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1、辣椒组织培养姓名：XXX学号：XXXXXXXXXXXXX班级：XXXXXXXXX指导老师:XXX 时间:2010年9月13日11月19日目录第一章:前言. 3 1.1 理论起源. 3 1.2植物组织的培养方法. 3 1.3植物组织培养的优点. 3 1.4目的和要求. 4 1.5实验原理. 4第二章:材料与方法. 5 2.1实验器材和试剂. 5 2.2培养基的灭菌. 8 2.3药品及试剂. 7 2.4实验方法. 7第三章:实验结果. 10 3.1辣椒籽的生长. 10 3.2辣椒愈伤组织的生长. 11 3.3炼苗与移栽. 13第四章:实验结果讨论. 13 4.1图片分析. 13 4.2实验经验总结
2、. 14参考文献. 15第一章 前言1.1 理论起源19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从美国传向世界各地，美国植物学家斯蒂瓦特等人，用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，这一植株能够开花结果证明了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。11.2 植物组织的培养方法1、非试管微组织快繁 非试管微组织快繁技术是将外植体（一般要求带一叶一芽）放置在室内外普通沙子培养基上进
3、行培养，利用植物腋芽自然倍增达到快速繁殖的目的。一般植物715天可以生长出根系。此技术投资低，操作环节少。 2、试管组织培养 试管组织培养是将外植体（即离体组织、器官或细胞）放置在试管等器皿中在无菌的条件下进行组织培养获得试管苗。 1.3 植物组织培养的优点：1、占用空间小，不受地区、季节限制。 2、培养脱毒作物 3、培养周期短 4、可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品 5、可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物 6、可诱导之分化成需要的器官，如根和芽 7、解决有些植物产种子少或无的难题， 8、不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征 9、投资少，经济效益高 10、繁殖方式多，试用品种多1.4 目
4、的和要求了解植物组织培养的操作程序；初步掌握植物组织培养的关键技术（培养基配制、灭菌、无菌操作、培养等）。验证何种生长素浓度最适于辣椒愈伤组织的生长。1.5 实验原理器官分化植物组织培养是指植物的器官、组织或细胞，在人工控制的条件下，接种在人工合成的培养基上，能发育成完整的植株，这就是所谓的植物细胞的全能性植物的任何一个体细胞，具有完整的细胞核，就具有整套的遗传信息，在一定的条件下能发育成完整植株。全能性的实现是通过脱分化和再分化过程来实现的：脱分化再分化 分化的细胞 分生状态 再生植株（外植体） 体细胞胚用于培养的器官、组织、细胞通称为外植体，它们的细胞是高度分化的，培养的第一步就是要诱导这
5、些已分化的细胞脱去分化状态（称去分化或脱分化），使其恢复到未分化的分生状态；第二步是要使这些恢复到分生状态的细胞重新分化（再分化）形成植株。第一步称诱导培养，第二步称分化培养。2生长激素:6-BA:主要功能：6-BA具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点,因而被广泛采用,并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生。可用于提高茶叶、烟草的质量及产量；蔬菜、水果的保鲜和无根豆芽的培育，明显提高果品及叶片的品质。3 NAA:主要功能:适用于谷类作物，增加分蘖，提高成穗率和千粒重；棉花减少蕾铃脱落，增桃增重，提高质量。果树促开花，防落果、催熟增产。瓜果类蔬菜
6、防止落花，形成小籽果实；促进扦插枝条生根等。4第二章 材料与方法2.1 实验器材和试剂实验室一般由三部分组成：预备室、无菌室（接种室）、培养室。预备室进行清洗、培养基的配制和灭菌，外植体初步处理等工作；无菌室是最重要的，要求隔离、干净、无菌，以完成外植体的接种工作；培养室要求光照、温度、湿度能人工控制，以利于外植体的生长、发育，此外，还需注意的是，植物组织培养室不要与微生物实验室混用，那样会增加交叉污染。器材：并无特殊的，高压灭菌锅、超净工作台等，与微生物实验室相同，其他如天平、冰箱、玻璃器皿等与化学实验室相近。药品：用于配制培养基的试剂，要用AR级，以减少杂质对培养物的不利影响。52.1.1
7、 培养基的配方培养基是组织培养能否成功的关键，随着研究工作的进展，培养基的种类越来越多，但其组成主要有以下部分：MS培养基及其贮备液 （mg/L）培养基 贮备液NH4NO3 1650 33000KNO3 1900 38000CaCl2.2H2O 440 20 8800MgSO4.7H2O 370 7400KH2PO4 170 3400KI 0.83 166H3BO3 6.2 1240MnSO4.4H2O 22.3 200 4460ZnSO4.7H2O 8.6 1720Na2MoO4.2H2O 0.25 50CuSO4.5H2O 0.025 5CoCl2.6H2O 0.025 5FeSO4.7H
8、2O 27.8 5560Na2.EDTA.2H2O 37.3 200 7460肌醇 100 20000烟酸 0.5 100盐酸吡哆醇 0.5 200 100盐酸硫胺素 0.1 20甘氨酸 2 400 把FeSO4.7H2O和Na2.EDTA.2H2O分别置于450 ml水中，加热、溶解，然后将2种溶液混合，调pH 5.5，再加水到1L用力振荡12分钟，避光保存。2.1.2 培养基的配制1.母液配制可以按培养基的配方，称取各种试剂、逐一溶解，但这种方法比较麻烦，且有的用量很少、难准确称取。一般地都是按一定比例配制成母液贮存起来，用时按比例稀释，以MS基本培养基为例，配制4种母液：配制母液时要注意
9、：称量准确，按顺序逐一溶解、容量并定容，低温保存。称量准确和定容是保证培养基中各元素的量的准确，因为母液是20200浓缩的，这一步不准确，后面的误差就越来越大；按顺序逐一溶解主要是使钙离子、锰离子与硫酸根和磷酸根离子错开，以免发生沉淀。激素一般配制成0.51.0 mg/mL的贮备液，生长素类先用95酒精或0.1 mol/L的NaOH溶解；细胞分裂素先用0.51.0 mg/L的HCl 或稀NaOH溶解，然后加水定容。2.培养基配制步骤配制含琼脂0.7、糖3的MS培养基200mL:称取琼脂1.4g，蔗糖6 g500mL大烧杯中加150mL左右的水，加入琼脂，加热溶化，再加糖加入贮备液10mL，1m
10、l， 1 ml， 1 ml加水到200m L，用HCl 或NaOH 调pH趁热分装到试管中，封口灭菌注意：动作要快，在定容是琼脂可能会出现凝固现象需要在之前准备好的灭菌材料：滤纸、培养皿、纯水、手术刀、镊子、培养基、枪头。2.2 培养基的灭菌（1）打开灭菌锅盖，向锅内加水。（2）加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要靠近锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。（3）加盖旋紧螺旋。（4）打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5 min，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升，上升到压力表读数为1.1 kgfcm-2或0.1 MPa，121
11、时，保持15 min左右即可。2.3 药品及试剂 琼脂、蔗糖、蒸馏水、四种贮备液、次氯酸钠溶液、NAA、6-BA2.4 实验方法2.4.1 植物组织培养(一):诱导培养1.培养基的制备.(1)制备:MS培养基含有较高的硝态氮和铵态氮,适合于多种培养物的生长.首先,将MS培养基配制成4种母液,低温保存.(2)制备:配置200mLMS培养基需加入0.7%琼脂,3%蔗糖,配置步骤为:在500mL大烧杯中加入约150mL左右的水,加入琼脂,加热融化,再加蔗糖,加热至彻底融化后,分别加入储备液10mL,储备液1mL,储备液1mL,储备液1mL。然后加水至200mL，用HCl或NaOH调制pH至5.8，趁
12、热分装到15只平底试管中,封口,准备灭菌。2.灭菌.(1)打开灭菌锅,向锅内加水。(2)将待灭菌物品放入锅内,不要放得过多,物品不要靠近锅壁。(3)加盖旋紧螺旋。(4)打开放气阀,加热,自开始产生真气后5min,再关紧放气阀,此时锅内的冷空气已由排气孔排尽,让温度随蒸汽压力的增高而上升,上升到压力表读数为1.1kgfcm-2,121时,保持15min左右即可。3.辣椒籽培养.将已灭菌好的物品及经过多次清洗的辣椒籽放入无菌操作室,准备。(操作前注意关掉紫外灯,用酒精棉球擦手。)(1) 准备四个平皿,其中三个平皿装上蒸馏水,一个平皿放滤纸。(2) 辣椒籽泡于次氯酸钠溶液中10min,拿起分别用蒸馏
13、水漂上三次,然后用滤纸擦干。(3) (在酒精灯旁操作)将灭菌好的辣椒籽放入培养基,一个培养基里放四个辣椒籽。(4) 将十五个试管每三只包扎好,做上标记,放入培养箱。(32 24小时光照)（时间为2010年9月14日至2010年10月11日）2.4.2植物组织培养(二):分化培养植物组织培养:将植物器官的一部分切下来,放在适当的人工培养基上进行培养,这些器官或组织就会进行细胞分裂,形成新的组织。这种组织没有发生分化,只是一团薄壁细胞,叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下,愈伤组织便开始分化,产生出植物的各种器官和组织,进而发育成一颗完整的植株。61.准备 配置300mL
14、MS培养基,分装到15个平底试管中,塞上塞子(注意精确每只平底试管的培养基量)。包扎好,准备灭菌。2.处理. (在无菌操作室中进行)取MS培养基所得的辣椒幼苗茎尖1cm,若有污染则进行茎尖消毒。将十五个培养基分三只为一组,按照MS和6-BA不同浓度为分组。(见表2-1)表2-1NAA6-BAA0.3mg/L1.0mg/LB0.1mg/L1.0mg/LC0.5mg/L1.0mg/LD0.3mg/L2.0mg/LE0.3mg/L3.0mg/L采用正交试验设计方法探讨6-BA、NAA对辣椒一步成苗影响的结果表明:6-BA与NAA的浓度比对生芽诱导的影响最大。筛选出的辣椒一步成苗的最适培养基为MS+1
15、.0mgL-16-BA+0.5mgL-1NAA并获得移栽后的成活植株。73.培养 6-BA及NAA要趁培养基还未凝固时加入,摇匀。 待培养基凝固后,将处理好的辣椒茎尖放入每个培养基,塞上塞子,做好标签,包扎好,放入32培养箱培养。 （时间为2010年10月11日至2010年10月18日）2.4.3植物组织培养（三）：生根培养 分别以辣椒茎尖、子叶、上胚轴、下胚轴为外植体进行离体培养,结果发现,子叶较易诱导愈伤组织.在MS附加不同浓度配比的6-BA和NAA培养基上,对子叶进行分化及生根诱导研究的结果表明,彩色辣椒子叶芽的分化受6-BA和NAA浓度的影响,最适合芽分化的培养基为MS+6-BA 3.
16、0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+NAA 1.0 mg/L。81.配制培养基 配制1/2MS培养基300mL,分装至15只平底试管,封口,灭菌。2.培养 将好的愈伤组织分装入生根培养基,注意编号,封口,放入培养箱观察。 (时间为2010年10月18日至2010年11月8日)2.4.4植物组织培养(四):炼苗与移栽1.配制培养基 配制100mLMS培养基,分装5只平底试管中,包扎准备灭菌。2.培养 选择优秀的五株生根幼苗,分别放入五只试管中,包扎好,放入培养箱培养。 (时间为2010年11月8日至2010年11月19日) 第三章 实验结果3.1 辣椒籽的生长 图
17、12010年9月14日种入辣椒籽 图2管,生出苗长分别为1cm、3.5cm、4cm、4cm 图3管.苗长为2.5cm、3cm,另两株出现黄褐色 图4管.苗长为0.5cm、3cm,其他没生长 图5管.苗长为4.5cm、5cm,其他没生长 图6管.苗长为0.5cm、3cm,其他没生长 图7管.苗长为2.5cm3株,一颗没生长 图8管.苗长为0.5cm,其他没生长,一颗出现黄褐色 图9管.苗长为2.5cm2株、3.5cm2株 图10管.苗长为2.5cm2株端底有黄色,其他没生长. 图11管.苗长为2cm、1cm、2.5cm,一颗没生长 图12管.苗长为2.5cm,出现一颗黄褐色,其他没生长3.2 辣
18、椒愈伤组织的生长 图13 A组,A-1和A-2茎尖两端切口处褐化, 图14 B组,B-1 和B-3淡绿色愈伤组织形成,黄褐色细菌污染,A-3 淡绿色愈伤组织形成. B-2一端淡绿色愈伤组织形成,另一端长出一 叶子. 图15 C组,C-1 形成黄绿色愈伤组织,C-2 一端 图16 D组,D-1 褐化,黄色细菌污染.D-2 褐化形成极少愈伤组织,另一端黄色细菌污染,C-3 淡 愈伤组织形成.D-3 褐化.绿色愈伤组织形成.图17 E组,E-1 褐化少许,少量愈伤组织.E-2严重褐化.3.2 炼苗与移栽图18 生长良好第四章 实验结果分析4.1 图片分析图8.图10.图12: 推测染菌原因：无菌操作
19、过程不够严格所致，无菌技术包括培养基消毒灭菌和植物材料（外植体）的消毒灭菌。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。在染菌后应立即将此管清洗除去，以免影响其他愈伤组织的生长。图16.图17：分别有一管出现了褐化现象，推测产生此现象的原因：1.PH值的影响，在配置培养基时，ph值没有控制好，可能是偏酸性；2培养条件不适宜温度过高或光照过强，均会使PPO的活性提高，从而加速被培养的组织褐变；3没有及时更换培养基，分化培养基中的营养成分已被吸收完.应尽快将分化培养基中的外植体转移到生根培养基中.关于褐化
20、的分析和讨论：多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。 1 褐变的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。 2 影响褐变的因素因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。 A.
21、植物种类及基因型红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。 B.外植体部位及生理状态荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。 C.培养基成分及培养条件硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。用B5培养基可有效地防止褐变。D培养条件不适宜温度过高或光照过强，均可使PPO的活性提高，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，使细胞内CO32+增多，产生褐变。 3 克服褐变的方法 A.选择适当的外植体成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材料
22、褐变的程度强。 B.对外植体进行预处理空白琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。再转移培养基2-3次，切口愈合后，褐变减轻.C.选择适宜的培养基与培养条件设置不同试验，进行选择。D.进行细胞筛选和多次转移进行细胞筛选，剔除易褐变的细胞。外植体接种后12天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移56次可基本解决外植体的褐变问题。图13、图14、图15、图16、图17:由该五幅图可以看出,B组的生长状况最佳。本次试验的目的是为了检测不同浓度比生长素对辣椒愈伤组织培养的影响。A组为6-BA 1.0mg/L,NAA 0.3m
23、g/L;B组为6-BA 1.0mg/L,NAA 0.1mg/L;C组为6-BA 1.0mg/L,NAA 0.5mg/L;D组为6-BA 2.0mg/L,NAA 0.3mg/L;E组为6-BA 3.0mg/L,NAA 0.3mg/L。故可以得出结论：生长素浓度为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L为辣椒愈伤组织生长最佳生长素浓度。4.2 实验经验总结通过观察和记录这一次辣椒组织培养实验出现的问题和现象，总结经验如下：1配制培养基时，一定要注意调节pH2外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。3配制贮备液时，应注意所取药品与所需药品是否相同。4. 无菌操作是最为关键的，预备室的
24、清洗、培养基的配制和灭菌，外植体初步处理和接种等工作；培养室要求光照、温度、湿度能人工控制，以利于外植体的生长、发育，此外，还需注意的是，植物组织培养室不要与微生物实验室混用，那样会增加交叉污染。5. 要及时的观察和记录实验结果，及时更换培养基，以免出现褐化状况。6. 要注意光照温度和培养条件对植株生长的影响，光照不宜过强，温度不宜过高，还有光线的角度可能会导致植物逆向生长。参考文献:1施莱登 (Matthias Jakob Schleiden),细胞学说 (Cell theory), 1838年.36-BA-百度百科 http:/ http:/ http:/ WANG Xu-ying ZHU Dao-yu(荷泽学院生命科学系,山东,荷泽,274015),河南农业科学(ISTIC PKU JOURNAL OF HENAN AGRICULTURAL SCIENCES),2006 (8).15