二蛇伤的免疫学诊断.doc

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1、（二） 蛇伤的免疫学诊断李云龙教授在研究新的蛇伤免疫学快速诊断方法 蛇伤的诊断，目前国内外普遍是根据咬伤时临床症状或捕获的蛇来确诊，但由于大多数的蛇伤是在晚间或山林草地中发生的，有时看不到蛇或看不清蛇种。据国内外统计，只有20%左右的蛇伤病人能确定蛇种1。这样只能根据被咬的牙痕、局部体征以及常规化验等进行诊断。但在蛇伤早期，临床症状往往不明显、不典型，所以很难确诊，以至延误病人的治疗，失去及时抢救的良机。因此，必须寻求一种快速、准确、敏感、简便的蛇伤化验诊断方法。1蛇伤的免疫学诊断研究进展多年来，免疫学家们根据抗原抗体反应的原理，应用免疫学技术检测病人标本中各种毒蛇的种特异性蛇毒成分，进行致伤

2、蛇种的各种免疫学诊断方法的研究随着现代免疫学技术的不断发展，蛇伤免疫诊断的迫切性，今天已成为可能性。并在技术上逐渐取得了重大的进展和突破，早在五十年代末就有人提出这个问题。但是它的主要研究进展还是在上世纪和八十年代后。蛇伤的免疫诊断发展大致可分成3个阶段。 （1）免疫学诊断的出现期 1957年Muelling等2应用环状沉淀反应及双向琼脂扩散法论证了一个被眼镜蛇咬伤8h的17岁女孩组织中的眼镜蛇毒，首先提出了蛇伤的免疫诊断问题Trethewie等3于1969年报告了他们成功地用凝胶免疫扩散法从豚鼠咬伤部位的盐水浸出液中检出了虎蛇毒和蝮蛇（Adder）毒。1974年Greenwood等4应用免疫

3、扩散和对流免疫电泳等法检测蛇伤中毒病人伤口吸出液、水泡液、血清和尿液中蛇毒的种特异性成分，进行蛇伤的致伤蛇种免疫诊断的研究。在101例蛇毒中毒的病人(75例已见蛇种，26例蛇伤不明)免疫扩散的检查中，40例被捡出(检出率约40)。特别是膨身蛇(Puff)。黑颈眼镜蛇(Naja Nigricollis)即非洲喷唾沫眼镜蛇(Africum spitting cobra)的咬伤的诊断特别成功(全部检出)。其中伤口吸出液的检出率为2774，水泡液为913，血清为084,浓缩尿为1976。在不明蛇种的26例中也检出11例(其中眼镜蛇伤7例，膨身蛇伤2例，蝰蛇伤2例)并对44例阳性标本用对流免疫电泳法5复

4、查，结果40例仍为阳性。并且多数可在30min内得出结果。因此，他们正式提出了蛇伤免疫诊断的可能性。并认为对流免疫电泳法有希望作为蛇伤快速诊断的常规方法。至此，蛇伤的免疫学诊断才真正问世。引起了各国学者们的重视和研究。李云龙等也曾用此法检测过实验性蛇伤动物6和79例早期蛇伤病人的咬伤局部吸出液,获得了较为满意的结果7。但是，此法的敏感度不够理想，阳性检出率受检材的种类、取材的时间、方法、诊断抗体的质量等因素影响较大，所以要通过更特异的抗体和应用更敏感的免疫检测方法，才能解决蛇伤的免疫诊断问题。 (2)蛇伤免疫诊断敏感度的发展期七十年代初，由于免疫学技术的水平限制，使免疫诊断在蛇伤中的应用受到了

5、影响。为了提高蛇伤免疫诊断的敏感度，必须采用高敏感的免疫检测方法，才能使蛇伤的免疫诊断得到提高。因此，免疫诊断提出后，当时相继就出现了血凝、放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等敏感度较高的方法用于蛇伤的诊断。1968年，Boche和Russell8应用a-重氮联苯胺法将响尾蛇（C.Viridis heller）毒致敏绵羊红细胞进行被动血凝试验和血凝抑制试验测定高稀释度的蛇毒抗体和蛇毒抗原，敏感度比对流免疫电泳高的多。但此法结合物不稳定，滴定终点不清楚，试剂必须保存于冷处等缺点。1974年Greenwood等又应用双抗体法放射免疫测定（RIA）进行蛇伤的诊断9，测出了毫微克量

6、级(1ngml)的毒蛇，大大提高了检测的敏感度，但此法易发生非特异性反应和正常血清的抑制现象。另一个缺点是检出时间太长(2448小时)。得不到快速诊断的目的。后来Coulter等（1974）10Sutherland等（1975）11又应用固相夹心法放射免疫测定对蛇伤病的蛇毒人的血清，尿液，组织液中的检测研究。不仅敏感度高，还可作蛇毒的定性定量分析。而且缩短了检测时间(十几小时可得出结果)。随后，Pukrittayakammee等12用McAb Mp2作竞争RIA测定蛇伤病人体液中的蝰蛇（Daboia russelli）毒。其敏感度：尿：4ng/ml，血清：5g/ml。但在不同蛇毒之间有交叉反应

7、。从此使蛇伤的免疫诊断进入了高敏感度水平，大大扩大了该免疫诊断的应用范围。 放射免疫测定的缺点是：设备昂贵，试剂对人体有害，检测时间仍较长，还不能适应快速诊断的要求，也不易普及。也不能在野外现场使用。为了探索另一种高敏感度方法。1977年，Theakston等13以双抗体夹心法酶联接免疫吸附测定(ELISA)进行实验动物和蛇伤病人的蛇毒和蛇毒抗体的定性定量的研究，其敏感度达到了RIA的水平，从实验动物血清中可测定15ng/ml的蛇毒，而设备和方法比RIA简单，检测时间也缩短到81 0小时。此法基本原理和程序： 检测蛇毒 特异性蛇毒Ig包盖聚苯乙酰平板孔，37，5小时，水洗孔中加被测血清(含蛇毒

8、)，4过夜、水洗。 加碱性磷酸酶(或辣根过氧化物酶)标记的蛇毒IgG 37，孵育4小时，水洗。加底物，作用2060分钟，用碱终止反应。比色。检测蛇毒抗体.应用间接法、用蛇毒包盖平板孔，酶抗体是酶同抗人Ig（如测兔抗体则同抗免Ig结合物），其他过程基本同上。由于这一时期一些高敏感免疫检测技术的出现使蛇伤诊断的敏感度得到很大的提高，成为蛇伤免疫学诊断的一个转折点。但是，这些方法的时间还较长，或易出现交叉反应。还不能适应农村和野外现场使用。 （3）蛇伤免疫诊断的高敏感度、快速、简便发展阶段从上世纪八、九十年代以来，由于免疫学和免疫学技术不断发展，蛇伤的蛇种免疫学检测技术已发展了多种方法，主要适用的有

9、放射免疫测定、凝集反应、酶联免疫吸附测定和荧光免疫测定等。这些技术皆具有一定的敏感度，一般可达到10-710-9g/ml，其中ELISA可达到微微克（Pg）量级水平。由于蛇毒McAb和亲和纯化特异性蛇毒抗体等的应用和方法的改进使某些蛇伤诊断方法，特别是ELISA向着高敏感度，高特异性、快速性和简便性方面大大发展了一步，出现了一些适合蛇伤早期快速诊断、测定蛇毒中毒量和追溯诊断不同要求的好方法。为了提高简便的凝集反应在蛇伤早期快速诊断上的应用，1991年Chinonavanig等14用A蛋白纯化的兔抗蛇毒IgG致敏的胶乳建立反向胶乳凝集反应诊断泰国常见的眼镜蛇、金环蛇、眼镜王蛇等6种蛇毒。敏感度为

10、1591221ng/ml，可在40min内得出结果，对蛇伤病人血清的检出阳性率为52.5%，此致敏胶乳稳定，在一般浓度下不出现交叉反应。以后Kittigul和Ratanabanangkoon（1993）15用同样方法致敏3种（绵羊、人和鸡）血球，作反向被动血凝试验测定泰国6种毒蛇毒，其敏感度为2635ng/ml，12h能得出结果。此法费用低廉、快速、操作简便，可以在发展中国家农村医疗单位应用。近20年来围绕着简化ELISA的方法，缩短检测时间，提高特异性方面做了大量的研究。1980年Coulter等1应用夹心法酶免疫分析(ElA)检测蛇毒，不仅保持了高敏感度 (0.52ngml蛇毒)，并能在3

11、090分钟内得出结果。此法和ELISA检测抗原(蛇毒)主要区别是：大大缩短了每个孵育时间(37水浴只需530分钟)。为了避免辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等作酶标时机体内源酶的干扰，1982年Chandler等16应用尿素酶作酶标，尿素作底物，用PH指示剂(溴甲酚紫)显色，肉眼可以直接判断结果此法特别适合组织内的抗原定性检查以及测定细胞协同抗原及其抗体此酶价格便宜不被叠氮钠所抑制。底物较稳定而无毒等特点，是一个较好的酶标新法。Chandler等已把它做成野外应用的检测蛇毒诊断试剂盒。基本上得到了简便化、高敏感、快速（3060分钟）。Chandler诊断试剂盒的主要装置如图5-2-1。其原理是夹心法

12、。图5-2-1（15玻璃是蛇伤诊断管，检查前，里面分别用各种特异性免抗蛇毒I gG包盖） -图5-12检测程序如下：吸取稀释标本（病人尿、全血、伤口部棉拭子洗液）进入一 系列毛细管内（血液用抗凝缓冲液稀释）。毛细管内稀释的标本置室温中10分钟。排出毛细管内稀释的标本，并用洗涤缓冲液洗3次（吸进、 打出3次）。将兔抗蛇毒抗体尿素酶结合物吸进毛细管内，并置室温中10分钟。排出毛细管内的结合物，再用盐水同法洗3次。将底物溶液吸入毛细管内，在室温下，对着白色背景观察颜色的改变，变紫色者即为阳性。继他们之后，特别是近十多年来，许多学者如Doellgast(1987)17Pugh 和Theakston（1

13、987）18、Silamut等（1987）、Bober等（1988）19Watanabe等（1988）20、BarralNetto等（1990）21、Hatsuse等（1990）22、BarralNetto等（1991）23、Stiles(1991)24、Audebert等（1992）25（1993）26、（1994ab）2728、Gillissen等（1994）29、Lalloo等（1994）30、Pe等（1991）31、（1994）32、（1995）33、AlapeGiron等（1996）34、Moisidis等（1996）35在使ELISA在高敏感性、高特异性、快速性、简便性方面做了大量

14、的改进。从1979年报道的第一个蛇伤诊断药盒以来，相继已有很多研究报道，但真正适合在农村和野外使用的尚不太多。1982年Chandler和Harrell(1982)36建立的一种可以在野外应用的毛细管酶免疫测定改良系统（药盒）。但因贮存期短，费用较高，操作也较困难等问题。1991年被更加简便，更加有效的澳大利亚国家血清实验室（Cox等，1992）37建立的药盒所代替。此法可测定出2.5ng/ml的蛇毒，20min可得出结果。对于澳大利亚五种毒蛇毒测定的特异性在PBS中是1040ng/ml。这个研究的结果显示所有五种蛇毒都明显的在10ng/ml被测出，并出现交叉反应，但比特异性反应要弱的多。近年

15、来Selvanayagam38和De39建立了快速的种特异性AB微滴定ELISA药盒测定印度4种毒蛇（B.Caeruleus, N.naja，E.carinatus和D.r.russelli）的蛇毒。此法只需0.6ml的抗凝血，不需任何器械，完全可在30min内得出结果（包括抽血和整个操作时间和观察时间在内），所有操作都在室温中进行，颜色反应明显，敏感度：10ng/ml，其效用已通过27例蛇伤病人的血、血清和咬伤部位的拭子液的检查得到了证实。下一步将观察和研究该药盒在野外现场的应用价值。 国内1981年广西医学院附院蛇伤科开始用酶标玻片法(DASS)进行银环蛇伤的诊断研究40，已取得一定进展。

16、1996年他们又报道了用快速斑点EIA法和快速ELISA法41在蛇伤诊断上的初步应用。前者整个反应时间仅需12min可测出10ng/ml抗原样品，后者，整个反应时需要23min，可测到30ng/ml的蛇毒样品。安徽中医学院李云龙等42从1980年底开始创用天然胶乳凝集抑制试验(NLAlT)进行我国主要的8种蛇伤的蛇种快速鉴定该法已生产成蛇种诊断试剂盒，使用很方便。可以在农村或野外快速诊断致伤蛇种。与以上一些方法比较，它具有操作极其简便、快速、准确，阳性检出率高，试剂稳定有效期长(1年)等特点。19811988年在我国南方8省临床共检查8种903例(五步蛇伤99例，蝮蛇伤299例，竹叶青蛇伤16

17、4例，烙铁头蛇仿42例，眼镜蛇伤148例，银环蛇伤103例，金环蛇伤45例，眼镜王蛇伤3例)蛇伤病人，总阳性率为97.12% 。均在58分钟内得出结果。可以在发展中国家和我国农村推广使用，并可作为蛇伤的蛇种快速诊断常规的方法.2. 蛇伤的免疫学诊断方法蛇伤的早期快速诊断必须要快速，操作简便、准确、阳性检出率高，试剂稳定，有效期长，适合农村和野外应用。由于毒蛇咬伤时的注毒量一般在几毫克或几十毫克以上44。早期局部组织中的蛇毒含量较高，如取咬伤当时流出（或挤出）的血滴或早期毒牙痕处的挤出液检查，阳性检出率是很高的。所以只要检出速度快，操作简便，特异性强，而具有较高敏感度（10-710-9克/ml）

18、的方法，都可以作蛇伤的致伤蛇种早期快速诊断。当然，检测速度越快，方法越简便，易在广大农村或野外使用的方法，其使用价值越大。那些ng量级的高敏感度的诊断方法对追溯蛇种诊断，检测血流中蛇毒的中毒量，研究蛇毒在体内动态变化，鉴定蛇伤（毒）致死案件及对蛇伤免疫学和流行病学的研究具有重要的价值。 目前国内外蛇伤快速诊断方法有：放射免疫测定、凝集反应、酶联免疫吸附分析、荧光免疫测定等。现将我国蛇伤应用的几种免疫学诊断方法介绍如下： （1）对流免疫电泳法45 材料 (a) 特异性蛇种诊断抗体：本地区存在的毒蛇的相应种特异性抗体（如五步蛇Dienagklstrodon acutus ，Guenther，蝮蛇A

19、gkistrodon halys， pallas，竹叶青蛇Trimeresurus stejnegeri， Schmidt，眼镜蛇Naja naja，linnaeus，银环蛇Bungarus multiciuctus，Blyth等五种特异性诊断抗体）。以蛇毒固相免疫吸附剂进行交叉免疫吸收制成。 (b)电泳装置：a.巴比妥巴比妥钠缓冲液(0.05M pH8.6)；b.l%巴比妥巴比妥钠缓冲液琼脂；c.电泳仪、电泳槽。 (c)检材：以负压吸毒法从咬伤局部的牙痕处吸取的液体或渗出液。 方法 采用Kobn对流免疫电泳法46，略加改变。按图5-2-2在1%巴比妥巴比妥钠缓冲液琼脂板上打孔。在琼脂板单号孔

20、内，分别加入相应纯化特异性蛇种诊断抗体约10l，在各双号孔内各加入检材10l 。按常规法电泳(板端电压40V左右)2030min两孔之间出现白色沉淀线为阳性。即被检物中含有与其对应孔特异性蛇种诊断抗体相应的蛇毒，说明被本蛇咬伤。如沉淀线不明显，可放4冰箱过夜后再观察结果。图5-2-2 琼脂板打孔示意图本法的阳性率与纯化特异性蛇种诊断抗体的质量、检材的种类、取材的方法、电泳操作技术等因素有关。正确的取材是一个关键性问题，取材可以结合局部伤口处理时进行，必须在伤口未经任何破坏蛇毒的药理处理之前，从毒牙痕中最先流出的血滴或吸出的微带血性的组织液为最好。如果血球含量太多，必须离心去除血球。以免影响电泳

21、和结果的判断。另外，电泳时所用的琼脂质量和浓度，电泳液、电压、电流强度和时间以及加样量皆与阳性率有关，必须进行预试确定下来。抗原抗体反应必须要有适当的分子比例，如果抗原浓度过大，可出现可溶性的抗原抗体复合物，而影响沉淀线的产生47。因此，在蛇伤早期局部吸出液检查为阴性时，有可能是由于蛇毒浓度过大而造成的假阴性。必须要将检材作36倍的适当稀释后再作检查，可避免漏诊。眼镜蛇毒素和银环蛇毒素是一种碱性蛋白质，在电泳中大部分成份向负极移动，小部分向正极移动48。在对流免疫电泳时，我们发现抗体被放在正极或负极端皆可出阳性沉淀线。因此，眼镜蛇和银环蛇的检查可各打3个孔。中间孔放已知特异性蛇种诊断抗体，两边

22、各放待检材料，这样检查也可。在实际检查中，为了减少琼脂板和操作上的麻烦，在一般情况下，可以省去已知蛇毒的阳性对照。关于阳性结果的判断问题，如在相应两孔之外出现的任何类似沉淀物皆是非特异性的，不能视为阳性。此外在脂血症或陈旧性标本电泳时，围绕待检孔向正极方向出现的乳白色的带，也是非特异性反应47，必须加以区别。但是，在两孔之间所出现的非垂直于两孔联线的明显沉淀线为特异性阳性反应。本法的主要特点如采用高纯化的蛇种特异性抗体，本法准确，特异性强。快速：2030min可得出诊断。可检出1g/ml或更低浓度的蛇毒。对早期（6h内）的蛇伤或蛇伤时痕处流出的血迹标本检出的阳性率是很高的。设备简单，操作简便，

23、适合农村基层医疗单位使用。但总的说，敏感度较低，对于蛇咬伤时间较长的病例检出率较低。(2)ELISA双抗体夹心法 DASS体系检测银环蛇咬伤49。 材料 a.种特异性抗银环蛇毒IgG：抗毒血清经盐析DEAE纤维素层析纯化，1gG再经具有共同抗原的亲和层析柱吸附过滤提纯。 b.酶标抗银环蛇毒种特异性抗体：按常规的过碘酸氧化法操作。将辣根过氧化物酶溶于NaHCO3溶液中，滴加一定量的二硝基氟苯的无水乙醇溶液，再加一定量的NaIO4，水溶液，加入乙二醇中止氧化反应。经透析后的辣根过氧化物酶溶液中加入种特异性抗银环蛇毒IgG，再加一定量的NaBH4，经透析加等量饱和(NH4)2SO4溶液，沉淀物溶于P

24、BS中透析过夜。计算结合物的克分子比值。 c琼脂糖珠交联的种特异性抗银环蛇毒IgG：将CNBr溶液加到Sepharose 4B珠中，在电磁搅拌下滴加2M NaOH使PH维持在l011.2之间(使温度保持在1520)，反应812min经o.1M/L pH9 NaHCO3洗涤后，按每ml 413珠结合5mg抗毒血清计算，加入提纯的种特异性抗银环蛇IgG。在4下缓慢搅拌过夜，使结合。再加pH8.0的1M/L乙醇洗涤4B珠，然后依次用0.1M/L PH4.0含1M/L NaCl醋酸缓冲液及0.1M/L PH8.0含1M/L NaCl硼酸缓冲液交替洗涤，最后用PBS洗涤，并稀释至适当浓度，4保存备用。

25、方法 在洁净的玻片上涂一薄层2%明胶。室温下空气干燥2hr，在低倍镜下加1020个按上法制备的，含抗银环蛇毒IgG交联的4B小珠，再在室温下干燥 2hr。加入待测抗原(银环蛇咬伤病人局部组织吸出液或血液)10l进行保温30min，使抗原和抗体在固相载体表面形成复合物，再加入酶标记的抗银环蛇毒血清IgG，使与固相载体表面的抗原结台，最后加入酶的底物，经催化作用后产生有色产物的量相当于溶液中抗原的量。 结果判定 在100倍显徽镜下观察，银环蛇毒阳性者致敏小珠呈黄棕黄色。阴性对照是采用正常人血清或其它蛇毒，均应无色。 本玻片法测定银环蛇毒的敏感度可达：510ngml，但此法必须3hr才能得出结果；对

26、及时抢救病人还不够理想。 (3)蛇种快速鉴定法天然乳胶凝集抑制实验(Natural latex agglutination inhibition test，NLAIT) 504243 本法创用天然胶乳作为凝集反应的载体，应用化学共价交联法制备蛇毒天然胶乳抗原与相应的蛇毒种特异性抗体组成蛇种快速诊断药毒盒。以蛇咬伤时或早期蛇伤病人局部挤出(流出或吸出)液或血迹为检材，作玻片法天然胶乳凝集抑制试验，检测蛇毒种特异性成分，进行致伤蛇种的早期快速诊断。可在58min内得出结果。 本法特别适用于农村或野外快速诊断致伤蛇种。它不仅检查快速，方法简便，而且准确。敏感度和特异性强，阳性率高，试剂稳定性好，有效

27、期长，对应用单价抗蛇毒血清的治疗，在法医学上鉴定毒蛇(蛇毒)致死案件以及中草药治疗蛇伤效果的评价等研究皆有重要作用。 蛇种诊断液的制备 (a) 材料: a.天然胶乳液：60%天然胶乳原液(安徽蚌埠乳胶厂提供)，用0.1M/L pH8.2硼酸缓冲盐水稀释成1%的浓度（内含0.025%氢氧化氨）.将其50倍的稀释液,用“72型光电分光光度计比浊并调整，使650nm波长的光密度(OD)=0.42，410存放，待用。 b.蛇毒溶液：取一定量经真空干燥保存的干蛇毒，用0.1M/L pH8.2硼酸缓冲盐水配制新鲜蛇毒液。五步蛇(Dienagkistrodon cutus Guenther)毒、蝮蛇(Agk

28、istrodon halys，Pallas)毒、竹叶青蛇(Trimeresurus stejnegeri,Schmidt)毒、烙铁头蛇(Trimeresurus mucrosquamatus,Cantor，)毒各配成3mgml的浓度；眼镜蛇(Naja naja atra Cantor)毒。银环蛇(Bungarus multicinctus, Blyth)毒、金环蛇(Bungarus fasciatus,Schneider)毒、眼镜王蛇(Ophiophagus Hannah,Cantor)毒各配成O3mgml的浓度。4数小时彻底溶解后，2 000rpm离心lOmim，取上清液使用。 c.蛇毒抗体

29、：8种蛇毒抗体均由安徽中医学院蛇伤研究室制备。 d.胰蛋白酶溶液：实验前取注射用的冻干胰蛋白酶(上海生物制药厂生产，每安碚含1 000u)，用0.1M/LpH8.2硼酸缓冲盐水配成400uml的浓度。 (b)制备方法：a.蛇种诊断1液(蛇毒种特异性抗体工作液)：用适量溴化氢活化的Sepharose 4B(瑞典Pharmacia厂生产)冻干粉剂。经充分溶胀并洗去稳定剂后，按每克干粉含lOmg抗原用量加入蛇毒按照常规法进行结合，分别制备8种蛇毒的亲和层析柱。将经洗脱液充分透析平衡后的适量蛇毒抗体，分别通过具有共同抗原成分的蛇毒亲和层析柱，收集穿过峰，浓缩，进行吸收过滤提纯。4保存备用。临用时，按相

30、应的蛇毒天然胶乳抗原的效价，用0.1M/L pH8.2硼酸盐叠氮钠缓冲盐水(含0.1%叠氮钠)将其稀释至相应浓度即成蛇种诊断1液。分装小塑料滴瓶。b. 蛇种诊断II液（蛇毒天然胶乳抗原）：取胰酶预处理的1%天然胶乳10份和蛇毒液2份，按照李云龙的方法44进行共价交联。再经酶解、乙醇氨等处理后以0.1M/L PH8.2硼酸盐卵清蛋白叠氮钠缓冲盐水配成1%（其50倍的稀释液OD650nm=0.42）浓度。经鉴定合格后即为蛇种诊断液。410保存，待用。按此法分别制备8种毒蛇的蛇种诊断液。本蛇种快速诊断液(液和液)已制成药盒，使用极为筒便。图5-2-3蛇伤快速诊断盒 （c）蛇毒天然胶乳抗原的鉴定： a

31、.外规：应为乳白色、均匀混浊、无颗粒的乳状液。 NLAIT蛇种快速诊断盒 b.效价测定(玻片法)：取不同稀释度的蛇毒种特异性抗体，分别加入蛇毒天然胶乳抗原及正常血清(3倍稀释液)各l滴，作玻片凝集反应。同时作蛇毒天然胶乳抗原对照。见表5-2-1。以1分钟出现+凝集。3min出现+凝集，而对照为阴性的种特异性抗体最高稀释倍数为蛇毒天然胶乳抗原的效价。此时蛇毒种特异性抗体的浓度即为特异性抗体工作液的浓度。（见表5-2-1）。表5-2-1 蛇毒天然胶乳抗原效价测定方法材 料 蛇毒特异性抗体稀释度（倍数） 蛇毒天然（滴） 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000

32、胶乳抗体蛇毒特异抗体 1 1 1 1 1 1 1 1硼酸绶冲盐水 1正常稀释血清 1 1 1 1 1 1 1 1 缓慢摇动1分钟蛇毒天然胶乳抗体 1 1 1 1 1 1 1 1 缓慢摇动3分钟，观察结果 c.敏感度测定(玻片法)：将蛇毒种特异性抗体工作液分别与含不同浓度蛇毒的人工阳性血清(或组织液)各1滴，混合摇动1分钟，再各加入蛇毒天然胶乳抗原1滴，混合摇动58min，观察结果。同时作阴性血清(或组织液)和蛇毒特异性抗体及蛇毒天然胶乳抗原的对照。见表5-2-2，以58min内不出现凝集的人工阳性血清(或组织液)的蛇毒最低浓度为其敏感度。 d.敏感度合格标准：在阴性标本中2min出现+凝集，5

33、8min达+凝集。人工阳性标本中，2min时50ngml的蛇毒标本可为+凝集，4min时不低于+凝集，而75ngml以上浓度的蛇毒标本始终不凝集或低于+凝集。8种蛇毒天然胶乳抗原的敏感度皆75ngml为合格。表5-2-2 蛇毒天然较乳抗原敏感度测定方法 蛇 毒 含 量（ng/ml） 对 照 材料（滴） 蛇毒特异性 蛇毒天然胶 2 1 0。5 0。25 0。1 0。075 0。05 抗 体 乳 抗 原含蛇毒的阳性血清（或组织液） 1 1 1 1 1 1 1 正常血清（或组 1 1织液）硼酸缓冲盐水 1 蛇毒特异性抗体 1 1 1 1 1 1 1 1工作液 缓 慢 摇 动1分 钟蛇毒天然胶乳抗原

34、1 1 1 1 1 1 1 1 1 缓 慢 摇 动58分 钟 合格结果 （一）（一） （一）（一） （一） （一） + + （一）e.特异性检查：用8种蛇种诊断1液分别和诊断液进行玻片法交叉凝集反应，应无交叉凝集。用浓度为500gml(眼镜蛇科的蛇毒为100gml)的各种已知蛇毒液，分别用8种蛇种诊断I液和蛇种诊断液进行凝集抑制试验，同时用正常人血清、组织液、尿以及不同病人(类风湿性关节炎、慢性肝炎、肾炎等)的血清作试验，前者应无凝集交叉抑制现象，后者应无凝集抑制现象。 检查方法 将咬伤时从伤口中流出或挤出的血液或血性组织液数滴，用生理盐水稀释5倍左右再行检查。检查时取清洁玻片(522cm，用

35、红漆划成若干个方格)一张，注明各格诊断的蛇种名称。将检材滴入各格内，每格1滴(约50图5-2-4 致伤蛇种快速测试定操作方法l)，再分别加入该地区常见的蛇种诊断I液1滴至相应格内，混合摇动lmin，（见图5-2-4）各格内再加入相应蛇种诊断液1滴，混合摇动58min，观察结果凝集者为阴性。均匀混浊者为阳性，即为该种蛇所咬伤。如该地区仅有一种常见毒蛇。检查时必须同时作含有巳知蛇毒的阳性标本(5倍稀释的血清或其它体液)和无蛇毒的阴性标本(5倍稀释的血清或其它体液)对照其检测方法如表5-2-3 。表5-2-3 一种毒蛇地区的蛇伤诊断方法（以蝮蛇咬伤为例）步骤 诊断格 阳性对照格 阴性对照格 1 检材

36、1滴 含蝮蛇毒组织液1滴 正常组织液的稀释液1滴 2 蝮蛇诊断I液1滴 蝮蛇诊断I液1滴 蝮蛇诊断I液1滴3 混合摇动1分钟4 蝮蛇诊断液1滴 蝮蛇诊断液1滴 蝮蛇诊断液1滴5 混合摇动58分钟，观察结果结果判断 均匀混浊不凝集为蝮蛇咬伤 均匀混浊 明显凝集 明显凝集为阴性 原理 本法所用的致敏载体天然胶乳，是从一种植物中提取的白色乳状液，其主要成分是聚异戊二烯和水等。其胶乳颗粒最外层为蛋白质，中层为磷脂，内层为聚异戊二烯，是一个粒径为0.10.2m的亲水胶体颗粒。它来源广，价格低廉，在室温下稳定性较好，易保存，是免疫反应的良好载体。通过化学致敏法，可使蛇毒蛋白(或其它抗体、抗原)和天然胶乳的

37、蛋白形成共价结合，成为稳定性的免疫胶乳颗粒蛇毒天然胶乳抗原。它能同特异性蛇毒抗体发生胶乳凝集反应。蛇伤早期病人咬伤局吸(挤)出液(或其他体液)中，含有少量残留蛇毒，此液如果和一定量的特异性蛇毒抗体先结合发生反应，抗体即无游离存在，再加入相应蛇毒胶乳抗原，胶乳即不发生凝集，称天然胶乳凝集抑制试验阳性。说明局部吸(挤)出液(或其他被检体液)中含有与该蛇毒天然胶乳抗原相同的蛇毒，即为该蛇所咬伤。反之，如局部吸(挤)出液(或其他被检体液)中无蛇毒(或含量极微)或无相应蛇毒时，则胶乳发生凝集为阴性。见图5-2-4。图5-2-5天然乳胶凝集抑制实验原理示意图 本法利用天然胶乳作为凝集反应的载体。并用化学共

38、价结合法制备了天然胶乳免疫微球(天然胶乳蛇毒抗原)。因此，此法不仅反应迅速，操作简便，而且敏感度高，总阳性率高，实验的重复性好，比用聚苯乙烯胶乳物理吸附稳定，在410冰箱中保存至少1年效价不变。也避免了非特异性凝集和正常血清的非特异性抑制理象。作为免疫血清学反应一个新方法，它在其他疾病的诊断上，也具有很大的应用价值 检查材料的种类、取材方法和检查时间 本法检查的阳性率与检材的种类、取材的方法和咬伤后检查时间有密切关系。毒蛇咬伤一般注毒量较大(数10mg至100多mg或者更多)，蛇伤时从伤口中流出的血液含毒量一般很高。蛇伤早期(伤后12h内，特别是在6h内)，咬伤的毒牙痕处的组织中残存有一定量的

39、蛇毒。伤处的流出液、吸出液或挤出液中含毒量比血清，尿液等体液中要大得多。用放射性碘标记的蛇毒注入动物皮下，一定时间后进行体内各部位的放射性测定，虽然蛇毒吸收较快，但在一定的时间内局部含量仍较它处相对为高，并残存一定时间。用放射免疫测定和ELISA51等方法检查也得到同样结果。因此，蛇伤早期局取材(牙痕处的流出液、吸出液、挤出液、局部水血泡)检查致伤的蛇毒是比较妥当的，而且检查越早阳性率越高。目前国外提出用加压绷带加伤肢固定法52进行急救处理来延缓蛇毒的吸收。这样，局部取材检查的价值就更大了。李云龙等53曾应用天然胶乳凝集抑制试验的蛇种快速诊断药盒对用1mg或2mg蛇毒攻击的7种实验性蛇伤的动物

40、(豚鼠)的局部挤出液和攻击时局部流出(或挤出)的血迹进行了致伤蛇种的快速鉴定。实验结果表明：所有实验豚鼠的局部取材标本经药盒检查皆为阳性。其中五步蛇伤组于72h内存活的豚鼠局部数次取材检查皆为阳性。蝮蛇伤组和竹叶青蛇伤组于24h内存活的豚鼠局部数次取材检查皆为阳性。烙铁头蛇伤组和金环蛇伤组于72h内存活的豚鼠局部取材的检查都是阳性。眼镜蛇伤组和银环蛇伤组虽于攻击后4h内死亡，但攻击后6h的局部挤出液皆为阳性。血迹纸片标本阳性的检出时间最长。除蝮蛇伤组120h以内全部检出阳性外，其余6种蛇伤组皆可在144h内，甚至更长时间仍能全部得出阳性结果(表5-2-4)。表5-2-4蛇伤的蛇种快速诊断药盒对

41、7种实验性蛇伤动物致伤蛇毒检查结果 豚 攻击剂量 检查 攻击后不同时间（h）检查的阳性数（阳性数/检查数）阳组别成 鼠 性 数 （mg/只）材料 6 12 24 48 72 96 120 144 168 率 0/0局部组 5/5 5/5 4/4 4/4 2/2 2/1 - - - 100五步蛇伤 5 2 织 液血 迹 - - 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 2/5 100局部组织液 5/5 5/5 3/3 - - - - - - 100蝮蛇伤 5 2 血 迹 - - 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 4/5 3/4 100 局部组竹叶青蛇伤 5 2 织 液 5/5 3/3

42、 1/1 - - - - - - 100血 迹 - - 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 3/4 100局部组烙铁头蛇伤 织液 5/5 5/5 5/5 4/4 2/3 0/2 - - - 100血迹 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 3/4 10 0局部组眼镜蛇伤织液5/5 10 0 血迹 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 10 0 局部组银环蛇伤织液5/5 10 0 血迹 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 10 0 局部组金环蛇伤织液5/5 5/5 5/5 3/3 2/2 1/1 10 0 血迹 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 100 “一“血迹检查中表示未检。局部组织中表示动物全死亡未检但心血检查的阳性率略低于局部组织液，只有当严重中毒时才可检出。此法也曾检测过数例早期病人的尿液和血清，仅获弱阳性反应。为了进一步探研蛇伤时毒牙痕处流出的血滴或其挤出液的干纸片中蛇毒的稳定性以及在夏季气温中长期存放能否被检出，了解蛇咬伤时的血迹标本作为蛇伤早期和恢复期追溯致伤蛇种的诊断价值，李云龙等54用低含毒量（25g/张）的8种我国常见的毒蛇的蛇毒干纸片在32气温下进行毒性和抗原性检查的研究。结果表明各种蛇毒干纸片在32中存放37天以后毒性有所降低，其毒性成分的稳定性较差，