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1、氩等离子凝固术和冷冻消融术对犬气管急性损伤的实验研究张莹莹 张杰 王娟 徐敏 裴迎华 王玉玲 王婷 张晨阳 【摘要】 目的 比较氩等离子凝固术在不同功率（30w、60w）下对正常气管的急性损伤深度及冷冻消融术在不同作用时间（30s、60s）下对正常气管的急性损伤程度和深度，探讨上述四种不同的处理方式对正常气管作用的效果和安全性。方法 对8条杂种犬的气管行氩等离子凝固和冷冻消融处理，分为冷冻30s组、冷冻60s组、30w氩等离子凝固组、60w氩等离子凝固组、正常气管组，每组8例标本。48h后行肉眼观、组织病理观察和电镜下观察，统计每种处理方式的损伤深度。 结果1、冷冻30s组和冷冻60s组损伤深
2、度均达气道软骨浅层；2、电镜下冷冻30s组见软骨细胞变性，冷冻60s组见多数软骨细胞变性，偶见软骨细胞坏死。3、30w氩等离子凝固术组和60w氩等离子凝固术组损伤深度均达软骨层，两组软骨层细胞多数坏死；4、60w氩等离子凝固术组气管软骨层细胞和基质比30w氩等离子凝固术组坏死程度严重。结论 1、本研究结果提示在气道腔内介入治疗中接近气管壁时，应用氩等离子凝固术可造成气道壁的严重损伤，功率越高，这种危险性越大，甚至可达气管壁全层从而造成气道壁塌陷。2.冷冻治疗亦不是绝对安全，当接近气管壁时，随着冷冻时间的延长亦可造成气道壁软骨的损伤，本研究提示冷冻30s虽然在光镜下未见明显的软骨细胞损伤，但在电
3、镜下即可在部分动物见到软骨细胞变性，提示在气道腔内介入治疗中接近气管壁时冷冻治疗最好控制在30S以内。【关键词】 氩等离子凝固术，冷冻消融术，犬气管，急性损伤 基金项目：首都临床特色应用研究（Z121107001012128）作者单位：100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院呼吸科通信作者：张杰，Email: A Prospective Experimental Study to Observe the Acute Injury Applied by Argon Plasma Coagulation and Cryoablation in Dog AirwayZHANG Ying-yi
4、ng, ZHANG Jie, WANG Juan, XU min, PEI Ying-hua, WANG Yu-ling, WANG Ting, ZHANG Chen-yang, Department of Pulmonary Medicine, Beijing Tian Tan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050,ChinaCorresponding author: ZHANG Jie，Email: 【Abstract】 Objective To compare the depth and degree of the a
5、cute injury in normal trachea caused by ways of argon plasma coagulation (APC) in different powers（60w、30w） and cryoablation in different duration(30s、60s) , furthermore, to detect the effect and safety of four methods above applied in normal trachea. Methods Eight normal bronchus of canine are inju
6、red by means of argon plasma coagulation and cryoablation. According to the causes of injury, samples are classified to groups of freezing for30 seconds, groups of freezing for 60 seconds, groups of APC using powers of 30w, groups of APC using powers of 60w, groups of normal bronchus, and each group
7、 contains eight samples. 48 hours later, samples are observed by naked eyes, histopathology and ultrapathology respectly, and make statistic analysis of depth in injuries caused by every method. Results 1. Samples in groups of freezing for 30 seconds and 60 seconds are injuried to inner part of the
8、cartilage; 2. Ultrapathological findings in samples of freezing for 30 seconds are degeneration of cartilage cells. Ultrapathological findings in samples of freezing for 60 seconds are degeneration of major parts of cartilage cells, and necrosis of minor parts of cartilage cells; 3. Samples in group
9、 of APC using powers of 30w and group of APC using powers of 60w are also injuried to the cartilage , major cartilage cells are necrotic in samples of both groups; 4. the degree of necrosis in layer of cartilage in group of APC60w is more severe than that in group of APC 30w. Conclusion 1. It is dan
10、gerous to treat bases of masses in airway with low power (30w) and high power(60w) in APC and cryoablation of freezing for 60s in clinical operation; 2. It is safe to treat areas of mass bases with cryoablation of freezing for 30 seconds in the period of acute injury. It needs further evidence to de
11、termine whether it is safe in the whole period; 3. The severity of injury in airway structure applied by cryoablation is related to the duration of cryoablation, the more severe of injury in airway structure, the longer of cryosurgery time; 4. The severity of injury in airway structure applied by AP
12、C is related to the energy applied in the operation of APC, the more severe of injury in airway structure, the higher energy we used. 【Key words】 argon plasma coagulation，cryoablation，airway，acute injury 氩等离子凝固术（argon plasma coagulation, APC）和冷冻消融术是在支气管镜下进行气道腔内肿物消融的常用技术。APC是通过电离的氩气将高频电流输送到靶组织，电能转化为热
13、能使靶组织在高温下被烧灼干燥；冷冻消融术是利用固体CO2转化为气体时吸收热量降低周围环境温度来损伤靶组织，二者均可达到消融病变组织的目的。这两种技术在临床操作中对组织损伤的深度通常凭借操作医师的经验来判断，在对组织的消融过程中，尤其在处理肿物根部区域时操作不当很容易引起气道的不可逆损伤。本研究拟通过观察APC和冷冻消融技术对犬气道急性损伤的深度和程度来探讨合适的气道腔内疾病的消融方法。材料与方法1 材料1.1实验对象体重13-15kg实验用杂种犬，由北京天坛医院动物房提供，有检疫合格证，雌雄不限。1.2主要实验设备库蓝K300冷冻机 北京库蓝医疗设备公司冷冻探针（直径2.4mm） 北京库蓝医疗
14、设备公司ERBE-300APC机 德国ERBE电子医疗仪器公司ERBE ICC高频电凝设备 德国ERBE电子医疗仪器公司 氩气喷管（直径2.3mm） 德国ERBE电子医疗仪器公司Olympus LF-TP纤维插管镜（内径2.6mm） 日本OLYMPUS公司Olympus BX50光学显微镜 日本OLYMPUS公司Philips EM2085透射电子显微镜 日本Philips公司1.3 主要实验试剂 陆眠宁II（1.5ml/支） 吉林省华牧动物保健品有限公司3%戊巴比妥钠 武汉金诺化工有限公司甲醛 北京天坛医院病理科提供伊红 北京天坛医院病理科提供苏木素 北京天坛医院病理科提供酒精 北京天坛医院
15、呼吸科提供石蜡 北京天坛医院呼吸科提供PBS缓冲液 北京天坛医院电镜室提供2.5%戊二醛 北京天坛医院电镜室提供1%锇酸 北京天坛医院电镜室提供2 方法本研究动物实验人员具有动物实验资格证，动物饲养室清洁，单笼饲养，饲料由北京天坛医院动物房统一提供。2.1术前准备 术前禁食6-8小时，术前1小时麻醉，全麻，麻醉方法为速眠新肌内注射，剂量为1ml/kg体重，20分钟后3%戊巴比妥钠腹腔内注射，剂量为0.3ml/kg体重。2.2实验方法2.2.1 实验分组 按处理方式不同分为冷冻30s组、冷冻60s组、APC30w组、APC60w组及未做任何处理的正常气管组，每组有8例标本。2.2.2 预实验 用
16、于评估在同一条犬的气道中行两种及两种以上气道处理是否可行。 杂种犬称重，全麻，隆突上5cm行60wAPC1秒、15cm行冷冻60s处理气道半周，48h后处理犬精神状态良好，未见并发症，处死，分别在距离两处损伤处气管2cm处取气管标本，送检组织病理，以评估各处理方式波及范围情况。2.2.3 实验步骤 杂种犬称重，全麻，隆突上5cm、10cm、15cm、20cm处分别随机行冷冻30s、冷冻60s、30wAPC每点1s、60wAPC每点1s处理，每次处理均损伤气管半周。每种处理方式采集8例标本。2.2.3.1 冷冻30s操作过程 冷冻探针与冷冻机的探针接头连接完好，在气管插管镜的协助下，探针末端进入
17、气管，探针末端与与气管粘膜表面呈切线方向接触，踩踏踏板开关，同时秒表计时，30s时松开踏板，自然状态下复温，在相距约5mm处再次冷冻30s，如此反复，共冷冻气道半周。2.2.3.2 冷冻60s操作过程 冷冻探针与冷冻机的探针接头连接完好，在气管插管镜的协助下，探针末端进入气管，探针末端与与气管粘膜表面呈切线方向接触，踩踏踏板开关，同时秒表计时，60s时松开踏板，自然状态下复温，在相距约5mm处再次冷冻60s，如此反复，共冷冻气道半周。2.2.3.3 APC30w操作过程 APC机线路连接及电极板连接完毕，氩气喷管与APC机接头连接完好，在气管插管镜的协助下，氩气喷管末端进入气管，到达预定部位，
18、APC机功率调整为30w，在距离气管粘膜2cm处喷射1s后停止，在距离此处约5mm处再次行APC1s，如此反复，处理气道半周。2.2.3.4 APC60w操作过程 APC机线路连接及电极板连接完毕，氩气喷管与APC机接头连接完好，在气管插管镜的协助下，氩气喷管末端进入气管，到达预定部位，APC机功率调整为60w，在距离气管粘膜2cm处喷射1s后停止，在距离此处约5mm处再次行APC1s，如此反复，处理气道半周。2.2.4 术后观察 48h后处死杂种犬，取气管全段，肉眼观损伤处，再分别取损伤部位气管全层送检组织病理，其中每种处理方式各3例兼送检电镜观察，并在隆突部位取正常气管送检组织病理。2.3
19、 统计分析 将每种处理方式组的8个标本按损伤深度达粘膜层、粘膜下层、软骨层、外膜层分别标记，统计每组的标本达各层深度的数量，行多组有序秩和检验，P0.05为差异有统计学意义。3 结果3.1在预实验中，距离60wAPC和60s冷冻处理部位2cm处气管与正常气管相比无差别，组织病理标本如下：正常气管距离60wAPC处理部位2cm处气管距离60s冷冻处理部位2cm处气管气管全层或内侧三层（40）(40)(40)粘膜及粘膜下层（100）（100）（100）3.2处理48h后各组标本肉眼观肉眼观正常气管冷冻30s 冷冻60s APC30wAPC60w3.3处理48h后各组标本组织病理学的HE涂片描述如下
20、：冷冻30s组冷冻60s组30wAPC组60wAPC组粘膜层8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱，剥脱范围较冷冻30s组大8例标本均出现粘膜上皮不完全剥脱，残留粘膜仅剩单层上皮细胞3例标本见粘膜上皮完全剥脱，5例见残留少量单层粘膜上皮粘膜下层8例标本均出现炎细胞浸润；8例均出现血管扩张，2例见红细胞溢出8例标本均出现炎细胞浸润，数量均较冷冻30s多；8例均出现血管扩张，2例见红细胞溢出，1例红细胞溢出数量多8例标本粘膜下层正常结构消失，成纤维细胞减少；少量炎细胞浸润8例标本粘膜下层正常结构消失，基质大部分呈均质状，成纤维细胞减少；炎性渗出明显软骨层8例均出现软骨浅层
21、约1-2层软骨细胞变性，余层软骨细胞形态正常8例均出现软骨浅层2-3层软骨细胞变性，表现同冷冻30s组，其中2例见变性达1/2层4例标本见软骨浅部1/4层软骨细胞变性，可见软骨细胞坏死，4例标本软骨浅层1/3层软骨细胞变性，可见软骨细胞坏死3例标本软骨1/2层软骨细胞变性、坏死，5例标本软骨2/3层软骨细胞变性、坏死外膜层8例外膜结构均正常8例外膜结构均正常8例外膜结构均正常7例外膜结构正常，1例外膜有少量炎细胞浸润处理48h后各组标本组织病理学的HE涂片直观图如下：冷冻30s组冷冻60s组APC30w组APC60w组气管全层或内侧三层（40）粘膜下层（100）粘膜上皮不完全剥脱，粘膜下层间质
22、内少量炎细胞粘膜上皮不完全剥脱，粘膜下层间质内较多炎细胞粘膜层不可见，粘膜下层正常结构消失粘膜层不可见，粘膜下层间质呈均质样改变软骨层（100）软骨浅层1-2层可见部分软骨细胞轮廓不正常软骨浅层3层部分软骨细胞轮廓不正常软骨浅层部分正常结构消失软骨层2/3正常结构消失3.4处理48h后各组标本电镜下结果描述如下：冷冻30s组冷冻60s组30wAPC组60wAPC组粘膜层3例标本中1例见粘膜上皮细胞，微绒毛消失，余未见粘膜上皮细胞3例标本均未见粘膜层3例标本均未见粘膜层3例标本均未见粘膜层细胞粘膜下层成纤维细胞细胞核固缩，胞浆内线粒体肿胀；胶原纤维见部分结构不清可见坏死纤维细胞，部分胶原纤维结构
23、不清，可见毛细血管内红细胞瘀滞纤维细胞部分崩解，轮廓消失，间质内可见核碎片；胶原纤维部分结构不清，血管内皮细胞崩解坏死，炎细胞数量多纤维细胞坏死，胶原纤维呈均质样改变；间质内大量成堆核碎片，细胞密度明显减少软骨层部分软骨细胞脂肪变性，部分软骨细胞内细胞器减少，所见细胞细胞膜均完整软骨细胞大部分脂肪变性、空泡变性、核固缩，偶见坏死崩解细胞轮廓软骨细胞密度减低，所见软骨细胞大部坏死，可见脂肪变性细胞软骨细胞密度减低，所见软骨细胞均坏死，部分仅存细胞轮廓外膜层纤维细胞结构正常，胶原纤维大致正常纤维细胞大致正常，偶见纤维细胞空泡变性，部分胶原纤维正常结构消失细胞密度减低，纤维细胞坏死，胶原纤维正常结构
24、消失间质内细胞少，大量核碎片，胶原纤维均质状，偶见胶原纤维轮廓电镜下气管各部位正常结构如下： 粘膜上皮细胞（0.7k） 胶原纤维（6.0k） 纤维细胞（2.0k） 毛细血管（1.0k） 软骨细胞（0.5k）处理48h后各组标本电镜下结果直观图：冷冻30s组冷冻60s组30wAPC组60wAPC组粘膜层粘膜上皮上的微绒毛消失（0.7k） 未见粘膜层未见粘膜层未见粘膜层粘膜下层胶原纤维结构模糊（6.0k）纤维细胞内线粒体肿胀、细胞核固缩 （2.0k）胶原纤维结构模糊（6.0k）纤维细胞坏死（2.0k）毛细血管内红细胞瘀滞（1.0k）胶原纤维结构模糊 （6.0k）纤维细胞坏死（2.0k）血管内皮细胞
25、核崩解间质内见核碎片（1.2k）胶原纤维呈均质样改变（6.0k）纤维细胞坏死（2.0k）间质内成堆核碎片（1.0k）软骨层软骨细胞脂肪变性（0.5k）软骨细胞坏死（0.5k）大部分软骨细胞变性（0.5k）软骨细胞坏死（0.5k）软骨细胞变性（0.5k）软骨细胞坏死，核消失（0.5k）外膜层纤维细胞结构正常（0.7k）纤维细胞变性，胶原纤维结构模糊（0.7k）细胞密度降低，纤维细胞坏死（0.7k）正常细胞结构消失，见大量核碎片（0.7k）3.5处理48h后各组标本损伤深度统计（组织病理切片和电镜结合评估） 粘膜层 粘膜下层 软骨浅1/2层 软骨深1/2层 外膜层 冷冻30s组 8冷冻60s组 6
26、 230wAPC组 860wAPC组 7 1采用有序多分类资料秩和检验，H=24.35，20.05，3=7.81524.35, P4.17，P0.05,表示前三种处理方式的损伤深度无统计学差异。4 讨论气道良恶性肿瘤及其它原因引起的气道肿物由于生长于气道，腔内操作风险大。近年来随着冷冻、激光、氩等离子体凝固等技术的应用和经验积累，经支气管镜的腔内治疗方法的临床应用越来越多，在具体操作上包括选择能量、操作时间等多借鉴国外的方法及凭借操作医师的经验治疗，各医院在临床操作上各有差异，给处理后的临床疗效和并发症发生情况带来了不确定性。本文就临床应用较多的氩等离子体凝固术和冷冻消融术在不同的操作时间、使
27、用能量等具体操作上所造成的急性期损伤程度通过动物实验寻找证据，从而为临床操作提供借鉴。氩等离子体凝固术（argon plasma coagulation，APC）最初应用于外科手术，用于术中止血，1991年由ERBE公司引入消化内镜介入领域，1994年在德国首次应用于呼吸内镜下介入治疗。其原理【1】，【2】是氩气喷头和靶组织保持一定距离，高频电压在喷头和靶组织间形成较强的电场，氩气喷出后在强电场作用下形成氩等离子流，此离子流引导电流到达组织表面，电流引起的热效应使组织失活、凝固坏死。通常认为，电流使表面组织坏死后由于组织干燥失去传导性，阻止电流进一步破坏深部组织，因此APC对组织破坏较浅表。国
28、内有报道【3】称其组织穿透力仅2-3mm。国外则报道【4】其凝固深度与作用时间和功率有关系，作用2秒钟凝固深度可达2mm，3秒钟时可达3mm，较长时间才达到4mm。Guenter Farin等【1】提到肉眼观察到的损伤深度为凝固组织的深度，最大3-4mm，而在组织发生凝固前会先表现为组织失活，失活的组织肉眼难以将其与正常组织区分，也就是说，组织凝固的深度并不代表组织受影响的深度。在谈及APC在不同组织的操作方法时Guenter Farin表示APC应用于气管支气管时如使用直径1.5mm的细电极，最大功率为40w，单次启动作用时间1-5秒钟，如使用直径2.3mm的粗电极，最大功率60w，单次启动
29、作用时间1-5秒钟。我国在治疗气道肿物时常用的APC采用直径2.3mm的电极，功率为20-40w，单次启动作用时间为1-3秒钟【5】，【6】。本实验采用粗电极，选择了30w低能量和60w高能量两种功率，单次启动作用时间为1秒钟。在本次所报道的实验之前采用过单次启动作用时间为3秒钟，烧灼气管壁半周，48小时后观察，不论是功率为30w的低能量还是60w的高能量均出现了气管壁穿孔的现象，软骨断裂。因此推断单次启动作用时间为3秒钟在烧灼气道肿物根部时是不可行的。在判断APC和冷冻消融这两种处理方法是否可行方面就本实验而言，主要考虑此方法对气管壁的损伤有无达到软骨层水平，因为气管的主要生理功能【7】是维
30、持气道通畅，保持肺组织与外界大气相通，气管软骨起到了支撑气道的作用，在各种原因引起的气管破坏损伤患者需要人工气管时除了考虑组织相容性外，主要考虑了其横向具有刚性纵向具有韧性的类似气管软骨所起的作用，也就是说易弯曲成形但不易塌陷。此外还应避免成纤维细胞向腔内长入【8】，这要求在对气道壁进行有创操作时，粘膜下层的纤维结缔组织所受损伤也是一大问题，需要考虑。本实验评估的是急性期气道损伤情况，查阅文献【9】后考虑设立观察时间为48小时较为合理。实验中APC采用30w和60w功率时均采用单次启动作用时间为1秒钟，48h后将处理部位气管壁全层送检病理，HE染色后通过显微镜观察发现损伤在软骨层，电镜下更清晰
31、见到软骨细胞坏死，尤其是60wAPC软骨细胞成片坏死，考虑在处理气道肿物蒂部时APC对正常气管损伤较大，不推荐使用。冷冻消融术在气道内的应用较APC早，早在1968年Gage AA【10】将冷冻技术应用于咽部肿瘤的治疗。冷冻消融术的原理是11在低温下细胞内水分发生冻结，尤其是快速冷冻时水分未进行细胞内外交换直接由液体状态变为固体状态，而缓慢冷冻时细胞内水分会向细胞外转移，细胞内盐浓度升高细胞内的溶液的冰点随之降低，复温时尤其在缓慢复温时细胞内固体状态的小冰晶在融化过程中会发生迁移和相互摩擦，致细胞器发生致命的机械性损伤。冷冻对组织的损伤一方面来自对细胞的直接损害，另一方面来自对微循环的破坏和重
32、建失败【12】。冷冻消融术在气管内应用时国外一般采用液氮或氧化亚氮作为冷冻源，处理气管肿物时探头末端与靶组织成切线方向接触，也有的操作将冷冻探针插入到肿物内部以增大冷冻面积。采用氧化亚氮作为冷冻源，冷冻20秒13，可在同一部位行3次冷冻-消融循环【14】。国内采用固体CO2作为冷冻源，最低温度为-79【11】，冷冻探头金属末端距支气管镜末端5mm，探头末端与靶组织成切线方向接触，启动开关，冷冻30s，冷冻次数视肿物大小坚硬程度而定，有报道在同一部位重复此冷冻-复温过程2-3次【15】，甚至有在同一部位反复冷冻3-5次的报道【16】。关于冷冻损伤范围和深度在冷冻处理后逐渐扩大和加深，冷冻损伤的最
33、终边界形成有报道【17】称在30分钟到48小时之间，48小时后冷冻组织与正常组织之间的分界清楚，不再迁移。冷冻损伤的程度随时间延长而加深。急性期一般为48小时【9】。本实验所采用的冷冻消融方法是以固体CO2为冷冻源，冷冻探头与气管壁内膜呈切线方向冷冻，冷冻气管壁半周，每一冷冻部位行1次冷冻消融循环，相邻冷冻部位相距约5mm。根据国内文献报道，本实验采用冷冻30秒的冷冻方法，为便于比较损伤深度，寻找恰当的冷冻时间，还选取了冷冻60秒的操作。根据组织病理学观察结果，两种冷冻操作均能损伤到气管软骨层，电镜下证实冷冻60秒组标本观察到了软骨变性，少量软骨坏死的情况，考虑到软骨坏死为不可逆损伤，不推荐在
34、临床操作中气管肿物根部使用冷冻60秒的操作，以免对正常气管软骨造成不可逆的损伤。电镜下观察冷冻30秒组标本时见到软骨脂肪变性、水样变性，均系可逆性损伤，损伤是否朝着不可逆的方向发展还有待进一步观察，48小时的观察不足以得出结论。根据本实验统计各处理组的损伤深度，冷冻消融和氩等离子凝固术相比，除功率为60w的APC外，冷冻30秒组、冷冻60秒组、30wAPC组差异无统计学意义（P0.05），均在软骨浅层。但是从损伤破坏的程度看，APC组破坏力明显大于冷冻组，电镜下观察APC组软骨坏死量多，胶原可见均质样改变，冷冻组除了冷冻60秒组偶见软骨坏死外，余均为变性改变，胶原大多为结构改变，但轮廓可见。5
35、 结论本研究结果显示应用氩等离子凝固术、冷冻作用于犬正常气道壁，均可造成其粘膜层、粘膜下层、软骨层及外膜层的不同程度的损伤，其中高功率（60w）氩等离子凝固术在部分动物损伤深度穿透了气道壁全层、达到了外膜层。而低功率（30w）氩等离子凝固术、冷冻30s 与60s在部分动物亦达到了软骨层，而以氩等离子凝固术对软骨的破坏程度较为突出，冷冻60s一组亦可见在部分动物的气道软骨发生坏死，但破坏程度较氩等离子凝固术轻，而冷冻30s组则仅在电镜下见软骨细胞变性。由此得出如下结论：1、临床上在气道腔内介入治疗中接近气管壁时，应用氩等离子凝固术可造成气道壁的严重损伤，功率越高，这种危险性越大，甚至可达气管壁全
36、层从而造成气道壁塌陷。2.冷冻治疗亦不是绝对安全，当接近气管壁时，随着冷冻时间的延长亦可造成气道壁软骨的损伤，本研究提示冷冻30s虽然在光镜下未见明显的软骨细胞损伤，但在电镜下即可在部分动物见到软骨细胞变性，提示在气道腔内介入治疗中接近气管壁时冷冻治疗最好控制在30S以内。参考文献1 Guenter Farin, Alessandro Zambelli, Paolo Botta, et al. 刘斌译. 氩等离子体凝固在内镜下的临床应用. 中华消化内镜杂志.2003,20(5):353-3542 张杰，党斌温，郭伟等. 氩离子束凝固术治疗气道腔内病变的价值. 中国内镜杂志 2007，13（1）
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