艾滋病、梅毒实验室检测.ppt

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1、艾滋病、梅毒实验室检测方法及生物安全,高金亮 博士 分子生物学主任技师 鄂尔多斯市疾病预防控制中心 2013年1月15日,艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症（acquired immune deficency syndrome, AIDS)。是人类因为感染人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。目前，艾滋病已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题。,艾滋病,艾滋病的发现,美国1981年首先发现5名同性恋中患卡氏肺孢子虫肺炎，数月后又在另外数例同性恋中发现卡波济氏肉瘤，相同的情况也出现在

2、静脉吸毒人群中。均有免疫功能减退，主要是CD4+T细胞的数减少。称为获得性免疫缺陷综合症。同年6月5日美国CDC最先向全世界报道AIDS。 1983年，美国马里兰大学Robert Gallo等从艾滋病病人体内分离到一种与人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)非常相似的病毒，遂将该新发现的病毒命名为人类T淋巴细胞白血病III型病毒（HTLV-III）（Science 220 (4599): 865867）。与此同时，法国巴斯德研究所的 Luc Montagnier 等从一颈部淋巴结肿大、体质虚弱的艾滋病患者体内分离到一种病毒，该病毒的核心蛋白与HTLV-I 的免疫学特性不同，遂将该病毒命名为淋巴腺

3、病相关病毒(LAV) （Science 220 (4599): 868871）。后经证实这两种病毒为同一种病毒，于1986年将该病毒更名为HIV。同年在非洲发现异性间传播并发现HIV-2。,WHO报告2010年全球约有3400万人感染HIV，新感染270万，全年死亡180万人。每天有超过7000人新发感染。世界各地区均有流行，但97%以上在中、低收入国家，尤以非洲为重。,在2011年年底各国青壮年（15-49岁）艾滋病的流行程度估计,艾滋病流行状况,2008年底各国艾滋病患者及HIV携带者人数估计,1、发现：1985年，一位美籍阿根廷青年以旅游者的身份进入中国，不久便因发烧、肺部感染住进北京协

4、和医院，因该患者对各种抗感染类药物均没有作用，随后进行的血清检测发现其HIV呈阳性。 2、流行现状：中国CDC估计，截止至2011年底，我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人，全年新发感染者4.8万人，死亡2.8万人。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市，目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散。2009年疫情估计结果显示，云南、广西、河南、四川、新疆、广东等6省HIV感染者超过5万人，占全国估计总数的61.8%；15万人的省份有9个；5千人以下的省份有8个，占全国估计总数的2.3%。累计报告艾滋病病毒感染者和病人数排在后7位的省份是西藏、青海、宁

5、夏、内蒙、天津、甘肃、海南，报告人数不到全国报告总数的1%。,中国AIDS流行情况,病原学,1、病原体 AIDS的病原体是人类免疫缺陷病毒（HIV）。HIV属于反（逆）转录病毒科，慢病毒属人类免疫缺陷病毒组。 2、病毒形态结构 HIV呈球形或椭球形，直径100-120nm 电镜下成熟的HIV-1呈现一致密的圆柱状核心和一个病毒包膜。 外层为类脂质包膜，膜上为突起插入，突起由糖蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）以共价键连接而成。 病毒核心由病毒RNA、逆转录酶、整合酶和蛋白酶，有核心蛋白p24、P6、P9包裹 HIV的RNA为两条相同拷贝（完全同源）的正股RNA链。,HIV的形态,HIV的

6、逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性 ，无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。,HIV颗粒,3、HIV的基因结构及分型 HIV可分为HIV-和HIV-两型。HIV-1全长9181bp, HIV-2全长10359bp. （1）基因组成： HIV含3个结构基因和6个调节基因 : LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR. : LTR-gag-pol-vif-vpx-vpr-tat-rev-env-nef-LTR. (2) 两者的主要区别： 型含有vpu，而型含vpx。 vpr和nef与其他基因的关系也不同： A HIV-的vpr与vif相互重叠，而nef与

7、env不重叠； B HIV-的vpr与vif不重叠，而nef与env相互重叠。 （3）结构基因表达产物 HIV- HIV- 包膜蛋白基因env：gp160 gp120 gp41 gp140 gp105 gp36 群抗原基因gag： p55 p24 p18 p56 p26 p16 多聚酶基因pol： p65 p51 p31 p68 p53 p34,HIV感染机理,HIV病毒侵入人体后，其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导

8、致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞。,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合,HIV辅助受体gp120与CD4特异受体结合细胞内两条病毒RNA链逆转录酶逆转录成单链DNADNA聚合酶复制。一部分装配成HIV ,以芽生方式释出,再感染其它细胞。一部分与宿主的DNA整合，成为潜伏状态的前病毒。,艾滋病的传播途径,HIV主要存在于HIV感染者/艾滋病患者的体液中，包括血液、精液、阴道分泌液、乳汁、伤口渗出液等。任何能够引起体液交换的行为，都有传播HIV的可能。,三种传播途径 1、性传播：通过异性或同性性行为传播。 2、血液传播： a.通过共用注射器或针头注射毒

9、品； b.通过输入含有HIV的血液或血制品； c.使用未经消毒或消毒不严格的医疗器械(如针头、针灸针、牙科和美容器械等) d.通过共用剃须刀(刮脸)及牙刷等传播； 3、母婴传播：通过胎盘、产道和哺乳传播。,HIV对环境中理化学因素抵抗力均较弱，比HBV的抵抗力低得多。 对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。 HIV对热很敏感，对低温耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活病毒，在低温条件下保存病毒。 在室温（2227）液体环境下HIV可存活15天以上；经56处理30 min可使HIV在体外对人的T淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的HIV；经过60 3小时或80 30min作用后不能检

10、出感染性病毒。 HIV耐碱不耐酸 室温中0.5%次氯酸钠或75%酒精只需1min即不能检出RT酶活性； 0.2%次氯酸钠、0.1%家用漂白粉、0.1%戊二醛等5min即可灭活； 30%酒精溶液5min、20%酒精溶液10min可灭活HIV。 对紫外线不敏感，离开人体可存活数小时至数天。,病毒生物学特性,实验室检测,艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS298-2008 全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版） 全国艾滋病检测工作管理办法卫疾控发2006218号,依据,检测目的,1.临床诊断 2.安全输血 3.流行病学调查、高危人群监测 4.自愿咨询检测VCT 5.抗病毒治疗后效果检测 6.抗病毒

11、治疗耐药性检测 7.免疫功能测定,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断 HIV检测的严肃性： 保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题 结果严格保密,HIV检测实验室及管理要求,检测工作必须在经批准的艾滋病实验室内进行。未设置艾滋病实验室的机构或单位及未经备案或批准的艾滋病实验室不得开展相关的艾滋病检测工作。 国家对艾滋病检测实验室实行分类管理，按照实验室的职能、开展检测工作的性质及范围共分三类实验室，分别是艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室（包括：艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点） 。 必须立即开展或已经开展艾滋病检测工作而又暂时

12、不具备艾滋病筛查实验室设置条件的单位，作为一种过渡，可以暂时设立“艾滋病检测点”。“艾滋病检测点”也必须达到安全防护的基本要求，并经省（自治区）卫生行政部门批准和备案。,艾滋病实验室的仪器设备应能满足安全防护要求。使用国家规定需要强检的仪器设备，必须由同级计量认证部门定期检定，非国家强检的仪器设备应定期维护和校准。 艾滋病检测工作中所使用的检测试剂，必须使用经国家食品药品监督管理局注册、中国药品生物制品检定所“批批检”合格，且在有效期内的试剂；推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂；严格按试剂盒操作说明书操作。 从业人员需经过培训，持证上岗。,1.艾滋病实验室应对所使用的艾滋病检测试剂实

13、施定期监测，以保证检测试剂的稳定性。 2.艾滋病检测过程中，应严格按试剂操作说明书操作，作好质量控制。遇到疑难情况应报上一级实验室帮助解决。 3.按照全国艾滋病检测技术规范要求，作好实验记录、档案管理和保存工作。 4.每年参加省疾控中心艾滋病确认中心实验室或其委托的初筛中心实验室对各艾滋病实验室进行的室间质量考评。,质量控制和室间质量考评,BSL 实验室设计和建造的要求： 应有专门放置生物废弃物容器的台(架)。 应设置实施各种消毒方法的设施，如高压灭菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处理。 应设置洗眼装置。 实验室门宜带锁、可自动关闭。 实验室出口应有发光指示标志。 生物安全柜,HIV抗体检测（

14、筛查和确证）、抗原检测、相关免疫学检测、HIV核酸提取和检测、HIV阳性样品的保存均应在生物安全级实验室(BSL )内进行。 凡涉及活病毒的研究工作(如病毒分离培养、浓缩、中和试验、细胞培养、病毒保存)均应在生物安全级实验室(BSL )内进行。,HIV相关检测的生物安全级别,初筛实验室设计和建造的要求： 有专用实验室（至少专用检测台），应划分清洁区和污染区，并有明显标记，有充足的操作空间。 实验室墙面、地面、台面材料应来耐酸、碱、易清洁消毒、不渗漏液体；室内应有防蚊、防蝇、防鼠等设备 检验台上应装置紫外灯。 备有消毒药品、消毒器材和消毒设备。 有感应流水装置，备有冲眼睛水，足够的一次性手套、口

15、罩、隔离服和防护眼镜。 (6) 实验室应装置恒温设备,室温为2025。,HIV感染后体液变化 感染HIV后，机体针对HIV的抗原性物质产生相应抗体，在临床上具有重要诊断学意义的抗体由gpl60，gpl20，gp41，p66，p55，p51，p31，p24，p17等 抗原诱导产生。 不同个体对各种抗原的免疫应答有一定的差别（时间、强度等） 检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV抗体的检出时间产生一定影响。在感染HIV后，最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原，继之，各种HIV抗原可达到高峰；2-6周后，随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加，HIV抗原渐趋降低或检测不出。,窗口期的问题？抗体

16、通常是在感染后38周能够被检测出来。95%在三个月可以检测出抗体。 在窗口期，病毒抗体不能被检出，但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化218 d被检测到。因此，在血清转化期通过检测p24抗原作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。,HIV感染后的血清学改变,HIV感染的实验室检测方法,常用HIV病原学检测方法: 1. 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测 常用HIV抗体检测方法: 初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代 2.快速检测 RT：金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集 确

17、证：免疫印迹法 WB:（Western Blot） 其他相关检测方法: 免疫功能测定：CD4/CD8检测 各种分子生物学技术,（一）HIV核酸检测,通常使用PCR或RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。,核酸检测特点,用于检测不能培养和分离的病毒（如HBV、HCV、HIV等）； 仅需少量标本或标本中仅含少量病毒； 能在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前做出诊断； 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； 可对病毒进行基因分型，比血清分型更有价值； 对病毒的耐药基因进行检测，可预测或发现病毒的耐药性； 可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； 灵敏度高（可达ng甚至fg水平，理论上能检出单个

18、病毒基因），特异性好、快速、简捷。,核酸检测主要应用,1） 早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断： 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，检测到病毒核酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断，目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测，当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。,核酸检测主要应用,2）对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定（或可疑）结果进一步做辅助诊断； 3）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断急性原发感染； 4）HIV

19、亚型分析；确定人群中HIV的变异； 5）监测临床抗病毒药物治疗效果； 6）检测病毒的耐药性突变。,（二）HIV病毒分离培养,将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原/RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR。 必须在P3级生物安全实验室进行。,HIV病毒分离培养的应用,1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性

20、等研究。 3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 本法一般不用于常规诊断。,（三）HIV p24抗原测定及适用范围,是一种血清学夹心法EIA。 （1） HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 （2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。 （3）第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。 （4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。,HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释：,（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。 （2）

21、HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。 （3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。,（四）HIV抗体检测,检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标，抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实验三个步骤。 初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、快速免疫（层析或渗滤）试验（RT）。 确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。,HIV抗体筛查检测流程图,快速检测（RT）,胶体金快速试验 金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理，选择经纯化的基因工程制备的g

22、p36、gp41、p24抗原作为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作为胶体金结合抗原。 当待检标本中含有HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。 该方法试剂稳定，可室温长期保存。试验时不需任何设备，迅速、简便、特异性较好，敏感性约相当于中度敏感的ELISA，适用于应急检测、门诊急诊个体检测，尤其是基层单位。缺点：肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,样本要求,1.采

23、集静脉血清或血浆，并避免样品溶血。 2.如果血清或血浆样本收集后7天内检测，样品须放在2-8保存，如果大于7天则须冷冻（-20）保存，使用时样品需恢复至室温。 3. 全血标本：静脉穿刺采集抗凝血，若不立即进行实验，标本需2-8保存，保存时间超过3天需冷冻，但使用超过保存3天以上的标本可能导致结果异常。,胶体金快速试验-操作步骤,1、将待测标本从储存条件下取出，平衡至室温并编号。 2、将所需数量的测试卡从包装盒中取出平衡至室温，打开铝箔包装袋，平置于台面上。 3、在测试卡加样处缓慢滴加10I待测血清/血浆或20I全血标本，然后滴加3滴样品稀释液。 4、5-20分钟内判断结果，超过20分钟观察无效

24、。操作温度需在15-30.,1、阳性：当在结果出现以下三种情况，无论条带出现先后，均判定HIV阳性结果。 结果窗口出现质控带C和测试带1，表示HIV-1阳性结果； 结果窗口出现质控带C和测试带2，表示HIV-2阳性结果； 结果窗口出现质控带C和测试带1和测试带2，表示HIV-1和HIV-2阳性结果；其中测试带颜色深者为阳性结果（该情况极为罕见，可能是HIV-1和HIV-2间存在相同氨基酸序列）。 2、阴性：测试卡只在对照区(C)位置出现一条紫红色条带。 3、失效：质控带(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。,注意事项,1、金标快速测试卡仅用于HIV抗体的现场初筛，对于

25、所有使用本测试卡检测结果为阳性的样品必须进行进一步确证【阳性标本请填写艾滋病检测点HIV抗体复检检测单及时送上级疾控中心复核检测】。初筛结果不得出具阳性报告。 2、本测试卡仅用于人血清（浆）标本中HIV抗体的检测，其它体液和样品可能得不到准确的结果。所以必须使用符合要求的检测标本。 3、样本的加样建议用微量加样器按试剂说明书准确加入。 4、实验环境应保持一定温湿度，避免在过高温度下进行实验。 5、测试卡从包装中取出后，应尽快进行实验，避免放置于空气中过长时间，导致受潮。 6、测试卡可在室温下保存，谨防受潮。低温下保存的测试卡应平衡至室温方可使用。 7、不能使用超过效期的试剂。 8、实验过程请认

26、真及时、完整填写原始记录，注意原始记录的保存与保密。,酶联免疫吸附试验（ELISA） 初筛用的HIV ELISA试剂目前已经发展到第四代检测试剂。 第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板,以检测血清中的抗体。由于包被的抗原不很纯,假阳性率较高。 第二代试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用,特异性有了很大提高。 第三代试剂使用双抗原夹心法检测抗体,进一步提高了敏感性。-目前国内外主要使用第三代 第四代试剂则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测,把HIV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,可同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原。检出时

27、间提前了4-9.1d，用于血源筛查等。,各代检测方法示意图,第一、二代,第三代,第四代,= 窗口期,HIV感染窗口期,实例一、人类免疫缺陷病毒抗体检测 方法：酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测体液（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法、双抗体夹心法、竞争法,3.原理（以间接性ELISA为例）：,显色,间接法 用已知抗原包被微孔板，检测未知抗体,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗体,酶标抗抗体,双抗原夹心法检测抗体,双抗体夹心法 用已知抗体包被微孔板，检测未知抗原,洗涤,洗涤,洗涤,待测抗

28、原,竞争法,洗涤,洗涤,待测抗原,酶标抗原,具体操作：人类免疫缺陷病毒抗体检测(试剂盒购自珠海丽珠公司）,实验步骤（生物安全柜内！） 1.用去离子水或蒸馏水20倍稀释浓缩洗涤液。 2.将所需数量的条板固定于支架，按顺序编号（同时填表格），设空白对照1孔，阳性对照2孔，阴性对照3孔和样品孔若干。空白孔不加任何液体，阴性，阳性对照孔分别加入50l（2滴）阴性和阳性对照，在样品孔中加入50l待测样品，用不干胶封板，轻轻拍匀。 3. 置37水浴温育60分钟。 4置洗扳机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染）。 5.每孔加入50l酶标记物（空白孔除外），轻拍混匀，封板。

29、 6.置37水浴温浴30分钟。 7.置洗扳机用洗涤液充分洗涤6遍，扣干（注：洗涤时各孔要加满洗液，勿使孔间交叉污染）。 8.每孔加入50l底物缓冲液和50l底物液，轻拍混匀置37温育30分钟。 9.每孔加入50l终止液终止显色反应。 10.用酶标仪单波长450nm（需设置空白对照，并以空白对照孔调零）或双波长450nm/630nm测定各孔A值。,结果判定,1.临界值（Cutoff）=0.15阴性对照平均A值 2.样品的A值Cut off值者为HIV抗体反应阳性。 3.样品的A值Cut off值者为HIV抗体反应阴性。 4.正常时，阴性对照A值应0.12，阳性对照A值应0.80，阴性对照A值若小

30、于0.08以0.08计算。 5.若阳性对照A值孔间之差大于30%，应重复实验。 6.初次实验阳性者应重新取样进行双孔复试，须将血样或重新采血送HIV确认实验室做确认实验。,注意事项 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。 整个HIV检测必须符合全国艾滋病检测工作规范，严格防止交叉感染。操作时必须戴手套，穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。 HIV-1/HIV-2抗体测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。 样品，酶结合物溶液等应用加液器加注，并经常校对其准确性。 洗涤时各孔均应加满洗液，防止孔口有游离酶不能洗净。 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 微孔板条

31、从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干净方可使用；未用完者需放入有干燥剂的密封袋中保存。 用于检测的样品应保持新鲜。 剩余样品及废弃物应经121高压蒸汽灭菌30分钟，或用5.0g/L次氯酸钠等消毒剂处理30分钟后废弃。 不同批号的试剂组分不可混用。,筛查结果报告,HIV抗体初筛试验用附表1进行报告，阴性反应报告为“HIV抗体阴性（-）”；阳性反应报告为“HIV抗体待复检”。 HIV抗体复检试验用附表2进行报告，两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待确证”；两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性（-）”。HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。,疑似阳性标本的送检,筛查试验

32、呈阳性反应的样品需送上级实验室进行复检。 1、标本送检时必须全项目填写艾滋病检测点HIV抗体复检检测单，标本送检前需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证号码），必要时采集第二份血样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实验室复检。 2、全血标本必须分离出血清或血浆，装入带螺旋口的样品冻存管中送检。【严禁全血标本送检】；血清或血浆标本的量不能少于1ml 。避免溶血标本送检。 3、送检标本的包装： *标本管上必须有明确的标识(包括姓名、编号、采血日期等)； *标本管一定要旋紧螺旋盖，先装入放渗漏的小塑料袋中，然后放入配发的专用送样瓶中，周围用泡沫等软物固定，放入冰袋，

33、盖紧送样瓶盖子。 *注意严禁将送检单等送检资料放入样品瓶中送检，样品必须与送检资料分离送检。,A类包装 主容器,感染性物质的A类包装（三层包装）,A类包装 次级容器,A类包装 外包装,1、免疫印迹式验（WB）： WB是将HIV病毒蛋白用SDS-PAGE电泳，把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条装，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。 待检血清样品1：100稀释，加到放置硝酸纤维膜的槽内，恒温震荡，充分接触反应。血清中抗-HIV抗体，与膜条上的抗原带相结合。加入抗人-IgG酶结合物和底物后，即可使抗原-抗体结合

34、带呈现紫褐色。根据出现条带情况判定结果。,HIV抗体确认试验,HIV抗体确认实验结果,线性免疫印迹示例,检测过程中生物安全要求,检测过程应将所有检测标本视为有感染危险的标本 （1）采血和测试过程中一定要带手套，采血取出针头时要绝对避免针头刺伤：不许用手直接套回针头防护套；避免直接接触血液；应尽量避免使用针头、刀片、玻璃器皿等利器，以防刺伤。 （2）应使用安全针具采血，如碟形真空针，自毁性针具等。 （3）用过的锐器直接放入耐穿、防渗漏的利器盒，用过的针头应直接放入坚固的容器内，消毒后废弃。 衣物沾上血迹要用75%酒精湿润的纸巾檫掉，然后用75%酒精湿透； （4）不可在检测过程中吸烟、进食、喝饮料

35、、美容和处理隐形眼镜； （5）用消毒剂对溅出的样品或试剂进行消毒。,职业暴露,概念：艾滋病的职业暴露是指医务工作者、实验室工作人员及有关监管人员在从事HIV/AIDS诊断、治疗、护理、预防、检验、管理工作过程中，暴露于含有HIV的血液、体液和实验室培养液，而具有被HIV感染的可能的情况而引起的危害。,医务人员艾滋病病毒职业暴露防护工作指导原则(试行)(2004.5.31) ： 第八条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，应当立即实施以下局部处理措施： 1、用肥皂液和流动水清洗污染的皮肤，用生理盐水冲洗粘膜。 2、如有伤口，应当在伤口旁轻轻挤压尽可能挤出损伤处的血液，再用肥皂液和流动水进行冲洗；

36、3、 受伤部位的伤口冲洗后，应当用消毒液（如75酒精、2000mg/L次氯酸钠、0.20.5%过氧乙酸、0.5%碘伏） 进行消毒，并包扎伤口，被暴露的粘膜，应当反复用生理盐水冲洗干净。 第九条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，医疗机构应当对其暴露的级别和暴露源的病毒量水平进行评估和确定,一、发生以下情形，确定为一级暴露： 1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。 2 暴露类型为暴露源沾污了有损伤的皮肤或者粘膜，暴露量小且暴露时间较短。 二、发生以下情形，确定为二级暴露： 1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。 2、暴露类型为暴露源沾污了有损伤的皮肤或者粘

37、膜，暴露量大且暴露时间较长；或者暴露类型为暴露源刺伤或者割伤皮肤，但损伤程度较轻，为表皮擦伤或者针刺伤。 三、发生以下情形，确定为三级暴露： 1、暴露源为体液、血液或者含有体液、血液的医疗器械、物品。 2、暴露类型为暴露源刺伤或者割伤皮肤，但损伤程度较重，为深部伤口或者割伤物有明显可见的血液。,第十条 艾滋病病毒职业暴露级别分为三级,第十一条 暴露源的病毒载量水平分为：轻度、重度和暴露源不明三种类型。 暴露源不明：不能确定暴露源是否为HIV病毒阳性者 轻度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性，但滴度低，艾滋病病毒感染者无临床症状、CD4计数正常者。 重度：经检验，暴露源为HIV病毒阳性，但滴度高，

38、艾滋病病毒感染者有临床症状、CD4计数低者。,第十二条： 医疗卫生机构应当根据暴露级别和暴露源病毒载量水平对发生艾滋病病毒职业暴露的医务人员实施预防性用药方案。 第十三条 预防性用药方案分为基本用药程序和强化用药程序。 基本用药程序：为两种逆转录酶制剂，使用常规剂量，连续使用28天。 强化用药程序：是在基本用药程序的基础上，同时增加一种蛋白酶抑制剂，使用常规治疗剂量，连续使用28天。 预防性用药应当在发生艾滋病病毒职业暴露后尽早开始，最好在4h内实施，最迟不得超过24h；即使超过24h，也应当实施预防性用药。（早、有）,发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，可以不使用预防性用药； （一级

39、轻度不用药） 发生一级暴露且暴露源的病毒载量水平为重度或者发生二级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度时，使用基本用药程序。 （一级重度或二级轻度用基本） 发生二级暴露且暴露源的病毒载量水平为重度或者发生三级暴露且暴露源的病毒载量水平为轻度或者重度时，使用强化用药程序。 （二级重度或三级用强化） 暴露源的病毒载量水平不明时，可以使用基本用药程序。,第十四条 医务人员发生艾滋病病毒职业暴露后，医疗卫生机构应当给予随访和咨询。随访和咨询的内容包括：在暴露后的第4周、第8周、第12周及6个月时对艾滋病病毒抗体进行检测，对服用药物的毒性进行监控和处理，观察和记录艾滋病病毒感染的早期症状等。,RPR试验 梅

40、毒患者血清中存在着能与VDRL抗原发生凝集反应的反应素，利用这一原理，将VDRL抗原吸附于活性炭颗粒表面，当待测血清中存在反应素时，即与其发生凝集反应，出现肉眼可见的黑色凝块。 用白色的硬纸片替代玻片 血清不需要灭活 不需要显微镜观测结果 可作定量试验,（一）梅毒螺旋体快速血浆反应素环状卡片试验,TRUST 其原理和成分与RPR试验相同 用红色的甲苯胺红替代了碳颗粒 其余的特点均与RPR相同,实例二、梅毒螺旋体诊断,试验操作要点,定性试验 分别吸取50微升梅毒阳性对照和阴性对照均匀铺加在纸卡的两个圆圈中。 另吸取50微升待检血清均匀铺加在纸卡的另一圆圈中。 用盒中的专用针头，滴管吸取RPR试剂

41、，分别垂直滴加1滴于上述血清中。 用RPR旋转仪水平转动纸卡8分钟，100转/分钟，然后3分钟内在光线充足处判定结果。,定量试验 定性实验呈弱阳性或阳性必须做定量实验才能了解患者血清中的抗体滴度，具体方法如下：将待检血清用生理盐水作倍比稀释（原血清，1：2，1：4，1：8，1：16，1：32），然后对每个稀释度的血清按定性实验方法进行测定并判定结果。,RPR,TRUST,VDRL,结果判断,滴度：出现凝集反应的血清最高稀释倍数。,（二）梅毒确认试验TPPA,1、试验原理 TPPA试验用梅毒Treponema Pallidum（Nichols株）的精制菌体成分致敏明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清中的

42、抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应。可用于检测血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体，并可用来测定抗体效价。明胶粒子为洋红色，在操作部步上也较为方便，出结果较快。,TPPA试验检测流程,试验前期准备 微量振荡仪 试剂检查 25l移液器、吸头 记号笔、废物缸 有盖湿盒 工作服 一次性手套、口罩、帽子 生物安全柜,TPPA试验检测流程,使用前将试剂盒从冰箱中取出，室温放置30分钟。 在96孔U型板上编上相应的待检样本的编号。 按标签标明量（0.6ml)向每瓶冻干致敏粒子（C液）和未致敏粒子（D液）各加入溶解液（A液）复溶，置室温不得少于30分钟。 方法1 每份标本做4孔，加血清稀释液（B液）至U型反应

43、板，第1孔100l，第24孔各25 l。 用移液器取血清25l至第1孔，反复混匀后取25 l至第2孔，连续倍比稀释至第4孔，最后1孔混匀后弃去25l。 第3孔加未致敏粒子D液25 l，第4孔加致敏粒子C液25 l 将微量反应板置震荡器震荡30秒。 置微量反应板于有盖湿盒内，室温（15-30）静置2小时后，观察结果。,方法2 方法1判定为阳性的样品，用方法2进行复检,对照试验 能够确认每例样品未致敏粒子的反应（最终稀释倍数1：40）均是（-）。 能够确认每次检查中血清稀释液和致敏粒子以及未致敏粒子的反应均是（-）（介质对照）。 每个试剂盒中的阳性对照血清都要与样品用相同的测定方法进行试验。阳性对

44、照血清调制成抗体效价为1：320（最终稀释倍数）,结果报告: 观察加未致敏粒子D液的第3孔，不出现凝集为有效试验 。 阳性：第3孔不出现凝集，第4孔出现1+4+凝集反应。 阴性：第3、4孔均不产生凝集反应。,吸收操作 对于未致敏粒子和致敏粒子均显示（）以上凝集的样品，要按照下列顺序在完成吸收操作的基础上进行试验。 取用定量的溶解液调制好的未致敏粒子0.95ml至小试管中。 加入样品50l混合，于室温（15-30）下放置20分钟以上。 离心分离（2000r/min）5分钟，然后分取上清夜【吸收完毕后的稀释品（1：20）】50l至反应板第3孔中，特别注意不要混入粒子。 从第4孔以后，要预先滴入25l血清稀释液，从第3孔至最后1孔用微量加样器或微量移液管以2n的方式进行稀释。 以后就与“测定操作”2-3同样的操作进行判断。通常情况可以用上述的吸收操作完全吸收，但如果吸收不尽时，请使用其它的检查方法。,Thanks!,