酶工程实验08-09.doc

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1、实验一 植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4邻甲氧基苯酚，在470nm波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。三、材料、仪器设备及试剂 1. 材料：植物叶片 2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。 3. 试剂及配制：0.1molL1磷酸缓冲液（pH7）。反应液（100ml 0.

2、1molL1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30H2O2，充分摇匀）。四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。 2. 酶活性测定吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度

3、变化值（A470）。五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性 A470 酶提取液总量（ml）酶活性（A470g1Fwmin1）= 样品鲜重（g） 测定时酶液用量（ml）实验二 溶菌酶提取新技术1 药品原料氯化钠、氢氧化钠2 设备玻璃或陶瓷容器、pH计、细纱布、玻璃搅棒、胶头滴管、布氏漏斗等。3 提取过程31 除杂将新鲜鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出(最好是新生的鸡蛋、pH值不得低于8，否则不能使用)，按其体积的两倍量加入水，轻轻搅拌5分钟，使蛋清溶液的稠度均匀，注意在搅拌过程中不能起泡，搅拌不宜过快，搅拌棒应光滑等，以防蛋白质变性而影响溶菌酶产品的得率及质量，最后用双层细纱布滤除蛋清溶液中的脐带

4、块及碎蛋壳等。32 盐析每100毫升蛋清溶液加入2克氯化钠的比例，向蛋清溶液中慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅拌，促使氯化钠细粉及时溶解以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大量的白色沉淀。33 粗提加完氯化钠细粉后，再用1摩尔升的氢氧化钠溶液小心地将上述蛋清溶液的pH值调节到1 08，在用氢氧化钠溶液调节蛋清溶液的pH值，用胶头滴管将其逐滴滴入并不断搅拌，以免局部过碱而导致蛋白质的变性，从而影响溶菌酶的得率和质量：为加速溶菌酶的结晶过程可再加入适量的溶菌酶结晶体作为品种：低温下静置数天溶菌酶结晶将慢慢析出，于7296小时达到最高产率。待结晶完全后，倾去上清液并用布氏漏斗

5、滤出结晶，即可得到粗制的溶菌酶晶体。实验三 尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法) 原理】 临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对淀粉酶活性单位的规定是:在37,30分钟,恰好能将0,1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活力单位. 试剂和器材】 1,0.9%氯化钠 2,0.1%淀粉 3,碘化钾碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使用前稀释10倍) 4,移液管 5,试管 6,恒温水浴锅 操作】 1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升. 2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合 (若

6、尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,然后任其流出.反复三次,使全管混匀. 从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管依次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,1/4,1/81/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作为对照管. 3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37,并记录时间.注意保持水浴的温度. 4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到

7、紫色表明有淀粉的水解中间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在. 计算】 选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫升.即1/32毫升尿液能在37,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活力单位. 实验四 超氧物歧化酶活性的测定 超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定21。(一)原理超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确

8、定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。(二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备：(1) 研钵(预冷)； (2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有限公司)；(3) PUS-2018型 半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)；(4) 移液管（10ml,5ml,0.5m

9、l,0.2ml各数支）；(5) 日光灯（反应试管处照度为4 000Lx）；(6) 试管数支；(7) 洗耳球。3. 试剂：(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）: A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移到250ml容量瓶中，定容。B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml容量瓶中，定容。C.将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中，用量筒量取23ml后加入同一烧杯中，用pH试纸调节其pH值至7.8；(2) 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；(3) 750mol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用

10、磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；(4) 100mol/L EDTANa2溶液：称取0.03721g EDTANa2用磷酸缓冲液定容至1 000ml；(5) 20mol/L 核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。(三)实验步骤 1. 酶液提取取取被不同浓度NaCl溶液处理过的苎麻叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中。加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5ml于10 000r/min下离心12min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取试管（要求透明度好）4支，1支为对照管，另3支为测定管，按下列加入各

11、溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met溶液0.3ml, 750mol/L NBT溶液0.3ml,100mol/L EDTANa2液0.3ml，20mol/L 核黄素0.3ml,蒸馏水0.25ml和0.05ml酶提取液，对照管以缓冲液代替酶液;总体积为3.0ml。各管于4 000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。列表如表1:表1.试剂用量表试 剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.2mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750mol/L NBT

12、溶液0.375mol100mol/L EDTA-Na2液0.310mol20mol/L核黄素0.32.0mol酶 液0.05空白加缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.03. SOD活性测定与计算至反应结束后，以未加酶液处理的对照管做空白，分别在560nm测定其它各管的吸光度值。(四)结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性(ACKAE)V/(ACK0.5WVt) 公式(1)式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；ACK照光对照管的吸光度,AE样品管的吸光度；V样品液总体积（ml）；V t测定时样品用量（ml）；W样鲜重（g）。

13、实验五 过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法21。(一)原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。CAT酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示.在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量：5H2O2 +2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 (二)材料、仪器设

14、备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备(1) 研钵；(2) 三角瓶；(3) 酸式滴定管；(4) HH-4数显恒温水浴(30)(国华电器有限公司)；(5) 容量瓶(250ml)；(6) 试管数支；(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海)有限公司)。2. 试剂(1) 10%H2SO4（自配）；(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配)；(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4 3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1 000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1

15、000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；(5) 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O42H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1 000ml。(三)实验步骤1. 酶液提取取 叶片2.5g(去叶脉)加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，10 000r/min离心12min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2. 显色反应取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2

16、，同时计算时间，于30恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。然后用0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30秒内不消失）为终点。(四)结果酶活性用每g鲜重样品10min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）（AB）VT/(WVS1.7) 公式(2)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）。实验六 植物淀粉酶动力学研究 一、实验目的1.了解酶动力学的研究的一般内容及方法。2.掌握淀粉酶的动力学研究的操作步骤。二、原理淀粉酶（AMY）

17、包括几种催化特点不同的成员，其中-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；-淀粉酶每次从淀粉的非还端切下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶；葡萄糖淀粉酶则从淀粉的非还原端每次切下一个葡萄糖。淀粉酶产生的这些还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。(二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备 (1) 研钵(预冷)；(2) 7

18、52N 紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；(3) TGL-16LG 台式高速冷冻离心机(湖南星科科学仪器有限公司)；(4) HH-4数显恒温水浴锅（37，70，100，国华电器有限公司）；(5) 试管；(6) 移液管(0.2ml，1ml，5ml，10ml各数支)；(7) 容量瓶(100ml，250ml数个)。3. 试剂（均为分析纯）：(1) 标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml；(2) 3，5-二硝基水杨酸试剂：精确称取1g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸

19、钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；(3) 0.1 mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O72H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，再用精密试纸检测调节使其pH5.6,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；(4) 1淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。(三)实验步骤 1麦芽糖标准曲线的制作

20、取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表2加入试剂：表2 麦芽糖标准曲线制作试 剂管 号1234567麦芽糖标准液（ml）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（ml）2.01.81.41.00.60.20麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（ml）2.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2淀粉酶液的制备 称取新鲜苎麻叶片1g(去叶脉)，置于研钵中，加入少量石英砂和2ml蒸

21、馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心12min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。3酶活力的测定：取3支干净的试管，编号，按表3进行操作。表3 酶活力测定取样表操 作 项 目淀粉酶活力测定- 1 - 2 - 3淀粉酶稀释液（ml）1.0 1.0 1.03,5-二硝基水杨酸(ml

22、）2.0 0 0预保温将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液（ml）1.0 1.0 1.0保温在40恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸（ml）0 2.0 2.0将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。 (四)结果计算：淀粉酶活力=CVT/(WVST)(mg/g/5min) 公式(4)式中，C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；VS为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳一、 目的要求 1. 掌握蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

23、(SDS-PAGE)的基本原理。 2. 学习SDS-PAGE的应用，包括制胶、加样、电泳、剥胶、染色及脱色等。 二、 实验原理 1. SDS-PAGE 几乎所有的蛋白质分析电泳都是采用聚丙烯酰胺凝胶。 在一定条件下，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使蛋白质的多肽亚基相互分离，并尽可能减少这些亚基之间的聚集。最常用的方法是同时使用强阴离子去垢剂SDS和某种还原剂。 在上样前与蛋白质样品一起加热使蛋白质解离。变性的多肽链因结合SDS带上负电荷，由于SDS的结合量总是与多肽链的分子量成比例而与肽链的序列几乎没有任何关系，因此SDS-多肽链复合体在聚丙烯酰胺凝胶中的移动就与肽链的大小一致。在饱和状态下，每克多肽

24、可以结合1.4克去垢剂SDS，借助已知分子量的蛋白质参照，就可以估测样品多肽链的分子大小。但是，如果对多肽链主链进行修饰（如N-或O-糖基化）。 将会显著影响多肽链的表观分子量，因此糖基化蛋白的表观分子量并不能真实反映多肽链的实际分子量。 通常情况下，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使用不连续的缓冲系统。 在这种不连续系统中。 电极缓冲液的pH值和离子强度与制胶用的缓冲液存在差异。在电泳槽的两级通电后，样品中的SDS-多肽复合物随着凝胶中的移动界面向前推进。样品通过多孔的沉积胶后，在分离胶与沉积胶的交界面聚集成一条很细的区带，正是由于不连续缓冲系统具有把样品中SDS-多肽复合体集聚浓缩成极小体积的能

25、力，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率大大提高。 被广泛使用的不连续缓冲系统最初是由Ornsein(1964)和Davis (1964)设计的，样品和沉积胶中含有pH6.8的Tris-HCl缓冲液。 上槽和下槽中的电极缓冲液使用的是pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲体系。 分离胶含有pH8.8的Tris-HCl缓冲液，系统中的所有组分均含有0.1的SDS。样品和沉积胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，电极缓冲液中的甘氨酸分子则形成尾随边界。在移动界面的先导边界和尾随边界之间为一低电导区域。 具有很高的电势差。 这种高电势差推动多肽链向前移动并在分离胶的表面沉积。在分离胶，高pH值更有利于甘氨

26、酸的解离。 大量解离的甘氨酸离子穿过沉积的多肽在分离胶中紧随氯离子向前泳动。 使SDS-多肽复合物从移动界面（具有高电势）中解脱出来，在具有均衡电势场和pH值的分离胶中通过分子筛效应按分子大小被分离开来。 聚丙烯酰胺凝胶是由双功能分子（如N,N-甲叉双丙烯酰胺，Bis）交联起来的丙烯酰胺（Acr）聚合链构成的（如图）。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于制胶用聚丙烯酰胺的浓度和交联度，在没有交联剂时，丙烯酰胺聚合所产生的粘稠溶液并没有实际用处。由双丙烯酰胺所产生的交联反应赋予凝胶的刚性和弹性，并形成可供SDS-多肽复合物通过的孔隙，这些孔隙的大小随着Bis:Acr比值的增加而减小。 当

27、Bis:Acr接近1:20时孔径接近最小值。多数SDS-聚丙烯酰胺凝胶按Bis:Acr比值为1:29来配制，经验表明，这种凝胶能分离大小相差3的多肽。 凝胶的分子筛效应由孔径的大小来决定。 而孔径的大小又是制胶所用Acr和Bis浓度的函数。表1列出了5-15不同浓度丙烯酰胺配制的凝胶的蛋白质线性分离范围。 表1：SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(kD) 15 10-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212 Bis:Acr的比值为1:29 2. 染色与脱色 经PAGE分离的未标记的蛋白质通常利用考马斯亮蓝或银盐染色后

28、进行检测。考马斯亮蓝染色法是一种相对快速且直接的染色方法，它可以非特异性地与蛋白质结合而并不与凝胶结合。 因此可以在透明的凝胶基质上形成可见的被分离蛋白质的蓝色条带。银染法虽然操作麻烦，但是其灵敏度非常高，在检测用凝胶分离的蛋白质时，银染法可以检测到的蛋白浓度几乎比考马斯亮蓝法低100倍。银染检测蛋白质是根据银离子的不同还原反应。 类似于照相过程。 考马斯亮蓝是一种氨基三苯甲烷染料，可与蛋白质形成作用较强的非共价复合物，很有可能是通过范德华力和与NH3 基团之间的静电作用力结合到蛋白质分子。考马斯亮蓝被应用于经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质的染色，考马斯亮蓝与蛋白质的结合量与凝胶中蛋白质的量

29、大致成正比，符合比尔-朗勃定律。 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后的多肽可以同时由甲醇:冰醋酸固定和考马斯亮蓝R-250（一种三苯甲烷纺织染料，又称酸蓝83）染色，凝胶浸泡在浓考马斯亮蓝的甲醇:醋酸溶液中数小时后，再经过长时间的脱色将凝胶中过量的染料脱去。 三、 实验材料 1. 试剂 （1）30的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺贮存液：贮存液中含29（w/v）丙烯酰胺和1（w/v）N,N-甲叉双丙烯酰胺，配制时用温热去离子水以促进双丙烯酰胺的溶解。 应当使用电泳级丙烯酰胺（不含有金属离子）。丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会缓慢转变成丙烯酸和双丙烯酸，这种脱氨基反应需要光和碱的催化。 所以应当检查贮存液

30、的pH值是否为7.0或更低，并将贮存液存放在不透光的试剂瓶于室温下保存。 每隔数月，需要重新配制。 （2）10%的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：用去离子水溶解电泳级SDS（浓度为10，w/v）并于室温保存，建议使用同一商标的SDS进行多肽链电泳，如果用一个厂家生产的SDS另一厂家的SDS，多肽链的迁移图谱将发生显著的改变。若室温较低，10的SDS溶液会发生沉淀，因此在使用前需要加热溶液使沉淀复溶。如果蛋白质需要从胶上洗脱下来进行测序，电泳级SDS还需要进行更入一步的纯化。 （3）用于分离胶和沉积胶的Tris缓冲液的配制：对于分离胶和沉积胶分别需要配制1.5M的Tris缓冲液（pH8.8，4）和

31、1.0M的Tris缓冲液（pH 6.8; 8）。 先用去离子水溶解Tris碱，再滴加浓盐酸调节pH到适当数值。注意。 溶液中的盐离子浓度不能太高。 否则多肽在凝胶中的迁移会发生反常，产生严重的弥散条带。 （4）TEMED（N,N,N,N-四甲基乙二胺）：TEMED可以通过催化过硫酸氨自由基的形成而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只在游离碱状态下起作用，故在低pH时，聚合反应受到抑制。 （5）10的过硫酸氨：过硫酸氨提供自由基引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合，用去离子水配制少量的10（w/v）过硫酸氨溶液并于4保存。过硫酸氨会缓慢分解，需要每周新鲜配制。 （6）Tris-Gly电极缓

32、冲液：含25mM Tris碱，250mM电泳级甘氨酸（pH8.3）和0.1SDS。 （7）蛋白质分子量标记：标准的分子量标记直接购买。 （8）蛋白样品：BSA溶液。 （9）2SDS凝胶上样缓冲液：100mM Tris-HCl（pH6.8），200mM二硫苏糖醇（DTT），4（w/v）SDS，0.2溴酚蓝，20（v/v）甘油。注重：DTT在临用前加入。 （10）甲醇:乙酸溶液（脱色液）：用900ml甲醇:水溶液（为500ml甲醇和400ml水的混合液）与100ml冰醋酸混合即可。 （11）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 0.25克溶解于100ml甲醇:乙酸溶液中。 过滤除去颗粒杂质。 2

33、. 器材 （1）垂直板电泳槽； （2）直流稳压电源； （3）玻璃板； （4）梳齿； （5）微量注射器（50l）； （6）微量移液器（10l, 100l, 1000l）。 四、 试验方法 1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备 （1）按照厂商说明书安装玻璃板。 （2）确定胶模具的体积（大约10ml），按表中给出的数值在小烧杯中配制10的分离胶溶液，按表2中所列顺序依次加入各溶液并混合，当最后的TEMED加渗透后，聚合反应就会开始，因此需要迅速混匀并进行下一步操作。 表2：配制Tris-Gly SDS-PAGE 10分离胶所用溶液（10ml） 成分 H2O 30%丙烯酰胺混合溶液 1.5MTris （

34、pH 8.8） 10% SDS 10%过硫酸氨溶液 TEMED 体积（ml） 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 这里推荐使用的过硫酸氨浓度比有些研究者使用的浓度高，是因为丙烯酰胺溶液中的氧气会抑制聚合反应，提高过硫酸氨浓度可以省却抽气除去溶液中氧气的过程。 （3）将丙烯酰胺溶液灌入玻璃板之间的间隙，留足灌沉积胶的空间（高度为梳齿前沿再加1cm），小心在分离胶上注渗透一薄层水层以防止氧气入入凝胶抑制凝胶的聚合。 （4）聚合完成后（大约30分钟），倾出上层覆盖的水层。 用去离子水清洗凝胶表层未聚合的丙烯酰胺，尽可能排除上层的液体，并用吸水纸吸干残留水分。 （5）参考分离胶的制备方

35、法按表3的配方制备5的沉积胶。 表3：配制Tris-Gly SDS-PAGE 5沉积胶所用溶液（5ml） H2O 30%丙烯酰胺混合溶液 1.0M Tris (pH 6.8) 10% SDS 10%过硫酸氨溶液 TEMED体积（ml） 3.4 0.83 0.63 0.05 0.05 0.005 （6）将沉积胶溶液灌至聚合的分离胶上层，立即插入清洁的梳子，注意不要带入气泡，添加足够的沉积胶以便完全充满梳子的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 2. 样品准备与凝胶电泳 （7）在沉积胶聚合的过程中，按表4准备样品和蛋白分子量标记。 表4：样品和蛋白分子量标准物的准备 2SDS凝胶上样缓冲液 加热处理 样

36、品（15l） 15l 1003分钟 分子标记（10l） 10l 注意：对于强疏水性蛋白质（如某些跨膜蛋白）最好在45-55的较低温度下进行1小时的暖处理，以避免在100时发生沉淀。 （8）等沉积胶聚合完成后。 在上槽和下槽中注渗透Tris-Gly电极缓冲液，小心拔出梳子，扶正上样孔，并排净上样孔中的气泡。 （9）用微量注射器按预先确定的顺序将样品与分子量标记注入沉积胶上加样孔的底部，如果需要加渗入渗出不同的样品或分子量标记。 可以用下槽中的电极缓冲液清洗微量注射器，在不用的加样孔中注渗入渗出等体积的1SDS凝胶加样缓冲液。 （10）将电泳仪与电源相连（阳极连接到下槽缓冲液），在凝胶上加8V/c

37、m的电压，等染料前沿移动到分离胶后，将电压增加至15V/cm，电泳至溴酚蓝移动至分离胶底部时停止供电。 （11）从电泳仪上移走玻璃板，切除凝胶底部一角以标记方向，小心剥下凝胶，转移到大培养皿中，用水冲洗数次。 3. 用考马斯亮蓝对聚丙烯酰胺凝胶进行染色 （12）将凝胶浸没在考马斯亮蓝R-250染液中。 置于缓慢旋转平台上室温下染色1小时左右。 （13）倾出染色液，回收至容器中以供下次使用，将凝胶浸泡在甲醇:乙酸溶液（不含染料）中置于缓慢转动平台上脱色，每隔20分钟更换一次脱色液，直到蛋白质在透明的凝胶背景上显示为蓝色条带。 （14）凝胶可以进行拍照或置于两张玻璃纸间用凝胶真空干燥仪进行干燥后永

38、久保存电泳图谱，凝胶还可以长时间保存于7乙酸中。 五、 实验指导 1. 预习要求 （1）了解不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以有很高的分辨率是因为有三种效应，即浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。 （2）掌握做好本实验的关键步骤。 2. 注意事项 （1）制胶时应注意不能产生气泡，加水覆盖勿扰动胶面。 （2）过硫酸氨溶液只能使用一星期，否则将延缓凝胶的聚合。 （3）丙烯酰胺（Acr）及甲叉双丙烯酰胺（Bis）的原液会由于水解作用而形成丙烯酸和NH3。溶液装在棕色瓶中，贮于冰箱（4），能部分防止水解。 但也只能贮存12个月。可用测pH值（4.95.2）的方法来检查是否失效，失效溶液不能聚合。注意：Acr和Bis是神经性毒剂。 对皮肤有刺激作用，操作时必须戴医用手套。 避免与皮肤接触。 （4）N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）：应密封避光保存。作为聚丙烯酰胺凝胶聚合时的加速剂，亦可用三乙醇胺或二甲氨基丙腈（DMPN）代替。 （5）电泳后迅速剥胶，防止色带扩散。 3. 结果讨论 聚丙烯酰胺凝交聚合的催化体系有哪两种？如何控制使凝胶在一小时内完成聚合。 以使凝胶的性质稳定。 4. 实验后思考 （1）影响电泳泳动速度的因素有哪些？ （2）样品中加入40% 蔗糖溶液的作用是什么？ （3）上、下槽电极缓冲液用过一次后，是否可以混合后再用？为什么？ （4）做好本实验的关键步骤有哪些？为什么？