植物细胞工程教案.doc

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1、植物细胞工程n植物细胞工程:是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。植物细胞工程是在植物组织培养的基础上发展起来的，因此，植物细胞工程亦是广义概念上的植物组织培养。 n植物细胞工程中心内容就是植物细胞、组织的培养n植物细胞工程从技术上说它是一种从单细胞到植株的无性繁殖技术n从遗传的角度来讲它具有遗传的保守性和变异性。其保守性可以进行植物的快速繁殖，建立植物物种资源库，利用其变异性我

2、们可以进行体细胞诱变、体细胞杂交以及基因工程等植物组织培养的发展简史n 探索阶段（19世纪初30年代中）德国植物生理学家HaHerlandt首次进行了植物细胞培养实验 奠基阶段（3050年代） 1934年，White培养番茄离体根尖成功 1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形成层首次成功n 迅速发展阶段（60年代后）n原生质体，花药，快繁技术迅速发展1958年Steward和Reinert用胡萝卜根的愈伤组织诱导成了体细胞胚，并进而获得了完整植株。 n科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下

3、实现的这一过程，就是植物组织培养。一、细胞的全能性1、定义: 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。 2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性3、差异: 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的 全能性比生殖细胞的低。 4、潜在全能性的原因： 基因表达的选择性 二、植物组织培养1、概念:科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养2、

4、植物组织培养过程离体的植物器官、组织或细胞-愈伤组织-根芽-植物体脱分化 由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。植物组织培养一般分为以下几种 1、胚胎培养：指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 2、器官培养：指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段，茎的茎尖、茎节和切段，叶的叶原基、叶片、叶柄、叶鞘和子叶，花器的花瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等的离体无菌培养3、组织培养：分离出植物各部位的组织

5、（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的植物组织培养。 4、细胞培养：指以单个游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为接种体的离体无菌培养。 5、原生质体培养：指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养三、植物再生途径到底通过哪种途径再生，与试验材料和培养基尤其添加的激素有关四、愈伤组织的种类1、胚性愈伤组织（Embryonenic callus）:表面光滑，组织结构紧凑，细胞小、再生能力强 。 胚性愈伤组织容易形成体胚，所以称为胚性愈伤组织 2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组

6、织结构疏松、细胞大 。 一般，非胚性愈伤组织诱导率较高，可达到100，即100的外植体可以形成愈伤组织；而胚性愈伤组织诱导率相对较低。 1、胚性愈伤组织的诱导n花药，幼胚、茎尖培养容易形成胚性愈伤组织或直接形成胚状体，但茎、叶片、叶柄等外植体在适宜的培养基上也能形成胚性愈伤组织或胚状体。 胚性愈伤组织诱导培养基一般只加生长素，并以2，4D效果最好。但植物不同，或组织不同，添加的浓度差别很大。如小麦幼胚培养适宜 2，4D浓度为2mg/L，甘薯茎尖培养为0。22。0mg/L，因品种不同而2、体细胞胚的形成n胚性愈伤组织形成后，有的在胚性愈伤组织诱导培养基上能直接形成体细胞胚，如花生及其野生种、小麦

7、、甘薯的部分品种等不需要转培养基，可直接形成体细胞胚。但还有些情况，必须将胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基上才能形成体胚。据报道，脱落酸（ABA）有利于体胚形成，如甘薯，添加0。5mg/L。 胚状体发育到一定阶段，容易与周围的细胞发生隔离，很容易从愈伤组织剥离下来。这是因为胚状体周围有一层“边缘细胞层”，后来次层细胞退化解体，使胚状体与周围组织间形成间隙。3、体细胞胚发芽及植株再生将形成体细胞胚的愈伤组织带体胚转移到不含激素的培养基上后，体胚发育成成熟胚，并发芽，再生植株。4、影响胚胎发生的因素1）、生长调节物质（激素） 对胚性愈伤组织的形成及体细胞胚胎发生影响最大的是激素。 胚性愈伤组织

8、诱导，培养基中加入生长素类有效，尤其2，4D。但不同植物，或同一植物不同品种，对2，4D浓度的要求不同。一般添加0.52.0mg/L，但也有的植物浓度需要很高，如花生需要在10mg/L以上。体胚的诱导，有的情况下可以在胚性愈伤组织上直接诱导出体胚，但也有的情况下，必须将胚性愈伤组织转移到体胚诱导培养基上才能形成体胚。不同的植物，或同一植物不同品种，体胚诱导培养基不同。有的在不加激素的培养基上有效；有的需要加低浓度的生长素（ 0.010.1 mg/L ），有的加激动素（KT）或脱落酸（ABA2）、氮源n培养基中NH+4有利于体胚发生。如加入0。1M NH+4Cl可以促进胚状体的发育。 氨基酸、酰

9、胺等有机酸也能促进体胚的发生。柳乳、酵母提取液、水解酪蛋白等含有多种氨基酸，培养基中加入某一种有利于体胚发生。 n3）、植物基因型的影响 ： 不同植物，或同一植物不同品种（不同基因型）间胚性愈伤组织形成及体胚发生能力差别很大，并且所需挤塑剂浓度也不同4）、植物的来源和年龄n外植体不同体胚发生能力也不同。一般，生长点、幼胚、花药、花粉等容易形成胚性愈伤组织和体胚。 n5）、其他因素 培养温度、光照时间和强度等也会影响体胚发生 一般，胚性愈伤组织诱导需要在黑暗下进行，待转到体胚诱导培养上后，可在光照下培养5、以甘薯为例n甘薯育苗取茎顶5厘米， 去掉叶片 -冲洗- 超净工作台内表面杀菌 显微镜下取茎

10、 添加0。2mg/LNAA，2mg/L6BA，3蔗糖，0。8琼脂的MS培养基（pH5。8）上培养- 1个月左右长出不定芽 -再生芽长至5cm以上，切下，并移植于MS基本培养基上 -长大后，12个节间一段移植于新的MS基本培养基上，进行扩繁 -炼苗4天左右，移栽于趾石：草炭土1：1的基质中 -成活后，移栽塑料棚，再扩繁 -田间移栽。 六、愈伤组织诱导及植株再生n（一）、愈伤组织形成的过程外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。1、诱导期：即细胞分裂的准备期。接种的外植体材料的细胞通常都是成熟细胞，处于静止状态，细

11、胞大小没有多大变化，外观无明显特征，但细胞内物质代谢旺盛，王凯基等（1981）在研究离体培养的油橄榄茎段时发现，细胞内合成代谢活跃，RNA含量迅速增加，细胞核体积明显增大。 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。特点：1.细胞的数目迅速增加。如胡萝卜培养7天后，细胞数可增加10倍。 2.每个细胞平均鲜重下降。这是由于细胞鲜重的增加不如细胞数目的增加快的缘故。 3.细胞体积小，内无液泡，如同根尖和茎尖的分生组织细胞特性。 4细胞的核和核仁增大到最大。 5.细胞中RN

12、A含量减少，而DNA含量保持不变。 6. 随着细胞不断分裂和组织生长，细胞的总干重、蛋白质和 核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快总之，分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态3、形成期n从愈伤组织到器官发生 形成期是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。进入形成期后，细胞的平均大小相对稳定，不再减少，细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂，结果形成瘤状或片状的拟分生组织，称做分生组织结节。分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心，或者进一步分化为维管组织结节由分生组织结节外围的细胞作平周分裂成

13、为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。由于此期细胞分裂已基本停止，细胞内发生生理代谢等的变化而开始形成一些不同形态和功能的细胞，因此有人又将此期称为分化期。 （二）愈伤组织的继代培养：脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。这个过程叫做继代。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分的增殖状态。然而，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结构。 （三） 愈伤组织的生长 一般来说，愈伤组织的增殖生长只发

14、生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。愈伤组织之间的质地有显著不同，有的很松脆，有的很坚实，且这两类愈伤组织可互相转变。其方法是：加入高浓度的生长物质，可使坚实的愈伤组织变为松脆。松脆愈伤组织都有大量的分生组织中心，进行活跃的细胞分裂；而不脆的愈伤组织很少分化，大都是高度液泡化的细胞。脆的愈伤组织是进行悬浮培养最适合的材料，稍经机械振荡，即可使组织分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团。在培养中细胞产生迅速增殖，而坚实的愈伤组织中的细胞间被果胶质紧紧地粘着，因而往往不能形成良好的悬浮系统愈伤组织的质地不

15、同是由其内部结构上的差异所引起的。坚实致密的愈伤组织内无大的细胞间隙，而由管状细胞组成维管组织；松脆愈伤组织内有大量的细胞间隙，细胞排列毫无次序。 生长旺盛的愈伤组织一般呈奶黄色或白色，有光泽，也有淡绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差别，如烟草、胡萝卜等脱分化较易，而禾谷类的脱分化较难；花器脱分化较易，而茎叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。一个多细胞外植体通常包含着各种不同类型的细胞，因此，由它所形成的愈伤组织也是异质性的，其中不同的组分细胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。（四） 愈伤组

16、织的形态发生方式 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形态建成，可再产生完整的植株。形态建成：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、分化或直接发育成各种形态完整的植物体的过程。在愈伤组织培养物中，细胞分裂常以无规则方式发生，并产生无明显形态或极性的无序结构组织块，这时虽然在愈伤组织中发生了细胞分化，形成维管化组织和瘤状结构，但并无器官发生。只有满足某些条件，才可从愈伤组织发生再分化而产生苗或根的分生组织，甚至胚状体，进而使它发育成苗或完整植株。在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式1不定芽方式（unfixed bud）和根的发生 不定芽和根的发生,是愈伤组织培养物或细胞

17、培养物培养中常见的器官发生方式,分为三个不同的生长阶段: 首先,是细胞和离体植物体脱分化形成愈伤组织,这是外植体发生细胞发生分裂的结果. 第二阶段为愈伤组织中形成一些分生细胞,形成瘤状结构,这是细胞分化、分化组织出现和有限细胞分裂的共同结果。 第三阶段为器官原基的形成，常由于在某些条件下，分生细胞团发生分化而形成不同的器官原基。器官原基是由一个或一小团发生细胞经细胞分裂而形成，进而产生小块分生组织。这些分生组织只有在一定条件下，才可逐渐转变到构成器官的纵轴上表现出单极性，从而分化为芽和根。实验表明，在植物组织培养中，当外植体形成愈伤组织后，可以利用植物生长物质比例控制器官发生的模式，通过调整某

18、些植物生长物质的比例促进芽和根的分化。一般来说，生长素有利于愈伤组织的形成根，细胞分裂素可促进愈伤组织形成芽。 不定芽方式指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式愈伤组织的器官发生顺序有四种情况： （1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无芽的根或无根的芽； （2）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出极而形成小植株，大多数植物属这种情况； （3）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。2胚状体方式（somatic

19、embryo） 指由培养细胞诱导分化出的胚胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体的发育过程：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。 具有以下三个特征: 第一、具有两极性。即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端与根端，而不定根或不定芽都为单向极性。 第二、胚状体的维管组织与外植体的维管组植物解剖结构的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。 第三、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形，而不定芽的维管组织无此现象。（五）愈伤组织形态发生的调控 来源于不同植物或同一种植物不同部们

20、的愈伤组织，在颜色、结构和生长习性上都可能存在差异，其遗传生理功能也可能或是具有胚性，或是不具胚性，在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中的2-3个。1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。 2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体。 3） 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。 4） 经过长期继代保存而不丧失胚性，有便有可能对它们进行各种遗传操作。 细胞和愈伤组织的形态发生，主要受外植体本身、培养基和培养环境等三大类因素的调控。

21、1、材料本身 1）遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。不同植物种的器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 2）器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 3）年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官形成频率低，愈入上部，苗的分化频率越高，苗分化频率越低。因此在组织

22、培养中，要及时转移已形成的愈伤组织进行分化培养，可大大提高苗的分化频率。2、培养基 培养基的各种成分和物理性质，都对器官发生产生一定影响，但起决定作用的仍然是植物生长调节剂，特别是生长素和细胞分裂素的配比。1）生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一，生长素对芽的抑制作用可为细胞分裂素所克服。细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样通过变换激素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化但是，要注意的是不同的生长素和细胞分裂素，对生根和长芽的效果是不同的。如NAA对生根的作用比IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的

23、根比较健壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往对生根不利，特别是在较高浓度下。Kt和BA能广泛地诱导芽的形成，但BA比Kt的效力大。玉米素的作用范围较窄，但对某些植物有特效。因此，往往多数植物采用BA 和Kt来诱导芽的形成。 2）无机营养元素 在植物组织培养中和整体植物一样，细胞的生长也要求满足植物生长的必要元素，若完全投入或过多或不足，也会影响细胞生长和分化。不过其影响不如激素的影响明显。但是各种类型的植物，器官所需要的每种元素的量，特别是大量元素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以常用1/2MS或White。如有些植物要求的氮，以硝酸态形式供应为佳；而有些植物要

24、求的氮，以铵态氮的形式供应为佳。 当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：氮某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色；不能形成导管。 氮钾和磷细胞过度生长，形成层组织减退； 硫非常明显地褪绿。 铁细胞分裂停止。 硼细胞分裂停滞，细胞伸长。 锰或钼影响细胞伸长。 3）有机成分 在培养基中加了糖、各类B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可以满足愈伤组织的生长和分化的要求。各中氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可以促进器官分化。其中酪氨酸可明显增加烟草组织培养的器官形成。酰胺类往往有促进器官形成的作用。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，在进行器官分化培养时，加入一定量是有益的4）物理性

25、质 培养基的物理性质（固体或液体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响。在胡萝卜和石刁柏的培养过程中，需要改变培养基的形式，才能顺利地分化出苗。其方法是： 第一阶段诱导形成愈伤组织，应在固体培养基上进行培养； 第二阶段细胞和胚状体的增殖，需在液体培养基中完成；第三阶段由胚状体发育成可移植的植株，又应转移到固体琼脂培养基上进行培养。 培养基中的渗透压，对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响，在花药培养中受到普遍的重视。如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。 3、培养环境条件 1）光周期的影响 光周期的需要与否，应根据植物种类培养目的来决定。 在愈伤

26、组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照，上述两种做法诱导率差异不大。另一些植物差异较大，如石刁柏全暗诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多。大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较好；光照对地钱干重的增加明显地优于黑暗培养。 器官发生阶段，一般给予周期性光照比较好。光周期长短因植物种类而异。多数植物8-10小时黑暗为宜。如茄子、苹果等。也有例外，有些植物如石刁柏需要16小时光照，12小时黑暗。2、温度 在组织培养中，一般都采用22-25的恒温条件下进行外植体的培养。对一般植物来讲，都可较好地形成芽和根。但是很多资料表明 ，温度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。如对喜温性植物如茄

27、科、葫芦科、兰科、禾本科等的培养温度一般可控制在26-28比较适宜。而对于冷凉性植物如百合科、十字花科、菊科等植物则培养温度可控制在25以下较为适宜。 七、器官发生与体细胞胚胎发生 一器官发生 （一）概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂 和增殖再分化形成根和芽等器官的过程二）发生方式：有两种发生方式 （1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接 分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。 二 胚状体方式(somatic embryo) 指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的

28、胚状结构，进而长成完整植株1、由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段： 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。 2、胚状体与不定芽的区别胚状

29、体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。 胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的八、以茎、叶片、叶柄等外植体为例 （一）、材料

30、 可用试管苗（无菌苗或无毒苗，两者不同），也可从田间或温室取材，后者要表面杀菌 材料老嫩对植株再生影响很大，用幼嫩、生长旺盛的植株材料，可提高再生能力。 （二）、接种 茎叶柄一般切成5mm的段，叶片除去主脉和叶片的边缘，切成22mm的小片，接种到培养基上。 （三）、培养1、愈伤组织诱导培养基中一般添加生长素和细胞分裂素 生长素：NAA、IAA、2，4D、IBA 分裂素：6BA、 Kinetin、 Zeatin 因植物不同，添加生长素和分裂素的种类、浓度及配比不同 一般，生长素浓度相对高的情况下，有利于形成愈伤组织和不定根，而分裂素有利于不定芽的分化 2、不定芽在分化 有的植物，在适宜的诱导培养

31、基上可以直接形成不定芽。如丽格海堂，在添加NAA和6BA的MS培养基上培养23周后，便形成不定芽，而在添加2，4D和Kitentin的培养基上只能诱导出愈伤组织，而不能形成不定芽，必须转移到在分化培养基上才能分化不定芽。 再分化培养基以分裂素为主6BA 、Kitentin、Zeatin .也有报道GA3有利于不定芽分化。还有的植物以不加激素为好3、继代培养 继代培养的目的：快速繁殖，促进再生 可继代培养愈伤组织，也可继代培养再生植株，或诱导丛生芽 1）、愈伤组织继代培养 将形成的较大的愈伤组织，切分成小块进行培养，长大后在切分，待转移到再分化培养基上，可形成大量不定芽2）、再生植株继代培养 ：

32、利用茎段腋芽大量繁殖 3）、诱导丛生芽 ：利用带腋芽的茎段进行培养，在适宜的培养基上可诱导丛生芽，进行大量繁殖 4）、促进再生：再分化培养基上继代培养，可促进再生4、生根 诱导根形成培养基，也因植物不同而不同。一般以NAA的生根效果较好，培养基中一般添加0.050.1mg/L，也有报道IAA生根质量较好，添加浓度一般为0.52.0 mg/L，浓度过高，易在茎基部形成愈伤组织，影响生根质量。另外有些植物，生根培养基中不需要添加激素，如甘薯，部分花卉等 在培养工程中，有些植物具有向性，如茎段、叶柄段，在母体上，生长向下的切口，易形成愈伤组织脱毒苗生产及离体快速繁殖第一节、培养无毒苗的意义 目前，生

33、物技术应用孕哦年工业生产最多、最广泛、最有效地使脱毒快繁技术，与基因工程、染色体工程、细胞融合等相比，方法也最简单。 一、病毒的危害 多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。因此说，病毒带来极大的危害。 目前，对细菌和真菌侵染的病害，可以通过药物处理达到治愈的目的，如多菌灵等。但目前，还没有药物能致病毒。种子一般不带病毒，种子繁殖植物可以得到无菌植株。但对于无性繁殖植物，必须采取一种有效的方法，脱去病毒，才能达

34、到提高常量和质量的目的。二、培养无毒苗的意义能够有效地保持优良品种的特性；生产无病毒种苗，防止品种退化；快速繁殖新品种，使优良品种迅速应用；节约耕地，提高农产品的商品率；便于运输。三、病毒侵染的特点n早在40年代，就有科学家（White 等）发现病毒在根上和茎上的分布是不均匀，离根尖和茎尖越近，病毒的密度越低。反之，越高。即病毒在植物体内的分布是不均匀的，分生组织一般无病毒侵染。 分生组织之所以能避开病毒侵染，可能有4方面的原因：在植物体中，病毒的移动主要靠两条途径：一是通过维官系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常缓慢，难以追赶上活跃生长的茎尖和根尖

35、。 在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，使病毒无法进行复制。 在茎尖中存在高水平内源激素，可以抑制病毒的增殖。 在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，他在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。 以上是四种可能的原因，无论哪种说法正确，事实上分生组织一般不带病毒。因此，利用这一原理，进行茎尖培养，培养无病毒苗。四、植物脱毒的基本原理病毒在植物体内的分布具有不均匀性理论假说：(1)、能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了

36、病毒核酸的复制。(2)、传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。(3)、激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4)、酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。(5)、抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径五、脱毒方法 （一）、热处理脱毒 1、热处理发的发现及应用 1889

37、年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗（现证明为病毒病），放在50-52的热水中保持30分钟，甘蔗就可去病生长良好。以后这个方法得到了广泛的应用，每年在栽种前把大量甘蔗茎段放到大水锅里进行处理。自1954年Kassanis用热处理防治马铃薯卷叶病以后，这一技术即被用于防治许多植物的病毒病。 热处理又称温治疗法（theomtherapy)，原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。Kassanis(1954)解释是感染植物体内病毒的含量，反映了病毒颗粒生成和破坏的程度。在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，

38、以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒目的。 1960年Wn等通过烟草愈伤组织的感染试验，观察到愈伤组织的快速生长，可以降低病毒的生长，他提出：植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在着互相的竞争。在激烈分裂的细胞中是正常核蛋白合成占优势，而在细胞伸长期间是病毒核蛋白的合成占优势。因此，加速分生组织细胞的分裂，是能够获得无病毒植株的。 2、热处理脱出植物病毒的原理（1）、病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。（2）、热处理是一种物理效应，与冷处理一样

39、，他可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。n依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。3、热处理方法 （1）温水浸渍处理 适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50左右的温水中浸渍10分钟至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。（利用较早，二十世纪二十年代对甘薯一种病毒脱除效果较好。5052温水浸渍30分钟） （2）热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好，将生长的盆栽植株移入温热治疗室（箱）内，一般在35-40。处理时间因植物

40、而异，短则几十分钟，长可达数月。香石竹于38下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。草莓茎尖培养结合36处理6周，比仅用茎尖培养可更有效地清除轻型黄斑病毒，亦可采用变温法，如马铃薯每天40处理4小时，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持了芽眼的活力。（果树上利用较多。苗木高温下快速生长顶芽嫁接于实生苗砧木上。）热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说，对于球状病毒和类似纹状病毒以及类菌质体所导致的病害才有效；对杆状和线状病毒的作用不大。因此热处理需与其他方法配合应用才可获得良好的效果。 （二）茎尖

41、培养脱毒 1、茎尖培养脱毒原理 感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点（约0.1-1mm区域）则几乎不含或含病毒很少。因为植物细胞是DNA大分子，病毒侵染植物后可进入植物细胞，当植物细胞分裂时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。 在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒核蛋白合成占优势，因为生长点、分生组织细胞是活跃分裂的细胞，其分裂能力比病毒DNA复制速度快，故采用旺盛分裂的生长锥（顶端分生组织）离体培养，就有可能脱除植物病毒。并且分生区域内无维管束

42、，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全出去病毒。 茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。2、培养基 一般以White、Morel和MS培养基作为基本培养基，尤其是提高钾盐和铵盐的含量会有利于茎尖的生长。在MS培养基对某些植物的茎尖培养时，其中有些离子浓度过高应稀释。植物激素的种类与浓度对茎尖生长和发育具有重要的作用，在双子叶植物中，激素大概是在第2对最年幼的叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须提高适当浓度的生长素（0.1-0.5毫克/升）与细

43、胞分裂素。在生长素中应避免使用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜换用稳定性较好的NAA或IBA；细胞分裂素可用KT或BA；GA3对某些植物茎尖培养是有用的；有时茎尖培养添加活性炭。在茎尖培养中，由于方便操作，一般都使用琼脂培养基。不过，在琼脂培养基能诱导外植体愈伤组织化的情况下，最好还是用液体培养基。在进行液体培养时，须制作一个滤纸桥，把桥的两臂浸入试管内的培养基中，桥面悬于培养基上，外植体放在桥面上。3、茎尖的培养方法 在进行脱毒培养时，由于微小的茎尖组织很难靠肉眼操作，因而需要一台带有适当光源的简单解剖镜（8-40倍）。除了进行植物组织无菌培养一般工具外，还需要一套解剖刀。剥离茎尖时，应尽快

44、接种，茎尖暴露的时间应当越短越好，以防茎尖变干。可在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，有助于防止茎尖变干。 不过和其他器官的培养一样，在进行茎尖培养时，首要是获得表面不带病原菌的外植体。因此，一般来说，茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，无须表面消毒就可以得到无菌的外植体。有时消毒处理还会增加培养物的污染率，所以选取茎尖前，可把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室中进行栽培。浇水时要直接浇在土壤中而不要浇在叶片上。另外，最好还要给植株定期喷施内吸杀菌剂，可用0.55多菌灵和抗生素（如0.1%链霉素）。对于某些田间种植的材料，可以切取插条出入Knop溶液克诺普氏。硝酸钾

45、 1克 ，硫酸镁 1克 ，磷酸二氢钾 1克，硝酸钙 3克。先把硝酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾用少量蒸馏水溶解，加蒸馏水到980毫升。随后取硝酸钙，用20毫升蒸馏水溶解，加入到上述溶液内。溶液灰形成白色沉淀，在使用是必须摇动。在以上溶液中加入蔗糖溶液（14%），能刺激某些藻类形成游动孢子。该液用于培养绿藻中使其长大，由这些插条的腋芽长成的枝条，要比由田间植株上直接取来的枝条污染小的多。为了保险起见，在切取外植体之前一般仍须对茎芽进行表面消毒。叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须75%酒精中浸蘸（zhan）一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、蒜和马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表面消毒10分钟。对于这

46、些消毒方法，在工作中应灵活运用，如在大蒜茎尖培养时，可将小鳞茎在75%酒精中浸蘸一下，再用灯火烧掉酒精，然后解剖出无菌茎芽。在剥取茎尖时，把茎芽置于解剖镜下，一只手用镊子将其按住，另一只手用解剖针将叶片和叶原基剥掉，解剖针要常常蘸入90%酒精，并用火焰灼烧以进行消毒。但要注意解剖针的冷却，可蘸入无菌水进行冷却。当一个闪亮半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将分生组织切下来，为了提高成活率，可带1-2枚幼叶，然后将其接到培养基上。接种时确保微茎尖不与其他物体接触，只用解剖针接种即可。 将接种好的茎尖置于22左右的温度下。每天以16小时 2000-3000lx的光照条件下培养。由于在低

47、温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同，这里不再叙述。以马铃薯为例介绍脱毒方法 1取材和消毒 将欲脱毒品种块茎催芽，芽长45cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗 ，于无菌室内用漂白粉溶液或0.1-0.2%升汞消毒后，用无菌水冲洗35次。 2剥离和接种 在无菌室内，于40倍解剖镜下，剥取带1-2个叶原基地茎尖，接种于MS茎尖培养基试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂，pH值为5.8，经高压灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。 3培养条件 接种的茎尖培养于25C、15003000LX光照条件下培养室内，3个月则长成34片叶的小植株。在无菌条件