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1、酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵(马飞龙 2011级生物类创新班 11101671 联系方式 13505612965)前言酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二
2、氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。C6H12O6(葡萄糖)2 C2H5OH(酒精)+2 CO2在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PVA）海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度
3、增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。1 摘要： 酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。1关键词：酵母菌 分离鉴定 固定化 酒精发酵2 材
4、料与仪器2.1材料2.1.1酵母菌的分离与培养（1） 成熟葡萄试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml；B 液：0.0l% KOH l00ml。 混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。（2） 培养基：a.乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5。配制方法：1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右 ，制成20%的豆芽汁；2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加
5、蒸馏水定容至300 ml；3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ，20 min。 b.YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼 脂（10 g）、pH值6.56.8。 （1）乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5。配制方法：1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右 ，制成20%的豆芽汁；2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加蒸馏水定容至300 ml；3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ，20 mi
6、n。（2）YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.56.8。配制方法：1）称取酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水；2）使用HCl及NaOH调整pH值 6.56.8，加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g；3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ，20 min，冷却至50-55左右时倒入无菌平皿。 配制方法：1）称取酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水；2）使用HCl
7、及NaOH调整pH值 6.56.8，加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g；3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ，20 min，冷却至50-55左右时倒入无菌平皿。2.1.2发酵菌株的筛选培养基TTC上层培养基:TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水l00 ml:TTC下层培养基:YPG琼脂。乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g），乳酸调pH 值至4.52.1.3发酵菌株的鉴定 DNA提取需要配置的试剂高盐的TE buffer 终浓度 配制50 ml10 mM Tris.Cl, pH 8.0 0.5 m
8、l(1M 母液)0.1 mM EDTA, pH 8.0 0.01 ml(0.5M 母液)1 M NaCl 1.8 g室温可保存几年CTAB提取液终浓度 配制200 ml2%(W/V) CTAB 4 g100 mM Tris.Cl, pH8.0 20 ml(1 M 母液)20 mM EDTA, pH8.0 8 ml(0.5M 母液)1.4 M NaCl 10.22 g室温可保存几年 10CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7 M NaCl)在80 ml H2O中溶解4.1 g NaCl，缓慢加入10 g CTAB，同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65溶解。定容至100 ml。 其它化学
9、试剂：异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物。2.1.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术a培养基：（1）酵母膏0.15 g，葡萄糖20 g，(NH4)2SO4 0.2 g，K2HPO43H2O 1 g，MgSO47H2O 0.25 g， pH 值7.0，去离子水定容至1000 ml，115 灭菌15 min。（2）葡萄糖培养液：酵母膏0.15 g，(NH4)2SO4 0.2 g，无水葡萄糖20 g，K2HPO43H2O 1 g，MgSO47H2O 0.25 g，pH值为6.56.8，蒸馏水定容至1000 ml， 115 灭菌20 min。b试剂：1）2 % CaCl2溶液，121
10、灭菌15 min。 2） 聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶：称量PVA 8 g、海藻酸钠 2g放入100 ml去离子水中，沸水浴加热溶解，并室温下密封存放24 h后使用。2.1.5酿酒酵母的酒精发酵a、 菌种材料：酿酒酵母b、 酒精发酵培养液：红糖100 g， (NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO4 1.0 g，pH自然，去离子水定容至1000 ml,。150 ml小三角瓶装上述培养基50 ml，250 ml三角瓶装100 ml，大试管中装10 ml，包扎，115 灭菌30 min。c、 溶液或试剂：10% H2SO4 ，1% K2Cr2O7 ，10% NaOH2.2仪器烧杯、玻璃棒、三角
11、瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜 、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片、平皿、杜氏小管、接种针、移液枪（10、100、1000l）,0.2 ml PCR管，枪头，2 ml eppendorf管，饭盒、250 ml烧杯、无菌的250 ml、500 ml三角瓶、注射器、试管（内装一倒置的杜氏小管）、滴管、培养箱3. 方法与步骤3.1酵母菌的分离与培养21、富集培养：取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培
12、养。置2830培养箱中培养20-24小时。2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。3、镜检：取少许富集的菌液观察酵母菌的形态。4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml富集菌液，加入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。再用1 ml无菌枪头，吸取10-1稀释
13、液0.5 ml，移入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。同样做法再一次，做成10-3稀释液。5、倒平板培养：倒YPG培养基平板，凝固待用。用无菌枪头分别吸取10-2、10-3浓度的稀释液0.1 ml于YPG平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌面30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置2830 再培养24 h或稍长(过长则霉菌长出) 。6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的酵母菌菌落，用接种环挑取一环的酵母菌，在YPG平板中采用划线分离法分离酵母菌。并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。涂片镜检，菌
14、落观察。7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 下保存。 3.2发酵菌株的筛选3（l）酵母菌一级筛TTC法: 将分离得到的各菌株依次接入TTC下层培养基的平皿中，每个平板接810株，培养24 h，长出菌落然后倒入TTC上层培养基，30 下保温(阴暗处)23 h。比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。选取原始平板中对应的颜色较深的1020株菌，作为二级筛的出发菌株。（2）酵母菌二级筛杜氏小管观察法选取上述显色较深的酵母菌落（同时接种一颜色较浅的菌落作为对照），挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管，
15、培养24 h后，观察杜氏管中产气情况。打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。记录产气及酒精气味情况，并于显色情况进行比较。根据杜氏小管中产气多少分为5个等级:(1)“+”表示杜氏小管中充满气体；(2)“+”表示杜氏小管中充满3/4气体；(3)“+”表示杜氏小管中充满1/2气体；(4)“+表示杜氏小管中充满l/4气体；(5)“一”表示杜氏小管中没有气体。3.3发酵菌株的鉴定41.形态学鉴定：A菌落形态观察按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。B. 细胞形态学观察 按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。2.分子生物学鉴定： （1）酵母DNA的提取（CTAB
16、法提取真菌基因组DNA）51) 取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800 l 2% 65保温的2CTAB抽提液，混匀，65保温3060 min。2) 加入800 l的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000 r/min，离心5 min。3) 取上清(约600 l)，加入1/10体积（约60 l）的65的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。4) 用等体积(约600 l)的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000 r/min，离心5 min。5) 取上清(约450 l)，加入0.8 V的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20保温10
17、20 min）。6) 4，12000 r/min，离心10 min。7) 去上清，用高盐的TE buffer重悬（约100l）。（可65保温30 min，至大部分溶解）。8) 加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20保温1020 min），4，12000 r/min，离心15 min。9) 去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬（3060l）。（2）DNA质量检测以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。 DNA浓度
18、计算：（3）PCR扩增6 核糖体 DNA 普遍存在于生物中, 真核生物的核糖体 RNA 中包括 26S、 18S、 5.8S 和 5S 4 种不同沉降系数的核糖体 RNA 片段, 它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性, 同时由于各种原因具有一定的突变, 使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。 早期一般选取大小适中的 18S 序列作为鉴定的标准, 随后 26S 的 D1/D2 区序列和 ITS 序列也被用于应用于鉴定工作中(图1)。本实验使用ITS 序列进行鉴定，包括ITS1和ITS2 两个转录间隔区。PCR反应引物使用ITS1(5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG
19、-3 )和ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 )。图1 真核生物钟编码核糖体的序列（5- 3）取一PCR管，按下述PCR体系加入PCR扩增所需的试剂：ddH2O10PCR buffer（without MgCl2）MgCl2 (25 mM)dNTP(10 mM)5primer(10 mM)3primer(10 mM)Template（50 -500 ng/l）Taq DNA polymerase(5U/l)34.6 l5 l4 l1 l2 l2 l1 l0.4 lTotal50 l将上述加样后的PCR管放到小离心机低速甩一下，放入PCR扩增仪进行扩增。扩增反应程序按如
20、下设定：94预变性 5 min94变性 30 sec52退火 30 sec 40个循环72延伸 60 sec72延伸 5 min4保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）（4）PCR扩增检测以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增是否有所想要的大小的目标条带，大概浓度如何。（5）测序将符合要求的样品（选5-6个），按公司测序订单要求填写。（测序一般可以分为将PCR扩展目标DNA连接到T载体上和直接利用PCR产物测序两种方法，本方法采用直接利用PCR产物测序，需要自己提供测序引物）（6）生物信息学分析方法演示使用软件Bioedit 除去测序不可靠部分及无用的部分，然后登陆NCBI网站，进
21、行在线比对分析。4.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术7 1、 菌种活化：挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24 h，25 培养30 h。然后按10%接种量进行扩大培养，将扩大培养后的菌液10000r/min，离心15min，倾去上清液，用0.85%生理盐水离心洗涤3次，再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。2、 固定化：聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45 左右。酵母菌液（预热至35 左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1: 4比例（v/v）混合均匀
22、后，制备固定化细胞。用注射头直径为2 ml注射器以恒定速度滴到250 ml三角中，瓶中预先盛有50 ml的含2 % CaCl2溶液使形成凝胶珠。3、 待凝胶珠在溶液中浸泡0.5-6 h；置于温度4，过夜平衡。然后取100粒凝胶珠加入150 ml无菌葡萄糖培养液中，置25 下发酵7-9 d。发酵结束后品尝其口味，测定其酒精含量。4、 固定化颗粒强度测试：挑选50 个颗粒均匀的固定化小球，放于500 ml的烧杯中，加水100 ml。以5003000 r/min 的速率搅拌5 min，观察小球的直径变化和破损情况,以此来描述小球的强度。 5、 颗粒膨胀性测定：取数粒大小均匀的固定化小球在4 的去离子
23、水 中浸泡24 h，用游标卡尺测量浸泡前后的颗粒平均直径的变化，计算颗粒的膨胀 性。83.5酿酒酵母的酒精发酵 1、液体种子的制备和发酵液的接种培养：1）取活化培养的酵母斜面菌种一满环，接入150 ml小三角瓶的种子液中，2830 培养箱中保温培养24 h，此即三角瓶液体种子。2）将上述液体种子以5 %接入250 ml三角瓶中的待发酵液中。3）放入2830 培养箱中培养2436 h后观察结果。2、二氧化碳生成的检验：1）先观察三角瓶中的发酵液有无泡沫或气泡逸出，再察看发酵试管里的杜氏小管中有无气体聚集。2）取10 % NaOH溶液1 ml注入发酵试管中，轻轻搓动发酵管，观察液面是否上升，如气体
24、逐渐消失，则证明其中气体为发酵过程中生成的CO2，其化学反应式如下： CO2 + NaOH NaHCO3。3、酒精生成的检验：1）打开大三角瓶棉塞，嗅闻有无酒精气味。2）从大三角瓶中取出发酵液5 ml，注入空试管中，再加入10 % H2SO4溶液2 ml。3）向试管中滴加1 % K2Cr2O7溶液1020滴，如管中由橙黄色变成黄绿色，则证明有酒精生成，反应式如下： 2K2Cr2O7+8H2SO4+3CH3CH2OH3CH3COOH+2K2SO4+2Cr(SO4)3+11H2O4、酒精度测定： 利用酒精计测定酒精含量。4结果与分析4.1. 酵母菌的分离与培养从实验结果可以看出：所培养的酵母菌呈圆
25、形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色。4.2 发酵菌株的筛选 选择杜氏小管气泡多的即为所需菌株4.3发酵菌株的鉴定 PCR结果 固定化结果本实验失败率极高，现分析可能的原因：（1） 盛放酵母菌的培养皿忘记灭菌，这个可能性最大。（2） 加样的错误（3） 操作的失误等都可能导致条带不清4.4酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化9以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；由结果可以看出颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。（此过程由于时间的原因没有测膨胀率）5 讨论（1）本实验采用平板分
26、离酵母菌时，培养时间不应该过长，因为长时间培养增加了染霉菌的可能性，并且若需得到纯度较高的酵母菌则需进一步进行平板划线分离酵母菌菌株。并及时镜检。（2）富集培养后需对溶液中酵母进行死活统计，从而初步判断此次富集的酵母菌的生存能力是否满足工业酵母生存能力。死活统计的方法有0.l%美蓝染色液染色法，活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色。（3）要及时观察酵母产酸产气的时间，记录产酸产气情况。（4）微生物鉴定时需要采取不同的方法进行生物学鉴定，形态学鉴定时有可能出现杂菌，导致观察失误。分子学鉴定也可能产生假阳性，故在鉴定时不同方法之间要相互验证，使结果更具有说服力。（5）固定化培养酵母进行酒精发酵时
27、，凝胶珠中细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。但在凝胶珠中，代谢物的积累可能影响酵母的生长繁殖和产酒精量。6实验心得 在韩老师的带领下我们做了“酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵”的综合性大实验，实验历时3周的时间，在这次实验中我学到了很多，同时也发现了自己的缺点和不足，现总结如下。一优点 1.团队合作意识较强。我们团队6人，每次做实验，大家都有所分工每次的实验用品都能很快的找到，为实验的准确进行打下了坚实的基础。 2.动手能力相对强。之前一些类
28、似的实验，对本次实验做起来相对容易一些。 3.严谨性。我们组做发酵时失败了，但又做了一次，最后成功了，这说明实验要有严谨性。2 缺点与不做 1.无菌操作仍然不过关。此次实验中，一共发生了2次染菌，都说明无菌操作不过关。 2.粗心。实验中由于粗心还打烂了试管，忘记了灭菌就用培养皿，导致染菌。 3.理论知识不足，有待进一步学习与提高在本次实验中也学到了许多，韩老师给我们介绍了许多生物学软件，让我受益的是endnotex7,它是中文版的，我现在也在做儿茶素代谢，它对我查阅相关文献帮了很大的忙。其次是primer软件，以前我很好奇引物的设计是怎么来的，现在有了primer的帮助清楚多了。参考文献：1
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