗腋芽诱导的影响 在离体培养条件下，不同植物的组织或器官对营养的要求不同，甚至同一 种植物的不同部位组织、同一部位不同生长阶段对营养的要求也不相同，只有 满足它们各自的特殊要求，才能正常生长。 李浚明16指出：在建立一个新的实验材料体系时，为了能够研制出一种适 合的培养基，最好先由一种已被采用的基本培养基作为试验

38、培养基开始。当通 过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能 河北联合大学冀唐学院 -14- 得到一种能满足实验需要的新培养基。程广有17也认为要想对基本培养基加以 改进的话，最好首先降低 MS 培养基的各元素用量，其次，可以选择在配料成 分上与 MS 培养基有显著不同的其他培养基加以试用对比。 MS 培养基所含营养成分较全面，但浓度较高，花梗腋芽在此培养基上褐变 较严重；在 1/4MS 上培养时，前期诱导率仅次于 1/2MS，居第二；但在后期时， 诱导率低于 1/2MS 大约 20 个百分点。这可能是由于后期培养过程中，1/4MS 培养基营养成分用尽无法满足花梗腋芽

39、的诱导导致诱导率偏低。VW 培养基显著 不同于 MS 培养基，不适于花梗腋芽的诱导。 4.4 植物生长调节剂对花梗腋芽诱导率的影响 基本培养基只能保证培养物的生存与最低生理活动，只有配合使用适当的 激素才能更好的诱导细胞分裂、愈伤组织生长、根、芽、茎的分化等。 植物生长调节剂是指一些对植物生长发育及生理活动有特殊作用的生理活 性物质。这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用，主要有生长素 和分裂素。 生长素的作用主要是诱导愈伤组织的形成和根的形成，促进细胞脱分化， 常用的有 NAA（萘乙酸） 、IAA（吲哚乙酸） 、IBA（吲哚丁酸）等。细胞分裂素 的作用主要是打破顶端优势，促进丛生芽的

40、形成和增殖，抑制根的生长，常用 的有 6-BA、玉米素等。 在植物的组织培养中，只有当植物生长调节剂的种类、浓度合适时，才能 诱导出最佳效果。鲁雪华等人18认为花梗腋芽使用 6- BA3.05.0mg/L+NAA0.10.3mg/L 浓度及组合诱导效果最佳，秦凡，周吉源19认 为蝴蝶兰花梗芽萌发梗在 6-BA 浓度为 3.0mg/L 时效果最好，诱导率达到 79.20%，本试验研究结果与此相同，诱导率为 80%。 4.5 蝴蝶兰外植体褐变控制的研究 针对植物组织培养过程中普遍发生的褐变现象，人们利用不同植物材料从 不同角度进行了大量的研究2021，以探明褐变发生的机理，为控制褐变奠定 理论基础

41、。同时，以此为基础，在寻求切实有效的抗褐变方法的道路上进行着 不懈的努力，并取得一定的成果。本试验在前人的基础上结合实际情况，研究 出了控制蝴蝶兰叶片褐变的方法。 光能提高酶的活性，促进多种植物组培中酚的氧化。对于易褐变的蝴蝶兰 叶片，初期培养时在黑暗下培养 10d，并保持较低的温度，可以降低酶的活性， 第 4 章 讨 论 -15- 防止酚类物质氧化，进而减轻褐变的产生。 培养基中加入抗褐变剂可以有效的防止褐变，这一观点已被大多数人认同 2223，它们抗褐化机理各有不同。 吸附剂的主要作用在于通过氢键、范德华力等吸附力把有毒物质从外植体 周围吸附掉。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，但是活性

42、炭的吸附没有 选择性，吸附毒酚类物质的同时也吸附培养基中的生长调节剂，卜学贤等24研 究表明每毫克 AC 大约能吸附 100g 左右的生长调节物质。试验中在 3g/L 的活性炭中生长的外植体长势变弱，大概就是因为活性炭吸附了大量的营养物 质所致，门福义25认为活性炭的吸附能力是由其表面积决定，而不是由它在培 养基中的含量决定，李琳也认为26活性炭的吸附作用情况较复杂，活性炭的吸 附原理还待于进一步研究。PVP 是酚类物质的专一吸附剂，生化分离制备中常 用作酚类物质和细胞器的保护剂，被许多学者用于防止褐变2728。然而，有 的学者通过试验证明 PVP 没有普遍防止褐变的效果，因为植物体内存在着不

43、同 的酚类物质，PVP 也存在着不同分子量的类型29。在本试验中，PVP 没有达到 预想的抗褐变效果，也许是因为蝴蝶兰种类不同，产生的酚类物质也不同。 在植物组织培养中，抗褐变剂并没有统一的规定，常因外植体不同，所选 用的抗褐变剂种类和浓度不同，应根据实际情况而定。 以上这些处理措施，都是治标而非治本。应该对蝴蝶兰褐变产生的原因、 生理生化方面以及遗传等方面进行更广泛的研究，才能从根本上根除蝴蝶兰组 织培养中产生的褐变有毒物。此外，不论采取什么措施，都应该既要保证预防 褐变发生的效果良好，又要考虑经济实用性，还不能与外植体生长相矛盾，否 则，褐变的控制就失去了意义。 河北联合大学冀唐学院 -1

44、6- 参 考 文 献 -17- 参考文献 1 胡松华热带兰花M2002，3（1）：中国林业出版社：45 2 胡松华蝴蝶兰品种栽培鉴赏M广州:广东科技出版社，1996 3 黄胜琴，郭建军，叶庆生，等温度对蝴蝶兰成花诱导的研究初探 J中山大学学报（自然科学版） ，2003，42（4）：132134 4 谭文澄，戴策刚观赏植物组织培养技术M北京：中国林业出版社， 1991，247253 5 陈宇勒洋兰欣赏与栽培图说M北京：金盾出版社， 2004，140144 6 卢思聪兰花栽培入门M北京：金盾出版社，1990，9 7 蔡平里图解兰花繁殖最新技术M台湾：淑馨出版社.1996，28 8 傅连芳蝶兰的快速

45、繁殖J热带作物研究，1990（2）：24 9 李建华台湾蝴蝶兰产业发展初探与启示J台湾农业探索， 2001（1）：1518 10 陆銮眉，张汉荣海峡两岸蝴蝶兰产业发展现状与合作前景J福 建热作科技，2004，29（1）：3941 11 马源蝴蝶兰市场俏销J资源开发与市场，2003，19（4）：249 12 曹孜义，刘国民实用植物组织培养技术教程M兰州：甘肃科学 技术出版社，1996，9597 13 Bhattarcharjee S,et alEffect of growth regulating substance on in vitro seed germination of Phalaen

46、opsis HybridJIndian Agriculturist,1999,43(1/2)：7983 14 刘翠兰，王小芳，李双云，等蝴蝶兰花梗芽的组织培养J山东 林业科技，2004，153（4）：37 15 邵双，关丽杰蝴蝶兰花梗腋芽诱导的影响因素J沈阳化工学院 学报，2005，19（2）：8486 16 李浚明植物组织培养M中国农业大学出版社，2002：29 17 程广有名优花卉组织培养技术M科学技术文献出版社，2003：63 18 鲁雪华，郭文杰，徐立晖，等蝴蝶兰花梗节间段培养繁殖的初步研 究J园艺学报，2002，29（5）：491492 19 秦凡，周吉源不同植物生长调节剂对蝴蝶兰快

47、速繁殖的影响 J武汉植物学研究，2003，21（5）：452456 20 顾之中水稻愈伤组织发生褐化的影响因素研究J江西农业大学 参 考 文 献 -18- 学报，1992，14：206211 21 宋平，沈丙辉活性炭培养基对棉花愈伤组织诱导的效果J植物 生理学通讯，1988（5）：4748 22 范志强，杜希华，褰兆忠，等辣椒组织培养中褐变问题的研究 J山东农业科学，2000， （6）：3536 23 张妙霞，孔祥生，郭秀璞柿树组织培养防止外植体褐变的研究 J河南农业大学学报，1999，33（1）：8791 24 卜学贤，陈维伦活性炭对培养基中植物生长调节物质的吸附作用 J植物生理学报， 19

48、88 ， 14(4) :401405 25 门福义马铃薯的贮存物质J马铃薯杂志，1983（1）：6 26 李琳活性炭在库拉索芦荟的组织培养中的应用J西南农业学报， 2005，18（1）：105107 27 韦鹏霄，覃伟，岑秀芬，等不同抗氧化剂预处理防止优质籼稻种胚 愈伤组织褐化的研究J广西农业生物科学，2005，24（2）：109112 28 夏小环，王静，尹梅，等非洲菊叶外植体组培中影响褐化因素及机理 初探J西南农业学报，2006，19（1）：136138 29 Ichihashi S, Kako S. Studies on clonal propagation of cattleya through tissue culture methedJ. Browning of cattleya. JJap Soc.Hort.Sci.1977,46：325330 谢 辞 -19- 注 释 缩略词英文中文 cmcentimeter 厘米 dday(s) 天 ggram(s) 克 hhour(s) 小时 mgmilligram 毫克 mlmilliliter 毫升 minminute 分 Lliter 升 lxlux 勒克斯（照度单位） 6-BA6-benzyladenine 6-苄基腺嘌呤 NAA-naphthaleneacetic acid -吲哚乙酸 MSMu