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1、 学号:20090100292013 届本科生毕业论文（设计）题 目： 栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析学院(系)： 农 学 院专业年级： 农学09级学生姓名： 夏元燕指导教师： 陈其皎合作指导教师：完成日期： 二一三年六月目 录1 文献综述11.1 栽培黑麦的应用价值11.2黑麦基因资源在小麦育种中的研究现状及应用前景21.3籽粒淀粉合成与Waxy蛋白的关系研究31.4 Waxy蛋白研究状况41.5 Waxy基因的研究状况61.6 本实验的研究意义72 栽培黑麦Waxy基因的克隆92.1 材料与方法92.1.1 试验材料92.1.2试剂92.1.3 仪器92.2 试验方法102.2.1
2、引物设计与合成102.2.2黑麦基因组DNA的提取（微量CTAB法）102.2.3目的基因的扩增112.2.4目的片段的回收纯化112.2.5 目的片段的连接与质粒转化122.2.6 筛选阳性克隆122.2.7 核酸及蛋白序列分析133 结果与分析143.1 目的基因的扩增143.2 Waxy基因核酸序列分析143.3 Waxy蛋白序列及结构分析153.4 Waxy蛋白系统演化树的构建164 总结与讨论184.1实验总结184.2 讨论18参考文献19附 录21致 谢34栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析作者：夏元燕 指导教师：陈其皎摘 要：淀粉是自然界含量最为丰富的碳水化合物之一，也是禾谷
3、类作物（小麦、大麦、玉米、水稻等）籽粒的主要能量储存物质。作为禾谷类作物籽粒和面粉的主要成分，组成淀粉的直链淀粉和支链淀粉的含量和其比例是影响面粉口味和加工品质的主要因素之一。在控制植物直链淀粉合成中，颗粒结合型淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase, GBSS) 起着至关重要的作用，该酶也叫Waxy蛋白，由Waxy基因编码，与淀粉粒特异性结合后，指导直链淀粉的合成。当植物体内缺乏Waxy蛋白时，直链淀粉的合成就会受到阻碍，进而影响小麦籽粒中直链淀粉的最终含量。栽培黑麦（Secale cereale L.）是除小麦之外唯一适合做面包的谷类作物，作为栽培小麦的近亲
4、，对黑麦的研究历来受到重视。本研究利用微量CTAB法提取了5份栽培黑麦品种的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增，均得到了大小约2800bp的目的条带。NCBI在线BLAST表明，所得序列与黑麦品种Rogo的Waxy基因的编码序列具有95%的相似度。序列比对表明黑麦Waxy基因由11个外显子和10个内含子组成，去除内含子后，编码区长度为1815bp，编码604个氨基酸残基，序列比对表明编码区的同源性高达99%。将Waxy基因的编码区翻译成氨基酸后进行Motifscan在线预测，结果显示，Waxy蛋白的催化区由第78-339位共262个氨基酸残基组成，非催化区则分布在第379-516位氨基
5、酸残基。余下的第71-77位和517-604位氨基酸残基分别组成了Waxy蛋白的C-端非催化区和N-端非催化区。演化树的聚类分析表明，5条来源于黑麦的Waxy蛋白在氨基酸水平上与栽培大麦、野生二粒小麦和硬粒小麦遗传关系较为接近，与普通小麦、山羊草和大麦的遗传关系较远。关键词：黑麦；Waxy基因；克隆；序列分析CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF Waxy GENES FROM COMMON RYESABSTRACT: Starch is one of the most abundant carbohydrates in plant, it is also the m
6、ain storage material in cereal crop such as wheat, rice, maize, barley, rye and so on. As the main component in the grains and flour of cereal crops, the composition of starch, namely the content of amylase and amylopectin, is the major factor that determines the processing quality and flavor of flo
7、ur.In the controlling of amylose biosynthesis, granule-bound starch synthase plays a key role. This enzyme is also called Waxy protein, encoded by Waxy gene. After specifically binds with starch granules, Waxy protein can keep amylose unbranched. So amylose synthesis would be hampered when there is
8、a lack of Waxy protein in plant organ. And then, the final content of amylose is effected.Cultivated rye is the only grain crop capable to make bread besides wheat. As a close relative of wheat, rye is worth being studied in crop breeding and quality research.In this work, genomic DNA of five rye cu
9、ltivars was isolated. Target bands sized around 2800bp were amplified and sequenced through primer designing, PCR amplification and sequencing. Online BLAST indicated that the amplified sequences had a sequence identity of 95% with previously reported rye cultivar “Rogo”. Sequence alignment showed t
10、hat those cloned Waxy genes were constructed by 11 exons separated by 10 introns. The coding region of Waxy gene was 1815bp in length, encoding 604 amino acid residues. The coding regions of the five rye cultivars had 99% sequence identity. Online prediction of the amino acid sequences translated by
11、 the cloned Waxy genes indicated that the catalytic region of Waxy protein was constructed by the 78th to the 339th amino acid residues. And the none-catalytic region was from the 379th to the 516th amino acid residue sites. The rest amino acid residues of the 71st to the 77th sites and the 517th to
12、 the 604th sites form the N-none catalytic region and the C-none catalytic region, respectively.A phylogenic tree based on the translated amino acid sequences of the Waxy protein from the five rye cultivars shows that these rye cultivars had a closer evolutionary relationship with Triticum dicoccoid
13、es and Triticum durum, while evolutionary distances with Triticum aestivum, Aegilops searii and Hordeum Vulgare subsp.Spontaneum were a little farther.KEY WORDS: Secale cereale L., Waxy gene, cloning, sequence analysis栽培黑麦Waxy基因的克隆及序列分析1 文献综述黑麦（Secale cereale L.）,别名粗麦、洋麦，黑麦属禾本科小麦族小麦亚族一年生或者越年生的草本植物,
14、染色体组为RR, 现存黑麦除了人工诱变的材料外 ,皆为二倍体, 体细胞染色体数多为2N=2X=141。对于黑麦属的分类一直存在着不同的观点,综合黑麦属分类历史和国内外各个专家学者的研究结果2-10,可将黑麦属分为4个种, 其中3个野生种, 即Secale vavilovii Grossh (瓦维洛夫黑麦 )、Secale sylvestre Host(森林黑麦)和Secale strictum L.(山地黑麦),1个栽培种 ,即Secale cereale L.(普通黑麦)。而且其中Secale cereale L.为一年生异花授粉作物类型,Secale vavilovii Grossh和Se
15、cale sylvestre Host为一年生自花授粉作物类型,Secale strictum L.为多年生异花授粉作物类型。黑麦起源于近东和地中海地区。1.1 栽培黑麦的应用价值(1) 黑麦具有非常发达的根系，因而也具有很好的抗性,黑麦是最早也是最成功地应用于改良小麦品质的近缘作物之一，黑麦属（Secale L.）是小麦的三级基因源(tertiary gene pool)11，它具有许多普通小麦所没有的优良性状，如抗病虫性（黑穗病、锈病、白粉病、甲虫、蚜虫等），抗逆性（耐旱、耐寒、耐盐碱、耐瘠薄、耐干热风等），抗倒伏，分蘖能力较强，大穗多小穗，赖氨酸含量较高，适应性广12等 ,若将这些优良性
16、状的基因导入到其它的作物中加以利用，如小麦，就大大拓宽了小麦的遗传基础，丰富了其遗传物质的多样性，所以黑麦可以作为一种优质的种质资源。(2) 除了小麦外，黑麦是唯一适合做面包的谷类作物，用黑麦磨成的面粉做面包或者面包添加剂，可以改善面包的风味与口味，提高面包的烘烤品质，但由于缺乏弹性，常同小麦面粉混合使用13，黑麦面粉作为面包添加剂制成的面包受到广大消费者的一致好评。（3） 黑麦也可以作为动物饲料和牧草，黑麦的叶量大、茎秆柔软、品质好、适口性强，是牛、马、羊、驴喜爱的优质饲草，尤其是奶牛更喜爱食。黑麦具有很高的绿肥价值，黑麦鲜草含氮、磷、钾比较高，而且随着生育进程含量逐渐下降，而粗纤维含量逐渐
17、升高，其中以冬前、越冬和返青期粗纤维的含量最高14，而且黑麦根系发达，一般产鲜根达1500-27000kg/hm2 ，以黑麦与豆科混播，可以提高土地和光能的利用率，从而生产更多的绿色有机体。在世界上，俄罗斯和乌克兰黑麦产量约占世界产量的1/3,其他主产国是波兰、德国、阿根廷、土耳其和美国15。黑麦也可用于制造酒精饮料。1.2黑麦基因资源在小麦育种中的研究现状及应用前景由于黑麦具有许多有育种价值的农艺性状，因此人们将一些黑麦材料的遗传物质导入到小麦中，育成携带有黑麦染色体或者黑麦染色体片段的小麦品种并得到了大面积的推广应用16，迄今为止，在黑麦全部基因组一共鉴定的抗白粉病主效的基因有49个，而且
18、命名的抗条锈病基因有30个17，但这些抗病基因在我国的小麦育种中还没有全部被成功利用。已经命名的这些抗小麦条锈病的基因位点中，有些来源普通小麦，有些来源小麦的近缘野生种属，如黑麦、山羊草、斯卑尔脱小麦、簇毛麦以及偃麦草，其中以来源于黑麦的Yr9在小麦育种工作中发挥着巨大的作用。在黑麦的染色体1R上携带有很多种优良的农艺性状基因和抗病虫基因，例如黑麦1R染色体上就含有抗锈病基因和抗白粉病基因，所以在近30年以来，1RS1BI易位系在世界范围内的小麦育种中发挥了特别重要的作用。上世纪70年代以来，我国成功引入了含抗条锈病基因Yr9的lBlR代换系牛朱特(Neuzucht)等。上世纪80年代初期发现
19、，在黑麦品种Prolific的6R染色体上有1个抗小麦白粉病的基因Pm20。Friebe等18获得了抗病材料“Ks93WGRC28”，它是将抗白粉病基因Pm20转移到易位染色体上。黑麦的6R染色体不但携带有抗白粉病基因,还含有抗条锈病的基因。张怀琼，任正隆19培育的981054系列证明了此结论。因此，6R和1R一样，在小麦育种中具有抗白粉病和抗条锈病的双重作用。张相岐等20通过花药离体培养培育的含有黑麦1对6R染色体的花粉株系M16对白粉病优势小种表现出高抗性，据此可以证明6R染色体上Pm20基因在小麦抗白粉病育种中的重要应用价值，同时也可以说明它是一个良好的异源抗源。黑麦优良的基因资源在小麦
20、育种工作过程中发挥着越来越重要的作用。舒焕麟等21选育出的小麦-黑麦染色体代换易位系NR98127-9S等小麦材料表现出高抗，而且此品种还可以作为四川地区小麦抗条锈病育种中的亲本加以利用。颜济等22利用一种黑麦材料作为外源基因培育出的小麦新种质10-A，其小穗数目高达3038个，且不分枝多小穗，这种小麦大大的提高了小麦的产量潜力。运用黑麦种质资源不仅仅能够拓宽小麦种质资源的遗传基础，丰富小麦种质资源遗传多样性，而且还能够在改良小麦的品质、抗病虫性等方面作出特别重要的贡献。目前研究表明黑麦的抗逆性，耐盐碱性以及耐瘠薄性等优良性状已在“龙饲0303饲用小黑麦”中得到了充分体现。所以可以预见，随着现
21、代生物技术和染色体工程的迅猛发展，将会有更多的黑麦优良性状被高效、准确地导入到栽培小麦的染色体中，极大限度的提高了栽培小麦的遗传基础，使其更多的应用在生产和生活之中。1.3籽粒淀粉合成与Waxy蛋白的关系研究淀粉主要被人类作为食物，同时也广泛地应用于食品加工业、饮料业、纺织和造纸等各个行业。它在我们的日常生活中扮演着越来越重要的角色，淀粉是由许多葡萄糖残基组成的多聚糖，因多聚糖链的长短和分支程度的不同而分为直链淀粉和支链淀粉两种类型，在作物胚乳中储藏的淀粉，一般由70%-80%的支链淀粉和20%-30%的直链淀粉组成23，谷类作物籽粒和面粉的主要成分就是淀粉，谷类作物食品的烘烤蒸煮品质除了与蛋
22、白质的数量和质量相关外，在很大程度上还受到淀粉性质的影响，即直链淀粉和支链淀粉的含量及其比例是影响面条蒸煮品质和口味的主要因素之一，直链淀粉含量较低的面粉，做成的面条具有较好的柔软度、光滑性和黏性等24-25。在籽粒淀粉合成过程中的酶主要有：(1)淀粉脱支酶(SBE) ；(2)酰苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）；(3)可溶性淀粉合成酶（SSS）；(4)淀粉分支酶(DBE) ；(5)颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)。其中AGPase控制着淀粉的含量，AGPase大体上可以分成质体型与胞质型两种。对于大多数植物而言，该酶主要以质体型形式存在；而禾本科的胚乳则主要是胞质型AGPase。AGP
23、ase是一种寡聚酶，由两种结构不同的亚基组成（C2R2）。其中，小亚基的分子量介于50-55kDa，大亚基的分子量介于51-60kDa。氨基酸序列分析表明，在禾本科作物（如小麦、水稻、玉米、大麦等）的胚乳中，AGPase小亚基序列相似性超过了85，高于这些物种大亚基间的氨基酸的相似性。该现象说明，不同作物的AGPase大小亚基都具有保守性，但也存在进化上的差异。从功能的重要性上看，AGPase小亚基直接决定了淀粉的合成效率，其序列的变异也受到了比大亚基更为严格的控制。支链淀粉的合成受DBE、SSS和SBE三种酶共同控制，在SSS的催化下，ADPG中的葡萄糖基通过形成-1,4-糖苷键而与侧链的非
24、还原性末端相连，从而使支链淀粉的分支链得到延长。SSS的同工酶类型较多，主要包括SSSISSS三大类。在支链淀粉的生物合成过程中，上述三种酶分别发挥着不同的催化作用：SSSI只负责短链的合成，其长度一般为10个或者以下的葡萄糖聚合度；SSS参与中等葡萄糖聚合度的支链淀粉的合成；SSS催化长链的合成，一般包括2535个葡萄糖聚合度的淀粉。氨基酸序列分析表明，除了SSSI型的N-末端缺少8个氨基酸以外，上述三种同工酶的其他区段的序列保持很高的相似性，这可能意味着该同工酶编码序列极端保守。对小麦、大麦及水稻SSSI编码基因分析表明，该基因由14个内含子和15个外显子构成，而且这些物种的内含子分布特征
25、极为相似。而控制直链淀粉合成的关键酶是GBSS（Granule-bound starch synthase）26-28，当GBSS与淀粉颗粒发生特异性结合，使合成的直链淀粉保持未分支状态，发育中的与淀粉颗粒结合的唯一有活力的蛋白就是GBSS，在缺少淀粉分支酶时，此时只合成线型葡聚糖29。王宗阳等30比较水稻与大麦、玉米的GBSS氨基酸序列发现它们之间具有高度的同源性，水稻与大麦GBSS氨基酸序列的同源性为87，水稻与玉米的GBSS氨基酸序列同源性为88。它们均含有14个外显子和13个内含子，外显子大小非常相近，而且它们之间的核苷酸序列也存在着高度的同源性；然而内含子的大小差异却较小，且序列同源
26、性也比较低，说明GBSS氨基酸序列在不同物种之间的高度保守性主要体现在外显子区域上。GBSS主要位于淀粉粒的内部，其主要催化直链淀粉的合成，研究表明，直链淀粉含量对面粉的糯性具有直接影响，所以GBSS也被叫做糯蛋白（Waxy Protein），直链淀粉在GBSS的催化下与淀粉粒特异性结合产生线状多聚葡萄糖形成线性大分子(即直链淀粉),GBSS有2个同工酶，即GBSS和GBSS，GBSS是合成籽粒胚乳等贮藏器官中直链淀粉的关键酶，GBSS是控制非贮藏器官中直链淀粉合成的关键酶。王月福等31研究结果表明，籽粒胚乳中GBSS活性与直链淀粉积累速率呈极显著正相关32,颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）即W
27、axy蛋白，结合在禾谷类胚乳淀粉粒上，其表达与否制约着直链淀粉的合成，直链淀粉含量较高的谷类作物中，存在着Waxy蛋白，而直链淀粉含量很低的或者不含直链淀粉的谷类作物中，Waxy蛋白含量很少甚至没有，Waxy蛋白决定着谷物的糯性与非糯性33目前，有关GBSSI基因及其编码蛋白的相关研究较为深入，而该酶的作用位点及催化机制也有了一定的理论积累。但是，针对不同组织器官中的淀粉合成特性、该酶对淀粉品质性状的影响程度及有关机理尚需要进一步的研究证实。对GBSS等位基因特征的研究，有助于了解其突变体对GBSSI基因表达的影响。与此同时，加强对GBSS功能的研究与分析、设计针对GBSS的特异性分子标记,并
28、将其应用到育种生产中的亲本选配以及早代选择，从而会加速育种进程。而有关GBSS基因的研究积累较少，包括序列特性及对非贮藏器官中的淀粉合成的作用原理等方面的仍然有待于深入的研究。1.4 Waxy蛋白研究状况如1.3所述，在籽粒直链淀粉的合成过程中，GBSS蛋白起到了重要的作用。该酶的两种同工酶（GBSS和GBSS）具有组织表达特异性，其中，GBSS主要负责合成种子胚乳等贮藏组织中直链淀粉，而GBSS则主要负责合成非贮藏器官中的直链淀粉。王月福等的研究结果表明，在籽粒胚乳中GBSS的活性与直链淀粉积累速率呈现极显著正相关,颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）即Waxy蛋白，结合在禾谷类胚乳淀粉粒上，其表
29、达与否制约着直链淀粉的合成。直链淀粉含量较高的谷类作物中，Waxy蛋白活性很高，而直链淀粉含量很低的或者不含直链淀粉的谷类作物中，Waxy蛋白的活性则很少甚至没有，Waxy蛋白决定着谷物的糯性与非糯性。可以采用下述方法对Waxy蛋白进行鉴定：（1）电泳鉴定 一般情况下是运用SDS-PAGE方法进行电泳鉴定。研究表明，根据Waxy基因部分区段设计分子标记，为分析小麦基因组进化、Waxy基因的多样性以及资源发掘等提供重要手段。L.Yan和M.Bhave(2000)通过SDS-PAGE分析了部分有遗传背景的小麦及直系亲本的Waxy蛋白,对3个二倍体亲本品种的Waxy蛋白的氨基酸序列的推测表明,若几个
30、关键的氨基酸发生变异,会导致小麦Waxy蛋白的电泳迁移速率及蛋白质的空间结构发生变化,也会造成二倍体和六倍体小麦蛋白质呈现出不同的分子量。Yan、Bhave对所克隆获得的12个基因进行序列比对，结果表明，二倍体材料、四倍体材料及六倍体普通小麦的Waxy基因之间存在显著多样性；其中，该基因的第四内含子的变异会导致小麦及其亲本的糯性差异。该研究证明，基因的核酸序列标记是研究作物性状重要手段。Nakamura用双向电泳分离体系分离鉴定了3个不同Waxy基因位点：Wx-A1、Wx-B1和Wx-D1，发现它们分别位于7AS、4AL和7DS染色体上，证明六倍体小麦籽粒Waxy蛋白由3个亚基构成，编码3个亚
31、基类型的多肽为A亚基类型（SGA）、B亚基类型(SGB)和D亚基类型(SGD)，此方法操作比较复杂，而且分辨率和效率都非常低。Zhao、Sharp通过SDS-PAGE法，分析了普通小麦的3个Waxy蛋白Wx-A1、Wx-B1以及Wx-D1。上述亚基的分子量分别为62.9kDa、58.7kDa和56.7kDa。研究结果表明，改良的单向SDS-PAGE能有效分析Waxy蛋白，并适于小麦传统育种中对Waxy蛋白亚基进行的早代筛选。王子宁在SDS-PAGE的基础上对Waxy蛋白鉴定方法进行了改进，简化了提取过程，优化了凝胶系统。姚大年分析中国春小麦及其有关染色体缺体-四体系，中国地方小麦品种白火麦及国
32、内外400多份品系的Waxy蛋白类型分析，分析了二倍体小麦、四倍体小麦和原始六倍体小麦（西藏小麦）的Waxy蛋白带型，初步探讨了PCR技术在小麦Waxy基因鉴定中的应用和Waxy蛋白亚基缺失类型的遗传机理。（2）I2-KI染色鉴定 通过I2-KI染色可以在细胞水平上快速准确地鉴定Waxy蛋白 , I2-KI染色鉴定分为花粉粒染色和籽粒剖面染色2种方法，淀粉经过I2-KI染色后，直链淀粉会表现出深蓝色 ，而支链淀粉则表现为棕红色。花粉粒染色法是取扬花时期的小麦花药，所用染液的含碘量为0.067%碘化钾0.67%的混合试剂进行染色鉴定。而籽粒刨面染色是对成熟籽粒进行拦腰截断,然后在远胚端经过含碘量
33、0.2%、碘化钾量2%的碘混合液进行染色。糯性小麦经过染色后，其剖面显示棕红色，普通小麦则显示出深蓝色。上述方法操作简单便捷，而且易于掌握，是初步鉴定糯性小麦的有效途径。（3）分子标记技术鉴定 目前分子标记技术已经广泛的应用于建立数量性状座位图谱、遗传图谱、多样性的分析和分子标记辅助育种。Waxy蛋白编码基因的分子特异性标记是利用公布的Waxy基因的cDNA序列。Murai和L.Yan报道了普通小麦3个Waxy基因的基因组DNA序列；Vrinten等报道了2个突变等位基因(Wx-A1b,Wx-D1b)的cDNA序列,这些序列对于发展Waxy基因的DNA标记都是非常有用的。在水稻中，用（AT）n
34、 微卫星检测到了4个Waxy等位基因的5末端。检测到了大麦中的一个糯性基因的内含子中含有一个(AT)n微卫星。Ann.Brinery 等检测到了一个与GBSS-4A位点连锁的分子标记用以检测适于作优质Udon面的小麦。其PCR引物设计扩增出了440bp的PCR条带,与Wx-B1紧密连锁。Shatiflou检测了适于做面包的小麦一个Waxy基因3末端一个(AT)n微卫星的多态性，其引物设计是根据Clark在1991年公布的cDNA序列,PCR扩增的基因组是来自于澳大利亚的地方品种,其扩增的片断可以区分GBSS-7D位点,在含有无效Wx-D1基因的品种中却不存在此目的片断, Shatiflou用P
35、CR扩增技术为基础的STS分子标记技术, 检测和区分了Wx-D1位点突变和正常的等位基因 ,发现这种标记是共显性的。Wx-D1无效等位基因是来自于中国的地方品种“白火麦”，然而用此标记方法不能检测出另一品种NP105在同一位点的无效等位基因，这说明这个突变基因与“白火麦”不同。用此标记技术可以清楚的区分来自Janz的正常等位基因(Wx-D1) ,来自DHWx12的无效等位基因(Wx-D1),上述结果与Vrinten(1999)报道的一致，这2个品系不能编码 GBSS-7D,没有PCR扩增产物。这种结果可能是由于一些长片段的缺失或由于某区域DNA序列改变而引起不同。利用Waxy基因检测和标记技术
36、寻找全套Waxy基因的分子标记，有待于进行更深入的研究。目前人们对GBSS基因及其编码的Waxy蛋白做了较为深入的研究，对GBSS的位点及其作用机制有了初步的了解和分析，但针对不同的组织器官，淀粉合成的独立性及GBSS对淀粉品质性状的作用机理有待于进一步的研究 ,对GBSS等位基因的特征特性的研究，也让我们更加进一步的了解其突变体影响Waxy基因表达的质与量,在以后的研究中,我们需要加强对GBSS功能性的研究和分析，将GBSS的分子标记技术,广泛的运用到育种过程中，可以用于亲本的选配以及早代选择，加速育种进程；GBSS基因的特性分析及在非贮藏组织器官中淀粉合成活性中的作用机制有待于在以后进行深
37、一步研究。1.5 Waxy基因的研究状况编码Waxy蛋白的基因称为Waxy基因（简称Wx基因）。人们对Waxy基因的研究开始得比较早，1974年Tsai发现颗粒结合型淀粉合成酶由Waxy基因编码并控制直链淀粉的合成。Chao等1989年将Wx-A1、Wx-B1以及Wx-D1三个编码基因分别定位于7AS、4AL和7BL上34。Yamamori等35 在1994年结合单向、双向PAGE电泳法，系统地鉴定了中国春及其全套缺四体材料（CS-NT系列），从中国春中发现三种类型的Waxy蛋白亚基，并分别用Wx-A1、Wx-B1以及Wx-D1命名这三个亚基的编码基因。染色体定位表明，这三个基因分别位于7A、
38、4A和7D染色体上。其中，Wx-B1原本位于7BL染色体，但是在普通小麦的进化过程中，4AL和7BL染色体曾经发生过相互易位，为了研究的方便，在发现易位后，仍然按染色体来源将位于4AL染色体上Wx命名为Wx-B1。之后，Fujita等36研究发现，由Wx-A1基因编码的Waxy蛋白亚基的分子量最大，为60.1kDa；、Wx-B1基因编码的蛋白亚基次之，为59.2kDa；Wx-D1基因编码的Waxy蛋白亚基的分子量最小，为59.0kDa。此外，Charles和Joanna37用中国春及其缺-四体系为材料进行分析，对三个Waxy亚基的编码基因进行了详细的染色体定位，结果表明：Wx-A1位于7A染色
39、体短臂上，Wx-B1位于4A染色体长臂上，Wx-D1位于7D染色体短臂上。显然，这与Chao等的结果存在一定差异。Joanna等37和Monica等38分别于1991年和2000年克隆到了小麦Waxy基因的一条cDNA序列。Murai等391999年公布了中国春三个Waxy亚基编码基因的核苷酸序列。这些基因均包括11个外显子以及10个内含子，其中， Wx-A1序列长度为2781bp，Wx-B1序列长度为2794bp, Wx-D1序列长度为2862bp。三个Waxy基因在核苷酸序列上具有很高的相似性，其中，在成熟蛋白的编码区具有高达95.6%-96.3%的相似性，而内含子区也具有超过70%的相似
40、性。与当时公布的植物基因组序列相比，这些编码基因具有较高的GC含量，尤其在编码区密码子第三位的G/C比率非常高。Yan等402000年从三份小麦祖先材料中（一粒小麦 Triticum monococcum,AA；拟斯卑尔脱山羊草 Triticum speltoides,BB; 节节麦T. tauschii, DD）中分离到编码GBSS的三个基因（Wx-TmA、Wx-TsB、和 Wx-TtD），对应的长度分别为2834bp、2826bp和2893，均由11个外显子和10个内含子构成。序列比对显示它们和先前报道的大麦Waxy基因具有相同的外显子和内含子结构。由核酸序列推导的氨基酸序列表明，上述基因
41、编码产物具有相同氨基酸数目，但由于氨基酸替换，三种亚基的蛋白质的等电点及分子量存在差异。Waxy基因组和cDNA编码序列已经在小麦（Murai et al.,1999）、水稻(Wang et al.,1990）、大麦（Rohde et al.,1988）、玉米(Klosgen et al.,1986)、土豆（van der Leij et al.,1991）、豌豆(Dry et al.,1992）、高粱（Hsieh et al.,1996）、木薯(Salehuzzaman et al.,1993)等作物中被分离出来。该基因的突变必然影响胚乳中的直链淀粉含量，而品质测试结果显示，直链淀粉含量直接
42、影响面粉的品质（Guo,2003）。1.6 本实验的研究意义淀粉是谷物作物籽粒的主要成分，它是影响面粉品质的一个非常重要的因素，鉴定淀粉品质的一个重要指标是淀粉的糊化特性，而且它与面条、馒头等加工食品品质关系相当密切。随着淀粉用途的不断拓展，淀粉的遗传规律、理化性质以及淀粉与制成品品质之间的关系等内容愈来愈受到受到国内外研究者的重视。已有的研究结果表明，直链淀粉的含量或者说直/支链淀粉的比例与淀粉的膨胀和糊化特性密切相关，对于小麦质地和在工业上的加工品质尤其是面条品质具有很大影响。直链淀粉含量比较低的面粉，做成的面条在软度、粘性、光滑性、口感和综合评分等品质参数上有较好的表现。Waxy基因存在
43、于很多谷类作物的基因组中，它的突变与否决定着谷类作物的糯性与非糯。它调控着黑麦籽粒中直链淀粉的合成，淀粉是谷物籽粒和面粉的主要成分，食品的烘烤蒸煮品质除了与面筋质量和数量相关外，淀粉性质在很大程度上还是影响着它。在植物细胞中，Waxy基因编码的颗粒结合淀粉合成酶紧紧的结合于淀粉颗粒上，使得合成的直链淀粉保持未分支状态，它是与发育中的淀粉粒结合的唯一有活力的蛋白，它通过控制直链淀粉合成从而影响黑麦籽粒和面粉的品质和特性，当黑麦体内缺乏Waxy蛋白时，就会阻碍直链淀粉的合成，进而影响黑麦籽粒中直链淀粉的最终含量和面粉的加工品质。几年来，人们一直在运用普通遗传学和分子生物学如克隆手段试图降低GBSS
44、的生物学活性从而改良黑麦的品质。因此，研究Waxy基因和Waxy蛋白的序列和结构信息，能够为控制直链淀粉的合成开拓思路，具有重要的理论和实践意义。栽培黑麦除小麦之外唯一适合做面包的谷类，被广泛用于面包的制作。然而目前对黑麦Waxy基因研究报道还很少，人们对其Waxy基因和Waxy蛋白的信息知之甚少。本研究经同源克隆，得到了5条栽培黑麦Waxy基因的核苷酸序列，分析了黑麦Waxy基因和其编码的氨基酸的序列信息，丰富了人们对黑麦中Waxy基因的认识。同时，实验结果对小麦品质的改良亦有一定的参考价值。2 栽培黑麦Waxy基因的克隆2.1 材料与方法2.1.1 试验材料本实验所用的5份黑麦品种（ry1
45、 、ry2、 ry3 、ry4 、ry5）保存于国家小麦改良中心杨凌分中心品质实验室，试验材料于2010年秋统一种植于试验田，常规管理，2012年3月取嫩叶用于提取DNA，2012年6月收获籽粒。 2.1.2试剂（1）大肠杆菌Trans-T1、pMD18-T 克隆载体、大肠杆菌DH5、LA Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶等购于TaKaRa 公司（大连），2EcoTaq mix购于北京全式金生物技术有限公司，DNA Marker DL2000 、DNA 凝胶回收纯化试剂盒购于天根生化科技公司（北京），PCR扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，实验所用其他药品及试剂除特别注明外均
46、为分析纯，水为超纯水。（2）CTAB提取液：0.14Mol D-山梨醇，0.022Mol Tris-HCl，0.8M NaCl,0.80% CTAB, 0.022Mol EDTA(pH=8.0),1%二烷基肌酸钠，调节 pH=8.0；（3）氨苄青霉素：用ddH2O将氨苄青霉素配至终浓度400mg/ml的溶液，然后保存于-20的冰箱中以备用；（4）培养基的配制a.液体培养基的配制（LB）：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L ，用ddH2O定容至1L(调节pH值7.0)。121高压灭菌15分钟后即可使用。b.固体培养基的配制：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/
47、L ，琼脂粉15g/L,用ddH2O定容至1L(调节pH值7.0)。121 温度下，在高压灭菌锅中灭菌15分钟后，等到培养基温度降到了55时加入抗生素（AMP）后充分摇匀即可。2.1.3 仪器Dir-1N型超级洁净工作台购于哈尔滨东联电子技术开发有限公司；DK-9D电热恒温水槽购买于上海一恒科技有限公司；DHP-9053型电热恒温培养箱购于上海一恒科技有限公司；WD-9405B水平摇床购于北京市六一仪器厂；Milli-Q纯水系统购于 Millipore 公司；PROTEMANII XISYSTEM型电泳系统购于美国伯乐公司；Mini-protein电泳槽购于美国伯乐公司；Powerpac3000电泳仪购于美国伯乐公司；PTC-220基因扩增仪（PCR）购于美国MJ公司；1-15:K型台式高速冷冻离心机购于美国Thermo公司；4620型台式循环震荡培养摇床购于美国Forma Scientific公司。2.2 试验方法2.2.1 引物设计与合成引物设计根据GenBank数据库中已报道的普通小麦Waxy基因完整编码序列AF1633