高中生物竞赛辅导课程——《微生物学》专题.ppt

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1、微生物学,绪 论,高中生物竞赛辅导课程,一 什么是微生物,微生物是一些形体微小，以单细胞或简单多细胞、甚或是没有细胞结构的形式存在的低等生物的统称。,小,m级：光镜可见 nm级：电镜可见,形体微小,.,virus(0.05 to 0.1 microns)病毒,bacteria (0.5 to 1.5 microns) 细菌,red blood cell (5 microns) 红细胞,lymphocyte (5 to 8 microns) 淋巴细胞,human sperm (60 microns)人类精子,简,单细胞 简单多细胞 非细胞结构,结构简单,低,原核类： 三菌(细菌、放线菌、蓝细菌)

2、 三体(支原体、衣原体、立克次氏体) 真核类： 真菌 原生动物 单细胞藻类 非细胞生物： 病毒 类病毒 朊病毒,进化地位低,微生物世界之最,个体最小 数量最多 分布最广 形态最简 变异最易 起源最早 胃口最大,抗性最强 食谱最广 休眠最长 繁殖最快 种类最多,二 人类对微生物世界的认识过程,(一)难以认识的微生物世界 1 个体微小 2 外貌不显 3 杂居混生 4 因果难联,(二)微生物学史,时间：8000年前1676年 特点：个体(未见细菌) 思想方法：实践-实践-实践 代表人物：中国劳动人民,1 史前期,曲蘖酿酒,时间：1676年1861年 特点：显微镜下见到 微生物 形态描述200 年左右

3、 代表人物： Leeuwenhoek- 微生物学先驱者,2 初创期,3 奠基期,时间： 1861年1897年 特点： 建立了一套独特研究方法 进入生理学领域的研究 寻找病原菌 思想方法：实践-理论-实践 代表人物： (法)L.Pasteur-微生物学奠基人 (德)R. Koch-细菌学奠基人（巴斯德和柯赫）,(法)L.Pasteur-微生物学奠基人,否定“生命自然发生学说” 巴氏灭菌法 “酒病”-“腐败病”-“蚕病”-“禽病”-“人病”,病因：微生物,(德)R. Koch-细菌学奠基人 荣获1905年诺贝尔医学与生理学奖,方法：菌种分离、培养、接种、染色 病原菌：炭疽杆菌、结核杆菌 柯赫假说,

4、4 发展期,时间：1897年1953年 特点：进入生化水平的研究 形成综合性普通微生物学 代表人物：(德)E. Buchner(布赫),5 成熟期,时间：1953年现在 特点：理论-深入到分子生物学 实践-深入到生物工程水平,微生物的五大共性,体积小 面积大 吸收多 转化快 生长旺 繁殖快 适应强 易变异 分布广 种类多,个体小：微米、纳米 群体表面积大,1 扩大了吸收面、排泄面、信息交换面 2 是将微生物作为群体研究的依据 3 启发人们利用动、植物的微化,意义,面积/体积=比面值,600/1000,6/1,第一节 体积小 面积大,第二节 吸收多，转化快,吸收速度是人的300万倍 E.coli

5、（大肠杆菌）每小时消耗自身重量2000倍的糖,意义 1 为微生物生长提供了充足的物质基础 2 使微生物发挥“活化工厂”的作用,第三节 生长旺，繁殖快,二均分裂,意义 1 发酵工业： 2 遗传学研究：缩短实验周期 3 致病菌：传布快，危害大 鼠疫：14世纪，欧洲1/4人口死亡（鼠疫耶森氏菌） 马铃薯晚疫病：18451846年，欧洲100万人口饿死 肝炎：80年代上海30万人口 爱滋病：津巴布韦1/4人口感染,人类(300万年) 爬行类(2亿年) 两栖动物(3亿年) 鱼类、陆生动物(4亿年) 后生动物(6亿年) 古细菌 蓝细菌 好氧性异养细菌 真核微生物 (35亿年) ( 32亿年) (20亿年)

6、 (15亿年),第四节 适应强，易变异,适应强 冷：-70-196C 热：300C 酸、碱、盐： 耐压：,合成者+分解者 双环生态系统,分解者 原始的单环生态系统,变异性,有利面 生产实践中，获得优良特性的变种 不利面 菌株耐药性,1 发酵工业中，细粮改吃粗粮 2 筛选耐高温菌株 3 筛选弱毒菌株 4提高单位产量：1943年20U/ml，现在几万U/ml,警钟：滥用抗生素，眼前有好处，长远有副作用,40年代：注射10万单位/d 现在：注射100万单位/d,第五节 种类多，分布广,种类多 生理代谢类型多 代谢产物种类多 微生物种数多,分布广 无微不至 无孔不入 无远不届 无物不食 无险不攀,第二

7、章 微生物的形态和构造(一) 原核微生物,一 研究形态和构造的意义： 形态是入门向导，构造是研究基础 提高定向筛选效率 掌握发酵进程、及时探测杂菌污染 分类鉴定中应用,二 原核微生物的类群 光能：蓝细菌 “三菌” 化能： 细菌 放线菌 “三体” 人工培养基：支原体 专门寄生： 立克次氏体 衣原体,第一节 细菌,体小而细 形简而短(球、杆、弧) 是一类 壁坚而韧 单细胞原核生物 二等分裂 水生性很强,Myobacterium tuberculosis (TB),二等分裂,Bacteria are all around us. Given good growing conditions, a ba

8、cterium grows slightly in size or length, new cell wall grows through the center, and the “bug“ splits into two daughter cells, each with same genetic material. If the environment is optimum, the two daughter cells may split into four in 20 minutes.,一 细胞的形态构造及其功能,(一)形态和染色 杆状 1 形态 球状 螺旋状,杆菌,长杆菌，如 Bac

9、tillus subtilis,短杆菌，如 Escherichia coli,球菌,单、双链(分裂面一) 四联球菌(分裂面二) 八叠球菌(分裂面三) 葡萄球菌(分裂面多),金黄色葡萄球菌,螺旋菌,弧菌(vibrio)6圈,畸形 物理化学因素影响(阻碍细胞发育) 异常形 营养条件影响 衰颓形：菌龄,2 染色,(1)细菌染色法,革兰氏染色,1884年革兰发明的 细节：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞内形成不溶于水的复合物。 革兰氏阴性菌沙黄复染红色：革兰氏阳性菌紫色 原因细胞壁的构成不同： 阴：肽聚糖、类脂、 阳: 肽聚糖、磷壁酸、,(2)革兰氏染色法,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,G+菌 肽聚糖含

10、量高，层多厚，交联度大，无类脂 G-菌 肽聚糖含量低，层少薄，交联度小，类脂多,(二)构造,1 细菌细胞的一般构造 (1)细胞壁 (2)细胞膜和间体 (3)细胞质 (4)核质体 2 细菌细胞的特殊构造 (1)荚膜 (2)鞭毛 (3)芽孢,(1)细胞壁,位于细胞最外的一层厚实、坚韧的外被，主要由肽聚糖构成，有固定外形和保护细胞等多种功能。,肽聚糖,肽聚糖单体 双糖单位 N-乙酰葡萄糖胺(G) N-乙酰胞壁酸(M) 肽尾 短肽(45个氨基酸) 肽桥 15个氨基酸,磷壁酸,功能 G+抗原(表面抗原决定因子为磷壁酸) 噬菌体的吸附位点 聚集阳离子Mg2+ 保持胞壁透性 激活酶活性,G+特有的 同肽聚糖

11、混在一起的 是一类 分子比较短(69个) 的阴离子多聚物 以 甘油磷壁酸 为主链 核糖醇磷壁酸,脂多糖,G-特有的 位于外壁外层 是一类 厚度810nm 类脂+各种多糖,功能 保护作用、屏障作用 浓缩阳离子Mg2+、Ca2+ 噬菌体吸附位点 G-表面抗原 内毒素物质基础,外壁层中的蛋白质,外膜蛋白与周质空间(Periplasmic space),水解酶、合成酶，结合蛋白,2 特殊结构,(1)荚膜capsule 某些细菌壁外存在着一层厚度不定的胶状物质。,多糖 多肽,非必需的 储藏养料，堆积代谢产物 保护作用 附着的物质基础,种类,意义,鉴定菌种 制成代血浆或Sephadex 污水处理 三次采油

12、,微荚膜 荚膜 粘液层,(3)芽孢Endospore,某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内形成一个圆形或椭圆形抗逆性休眠体。,芽孢的形成,图示为苏云金芽孢杆菌。,二 细菌群体形态,菌落(colony) 以母细胞为中心的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞群体。 克隆(clone) 如果菌落是由一个单细胞发展而来的，则它就是一个纯种细胞群或克隆。,菌苔(lawn) 大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的“菌落”连成一片。,菌落形态是个体形态的集中表现,个体 群体 球状体 小、圆、隆起 杆状 大、圆、隆起 大、扁平 鞭毛 很大、不规则 芽孢 透明度差，皮肤 状皱褶 荚膜群体 透明度高，鼻

13、涕状，菌落大,第二节 放线菌Actinomycetes,一 定义：是一类呈菌丝状生长、主要以孢子繁殖和陆生性较强的原核生物。,二 放线菌近细菌特征,原核 菌丝直径与细菌相仿 细胞壁的主要成分是肽聚糖 有鞭毛的放线菌孢子同细菌鞭毛相同 放线菌噬菌体同细菌的相似 pH值同多数细菌相似，呈碱性 DNA重组方式同细菌同 核糖体为70S 对溶菌酶敏感 同细菌有相同敏感的抗生素,三 放线菌的分布,土壤 空气、水体、反刍动物肠道,四 放线菌的作用,利 产生抗生素、生产酶制剂、提取维生素、固氮作用 害 动植物病害,结核杆菌 麻风杆菌 疮痂病,五 放线菌的形态构造,(一)形态构造 1 基内菌丝 2 气生菌丝 3

14、 孢子丝,吸收营养,(二)放线菌的繁殖 横割分裂,干燥、小、密 菌落表面颜色为孢子丝颜色 菌丝细，直径同细菌类似 菌丝密 菌落边缘下陷，难以挑起。,六 放线菌的菌落,第三节 蓝细菌(cyanobacteria),异型胞,第四节支原体、立克次氏体和衣原体,一 支原体(Mycoplasma),类菌质体、类胸膜肺炎微生物 是一类无壁、G-、能通过细菌滤器、可以人工培养的最小型原核生物。,特征 无细胞壁，多形(可通过细菌滤器、对抑制细胞壁的青霉素和溶菌酶不敏感、对抑制蛋白质的抗生素敏感 膜(外、中、内)三层 二等分裂、少芽殖 菌落形态：油煎蛋状,二 立克次氏体(Rickettsia),是一类只能寄生在

15、真核生物细胞内的革兰氏阴性原核微生物。,特征 有细胞壁(对抑制细胞壁的青霉素和溶菌酶敏感 二等分裂 有不够完整的产能代谢途径，利用谷氨酸产能而不能利用葡萄糖,三 衣原体(Chlamydia),是一类在真核细胞内营专性能量寄生的小型革兰氏阴性原核生物 生活史,萤光抗体染色，黄绿色为衣原体,能量寄生物,原体 小细胞(壁厚),寄主细胞,始体(空泡) 大细胞(壁薄),包涵体,破裂,大量繁殖,感染,第三章 微生物的形态和构造(二) 真核微生物Eukaryotic Microorganism,凡是细胞核具有核膜，能进行有丝分裂，细胞质中存在线粒体或同时存在叶绿体等细胞器的微小生物，就称为真核微生物，包括真

16、菌，原生动物和显微藻类三大类；其中真菌又分为酵母菌，霉菌和大型真菌（覃菌）三类。,第一节 酵母菌-单细胞真菌 Saccharomycetaceae,酵母菌在自然界分布很广，主要生长在偏酸性的含糖环境中。其形态通常呈球状，卵圆状，椭圆状等，可进行无性繁殖和有性繁殖。,无性：出芽生殖、裂殖 、产掷孢子 有性：子囊孢子,二 酵母菌繁殖,假菌丝,生活史,营养体为n或2n 营养体只为n 营养体只能2n,啤酒酵母生活史,三 酵母菌菌落,湿润、光滑 稠厚、不透明 边缘整齐 色调单一,啤酒酵母菌落,红酵母菌落,第二节 霉菌丝状真菌Mould, Mold,霉菌：喜温湿，具丝状、绒毛或蛛丝网状的菌丝体，陆生性强，

17、无大型子实体，易引起工农业产品变的真菌。,the fruiting body of the Lamproderma slime mold,霉菌菌落,图示为青霉菌，左为灰黄青霉菌，右为产黄青霉菌。,图示为黑曲霉菌落。,松：菌丝粗，分布散 干：丝状、粉状 大：同细菌、放线菌菌落比较 颜色：基内菌丝、气生菌丝、孢子,四大类微生物菌落形态特征的比较,第四章 微生物的形态和构造 (三)非细胞型生物,病毒-核蛋白体 核酸 蛋白质,病毒 类病毒 亚病毒 拟病毒 朊病毒,活的证据：有繁殖、传播疾病的能力 死的证据：可被结晶。结晶性具僵硬、固定、排列规矩,第一节 病毒,病毒是 超显微的大分子生物 无细胞结构 只

18、含一种核酸 专性活细胞内寄生 体外可以无生命状态存在且保持其侵染性,特点： 小 可通过细菌滤器 成分：一种核酸+蛋白质 缺乏酶类、无核糖体、无蛋白质合成系统 专性活细胞内寄生 可结晶，且可在外界长期保存 特殊的繁殖方式：复制+装配 对干扰素敏感，对抗生素不敏感,一 病毒形态构造和化学组成,(一I病毒的大小 单位为nm，即10-9mm,(二) 病毒的形态,1 典型的病毒粒子 核衣壳 病毒粒子 包膜,核心：DNA或RNA 衣壳：衣壳粒蛋白,2 构型,(1)烟草花叶病毒(TMV)-螺旋对称,衣壳,衣壳蛋白：占95%，2130个衣壳粒,核心RNA：占5%，ssRNA,300nm 2.3nm/圈 = 1

19、30圈 130圈 16 1/3 个/圈=2130,(2)腺病毒(ADENOVIRUS)-二十面体立体对称,1953年发现,形状：二十面体 腺质体 致病性：消化道炎症等。,12个顶角 20个面 30个边,衣壳：252个衣壳粒 12个五邻体，240个六邻体 核心：dsDNA，线状,(3)T偶噬菌体-复合对称,头部 尾部,目前噬菌体基本形态分为3种 蝌蚪形 微球形 丝状,椭圆形20面体 衣壳粒212 内含DNA和中心蛋白,螺旋对称 衣壳粒144个 注射核酸的通道,3 病毒群体形态,包涵体：某些感染病毒的宿主内，出现光镜可见的大小、形态和数量不等的小体。 噬菌斑：把适量噬菌体倒在充满细菌的营养琼脂表面

20、，培养一定时间后噬菌体裂解细菌后留下的空斑。 空斑、病斑：动物单层细胞培养病毒后留下的，类似于噬菌斑。 枯斑：病毒作用于植物留下的局部坏死部分。,(三)病毒的化学组成,1 病毒的核酸 RNA多为ss，DNA多为ds,2 病毒的蛋白质 结构蛋白：位于颗粒外表，起保护作用；决定病毒的抗原性 酶蛋白：分解性酶；合成性酶,病毒侵入后的三种结局 裂性噬菌体增殖 吸附、侵入、增殖(复制)、装配、释放,二 病毒的繁殖 -以噬菌体为例,1 吸附,位点：受体、性菌毛等 过程：随机碰撞、尾丝散开、固着、刺突插入、基板固定 感染复数(multiplicity of infection)：每一敏感细胞可吸附的相应噬菌

21、体的数量。 自外裂解(lysis from without),2 侵入 过程：尾丝展开、释放溶菌酶、尾丝尾鞘收缩、DNA注入,动物病毒借助胞饮作用或直接穿过膜，植物病毒则通过伤口或昆虫刺吸传染,3 增殖,(1)核酸复制,核酸复制 核酸转录 蛋白质合成,DNA病毒(poxvirus)的复制,4 装配,DNA分子的缩合,通过衣壳包裹DNA而形成头部,尾丝和尾部其它部件独立装配完成,头部与尾部相结合,装上尾丝,成熟的病毒粒子从被感染细胞内转移到外界的过程。 没有包膜的病毒合成溶解细胞的酶，引起内裂解。 有包膜的病毒以下图方式进行：,5 释放,四 溶源性,溶源性：温和噬菌体侵入宿主细胞后产生一种新的特

22、性，称为溶源性。,1 温和噬菌体(temperate phage)：噬菌体吸附或侵入细胞后，其DNA只整合在宿主核染色体组上，并可长期随宿主DNA的复制而同步复制，一般不进行增殖或引起宿主细胞裂解的噬菌体。 原噬菌体(前噬菌体)：整合在宿主染色体上的温和噬菌体核酸。 游离态：具感染性的病毒粒子 整合态：原噬菌体，附着或整合在细菌染色体上 营养态：在宿主细胞内指导特定的病毒核酸和蛋白质的合成,2 溶源性细菌：含有原噬菌体(温和噬菌体)的细菌称为溶源性细菌。,溶源性细菌基本特性： (1) 溶源性是溶源性细菌的一个极其稳定的遗传特性 (2) 自发裂解 (3) 诱发裂解 (4) 具“免疫性” (5)

23、溶源性细菌的复愈：非溶源化 (6) 溶源转变：可获得一些新的生理特性,E. coli K12 ():表示一株带有前噬菌体的大肠杆菌K12溶源菌株。,三 逆转录病毒(Retrovirus)的复制、增殖和致癌原理,1 癌症： 现在知道是受累组织生长紊乱而又不受约束。现知约200多种，15%为病毒所引起，另主要为突变所引起。 2 逆转录病毒： Temin(1964年) 研究劳斯肉瘤病毒(RSV)，提出的前病毒学说(provirus theory) 。1970年发现了逆转录酶，荣获了诺贝尔医学和生理学奖。 逆转病毒是一类具有包膜的、含ssRNA的球状病毒，呈二十面体。它除含有一些一般病毒所具有的ssR

24、NA、蛋白质、脂肪和糖类外，还含有反转录酶(reverse transcriptase)、核糖核酸酶H(RNase H可降解RNA-DNA杂种分子中的RNA链)、转化蛋白和DNA连接酶等，,艾滋病数字 近二十年来1600万人受感染而死 全球感染者累计已达5000万 1999年有260万人因之死亡 新感染者中儿童和青少年居多，全球1999年儿童新感染者为560万 “重灾区”为女性，感染者人数超过男性 个别南部非洲国家有1/4的人口感染 去年全球每分钟有11人感染 目前非洲每天为此举行5500个葬礼 在不到十年的时间，我国的HIV-1携带者由1千余人上升到30万 我国感染者60%为吸毒者注射毒品时

25、感染病毒，其次为性行为传播和母婴关系传播,3 艾滋病-获得性免疫缺损综合症 80年代流行的AIDS(acquired immune deficiency syndrome)，病原体为人类免疫缺损病毒(HIV，human immnodeficiency virus)。 猿免疫缺损病毒(SIV，simian immnodeficiency virus) 人类免疫缺损病毒(HIV，human immnodeficiency virus) 艾滋病(AIDS，acquired immune deficiency syndrome) 艾滋病病毒起源：一是认为这是美国政府的一个生物武器试验；二是认为HIV病

26、毒来源于科学家们早期在非洲对脊髓灰质炎疫苗的试验。,HIV感染人体时先由其表面糖蛋白gp120与人辅助T细胞(即T4细胞)表面蛋白CD4特异结合，gp120流在细胞表面而病毒进入T4细胞内。在逆转录酶作用下，以RNA为模板由病毒DNA聚合酶催化得到原病毒DNA并整合到宿主细胞DNA基因组中进行繁殖。由于gp120都留在T4细胞表面，使得其像HIV病毒一样可以去感染另一个T4细胞而形成大的多核合胞体。 T4细胞被感染，则失去免疫功能，人则患上爱滋病。 这样，使人体变为没有军队的国家，只能招募“雇佣军”-抗生素。一旦雇佣军不济时则全线崩溃，死于象肺结核、肝炎及生理上的一些常见疾病。,第二节 亚 病

27、毒,类病毒：最小的、只含RNA一种成分、专性细胞内寄生的分子生物。 拟病毒：包裹在植物病毒中的类病毒。,病毒 类病毒 亚病毒 拟病毒 朊病毒,prion diseases Scrapie: sheep羊搔痒病 TME (transmissible mink encephalopathy): mink CWD (chronic wasting disease): muledeer, elk BSE (bovine spongiform encephalopathy): cows疯牛病 CJD (Creutzfeld-Jacob Disease): human克-雅氏病,朊病毒(Prion)：普列

28、昂：Protein infection 蛋白质侵染因子，是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子无免疫性的疏水蛋白质。 1982年，美国病毒学家Prusiner发现羊搔痒病致病因子为一种蛋白质，是一种不含核酸的微蛋白颗粒，形态为杆状颗粒，直径25nm，长100-200nm，对朊病毒影响最大的为蛋白酶、氨基酸化学修饰剂和蛋白质变性剂。其复制机制违背了现行的中心法则。,中心法则,理由1：RNA核苷酸比DNA核苷酸更容易合成，DNA可能是从RNA进化来的，比RNA更稳定，其作为遗传力的保管员的作用要胜过RNA。如逆转录病毒，它仍携带遗传信息； 理由2：新近发现RNA具有酶的功能，称酢酶。进化的结果

29、蛋白质完全担负起了催化的功能。如朊病毒也能携带信息。,第五章 微生物的营养和培养基,营养(Nutrition) to synthsize (build up) protoplasm to supply energy for all life processes,营养物(nutrient),第一节 微生物的六种营养要素,碳源 A carbon source(e.g.,carbohydrate) 氮源 A nitrogen source (e.g.,protein or ammonia) 能源 Energy 生长因子 Essential metabolites(vitamins; possibly

30、 amino acids) 无机盐 Certain inorganic ions 水 Water,一 碳源(carbon source),(一)定义：凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中碳素来源的营养物质 (二)碳源特点 1 依碳源分类 自养微生物：利用无机碳源，如CO2、碳酸盐 异养微生物：利用有机碳源，如葡萄糖、淀粉等 2 最适碳源 C-H-O 最适碳源 糖 醇 有机酸 脂类 最适糖类 单糖 双糖 多糖 最适单糖 已糖 戊糖 最适多糖 淀粉 纤维素 木质素、几丁质,二 氮源(nitrogen source),(一)定义：凡是可以被微生物用来构成菌体物质的或代谢产物中氮素来源的营养

31、物质 (二)碳源特点 1 氮源主要不提供能量 2 最适碳源 NHCO NH NO N2 3 速效氮源：以蛋白质降解产物存在的氮源 迟效氮源：以蛋白质形式存在的氮源,三 能源(energy source),能源，就是能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 异养微生物的能源就是其碳源 单功能营养物：如辐射能 双功能营养物：NH4+是硝酸细菌的能源和氮源 三功能营养物：如”N.C.H.O”是异养微生物的能源、碳源及氮源。,有机物：化能异养微生物的能源（同碳源） 无机物：化能自养做生物的能源（不同于碳源） 辐射能：光能自养和光能异养微生物部能源,化学物质,能源谱,四 生长因子(grow

32、th factor),微生物在生长过程中不能自已合成的 生长繁殖必需的 需要量较少的 外界加入的,有机物,是,生长因子谱： 维生素 氨基酸 嘌呤(或嘧啶),提供方式： 原料：酵母膏、玉米浆、肝浸出液、 麦芽汁、新鲜动植物组织,五 无机盐( inorganic ions),大量元素：生长所需浓度为10-310-4mol /L的元素 微量元素：生长所需浓度为10-610-8mol /L的元素,六 水(water),1 水的功能 胞外：溶剂(营养物质吸收) 溶剂(代谢产物的分泌) 反应介质 胞内 维持膨压 组成成分：7090%左右 调节温度：水的比热高,光合反应、蛋白质水解中，水是反应物 氧化、聚合

33、、葡萄糖酵解中，水是生成物,第二节 微生物的营养类型,异养型：生长时需要复杂有机物作为营养物质的机体。 自养型：生长时能以简单无机物作为营养物质的机体。 化能营养型： X还原型+A氧化型 X氧化型+A还原型+能量 光能营养型： 光能 化学能,色素,第三节 培养基,是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的营养。,原则 目的明确 营养协调 物理化学条件适宜 经济节约,方法 生态模拟 查阅文献 精心设计 试验比较,一 设计培养基的原则和方法,1 目的明确,何菌？ 何产物？ 何种规模？,自养菌：不能含有有机物 异养菌：供给有机物 细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基 酵母菌：

34、麦芽汁培养基 霉菌：查氏培养基 主流代谢 支流代谢 实验室培养 种子罐培养 发酵罐培养,2 营养协调,1 各营养元素之间的比例要协调 H2O C N P、S Mn、Co 生长因子 1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6,2 C/N比率：在微生物的培养基中所含的碳源中碳原子摩尔数与氮原子摩尔数之比。 细菌、酵母菌 C/N=5/1 霉菌、放线菌 C/N=10/1,氮源过多：菌体生长过旺，不利于积累代谢产物 氮源不足：菌体繁殖受到抑制，代谢产物积累,(1)控制pH值 细菌： 7.07.5 放线菌： 7.07.5 霉菌： 4.05.8 酵母菌： 4.05.8,3 物理化学条件适宜,(2)

35、培养基pH值调节方式,缓冲液 内源性 备用碱 : CaCO3 外加调节：直接加酸、碱(工业适用),KH2PO4 K2HPO4,等克分子量，pH值为6.8,(3)调节O2和CO2浓度 好氧菌：空气、通气 厌氧菌：加入还原剂等,4 经济节约,二 培养基的种类及用途,(一)按微生物种类,(二)按培养基成分,细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基 酵母菌：麦芽汁培养基 霉菌：查氏培养基,合成培养基 半合成培养基 天然培养基,伊红美蓝培养基(EMB培养基) 菌样 涂布EMB平板上,(三)按培养基用途,乳糖发酵 乳糖不发酵：无色菌落,能力强：紫色菌落 能力弱：棕色菌落,大肠杆菌,沙门氏菌属等,产

36、气杆菌等,基本培养基 富集培养基 鉴别培养基,基础培养基(minimum medium): 是含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基； 另外基础培养基也可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基时）。 选择性培养基(selective medium)：是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要，或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。,鉴别性培养基(differential medium)：用于鉴别不同类型微生物的培养基，在普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的

37、特征性变化，以区别不同的微生物，例：伊红美兰乳糖培养基（Eosin Methylene Blue）。 加富培养基(enriched medium)：在普通培养基中加入某些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）和分离某中微生物。,选择培养基,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、

38、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞,2、纯化大肠杆菌:,接种方法有： 平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的接种技术,固体培养基 半固体培养基 液体培养基,(四)按培养基物理状态,加凝固剂：明胶、硅胶、琼脂1.52% 天然固体：米糠、木屑、马铃薯块 滤膜：微孔醋酸纤维薄膜,凝固剂为0.5%左右,无凝固剂,无营养、无分解能力，融点96，凝点40,二 无菌技术：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污

39、染的方法。,说出消毒和灭菌有何不同？,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ,(1)常用消毒的方法：,1、灼烧灭菌: 2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。 3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)常用灭菌的方法：,无菌技术：,常 识,1 无菌技术包括： （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实

40、验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。 2 消毒方法： （1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法； （2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍）； （3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。 （4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒； （5）饮水水源用 氯气 进行消毒。 3灭菌方法： （1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法； （2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ； （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法

41、，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。 （4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。,三、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,1配制：计算、称量、熔化 2调节pH： 用3%的HCI/NaOH调节 pH 70- 72 3分装：分装过程中注意不要使培养基沾 在管口或瓶口上，以免沾污棉塞从而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 4包扎：,操作步骤:,5灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。 将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，

42、在160170 下灭菌2h。 6倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. 7无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板:,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养

43、基。,注意:,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,划线后 培养一段时间后,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,第七章 微生物的生长及其控制,个体生长 个体繁殖 群体生长,平衡生长,量,数,量,群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖,第一节 测

44、定微生物繁殖的方法,一、测生长量,直接法 间接法,比例计数法 血球计数法,测体积 称干重,比浊法 生理指标法,直接法 间接法,液体稀释法 平板菌落计数法,二、测繁殖数,第二节 微生物的生长规律,一、细菌的个体生长和同步生长 1、同步培养（synchronous culture）：即设法使群体中的所有细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂同期中，然后分析此群体的各种生物化学特征，从而了解单个细胞所发生的变化。 2、同步生长（ synchronous growth）：通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调的状态，就称同步生长。,二、典型生长曲线,1、典型生长曲线： 将菌种接种在液体培养基中隔一定时间取样

45、，计算菌数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图。 包括延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等四个时期 R(生长速率常数)=分裂次数(代)/单位时间,霉菌的生长曲线是否是典型生长曲线？ 固体培养基表面菌落是否为典型生长曲线？,？,（一）延滞期（las phase）,1 特点： 细胞数目不增加(R=0) 细胞长、大 代谢旺盛(RNA含量增加) 诱导酶迅速合成 对不良条件敏感，抵抗力降低 2 影响因素 菌种 接种龄：即“种子”的群体生长年龄，即处在生长曲线上的哪一个阶段，这是一种生理年龄。 接种量：接种量的大小明显影响延滞期的长短。 种子培养基成分：接种到营养丰富的天然培养基中的微生物，要比接种到

46、营养单调的组分培养基中的延滞期短。,（二）指数期（exponentialphase）,1 特点： 生长速率常数最大，繁殖数 死亡数 代时短，即细胞每分裂一次所需的代时G（增代时间，generation time）或原生质增加一倍所需的倍增时间（doubling time）最短. 成分均匀 酶活力高，酶系活跃，代谢旺盛。 2 三个重要参数,（三）稳定期（stationary phase）,1 特点： 细胞数目不增加(R=0)，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。 菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系 细胞长、大 代谢旺盛

47、(RNA含量增加) 诱导酶迅速合成 对不良条件敏感，抵抗力降低 2 稳定期到来的原因主要是： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，如 CN比值不合适； 酸、醇、毒素或 H20等有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。,3 应用 稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物，例如单细胞蛋白、乳酸等为目的的一些发酵生产的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。,（四）衰亡期（decline Phase或 death Phase）,1 特点： 个体死亡的速

48、度超过新生的速度(繁殖数合成速度,三 微生物的连续培养,连续培养（continuous culture）又称开放培养（open culture），是相对于上述绘制典型生长曲线时所采用的那种单批培养（batch culture）或密闭培养（closed culture）而言的。 原理：通过认识稳定期到来，并采取相应的有效措施：反“稳定期”的到来。 。,恒法器（turbidostat）这是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。 恒化器（chemostat或bactosen）与恒浊器相反，恒化器是一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率