酶工程第一篇主要内容.doc

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1、第一章 绪论 （A）一、酶(enzyme)是由生物体产生的具有催化功能的生物大分子。分类：蛋白类酶、核酸类酶二、酶工程：酶的生产与应用的技术过程三、酶工程的主要任务：经过预先设计，通过人工操作, 获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 三、酶工程的主要内容包括：酶的生产；酶的提取与分离纯化；酶分子修饰；酶固定化；酶的非水相催化；酶分子定向进化；酶反应器和酶的应用四、酶发展史1878年,库尼Kunne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶(enzyme),该词源于希腊文,意为”在酵母中”。1926年,萨姆纳Sumner首次从刀豆中分离纯化出脲酶结晶,证明其有蛋白质性质.1971年

2、，在美国举行了第一届国际酶工程学术会议，会议的主题是固定化酶。1982年，切克Cech等人发现RNA也具有催化活性。1983年,阿尔特曼Altman等人发现核糖核酸酶P的RNA部分具有该整体酶的催化活性,而该酶的蛋白质部分无催化活性。Cech和Altman因发现RNA具有催化活性而共同获得1989年诺贝尔化学奖.第二节 酶的命名和分类一、蛋白类酶的分类与命名（一）推荐名（习惯命名）通式：底物的名称催化反应的类型“酶”字说明：对于水解酶类，其催化的为水解反应，在命名时可省去说明反应类型的“水解”字样，只在底物名称之后加上酶。（二）系统命名通式：酶作用底物酶作用基团催化反应类型“酶”字酶分类：1、

3、氧化还原酶类 、2、转移酶类、3、水解酶类、4、裂合酶类、5、异构酶类、6、合成酶类（三）蛋白类酶（P酶）的分类原则为：1、按照酶催化作用的类型，将蛋白酶分为6大类，分别为氧化还原酶类 、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。2、每个大类中，按照酶催化作用的底物、化学键或基团的不同，分为若干亚类。3、每一亚类中再分为若干小类。4、每一小类中包含若干个具体的酶根据系统命名法，每一种具体的酶，除了有一个系统名称以外，还有一个系统编号（四码编号）。二、核酸类酶（R酶）的分类与命名（一）分类：分子内催化R酶：催化本身RNA分子进行反应的R酶。分子间催化R酶：催化其他分子进行反应的核酸类酶。

4、1、分子内催化R酶（1）自我剪切酶：在一定条件下催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶(2)自我剪接酶：在一定条件下催化本身RNA分子同时进行剪切和连接反应的R酶。根据结构特点和催化特性的不同，分为两类含型IVS的R酶与四膜虫rRNA前体的IVS结构类似，自我剪接时需要Mg2+、鸟苷或5鸟苷的参与含型IVS的R酶与细胞核mRNA前体的IVS结构类似，需Mg2+参与。2、分子间催化R酶催化其他分子进行反应的核酸类酶。根据作用底物分子不同，分为RNA剪切酶：催化其他RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。DNA剪切酶：催化其他DNA分子进行剪切反应的核酸类酶。多肽剪切酶：催化多肽分子剪接作用的核酸类酶。多

5、糖剪切酶：催化多糖分子剪切和连接接作用的核酸类酶。多功能酶：催化其他分子进行多种反应的核酸类酶。如：L19-IVS第三节 酶的活力测定一、酶活力：指在一定条件下，酶所催化的反应初速率。二、酶活力测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法三、酶活力测定的一般步骤：A：根据酶的专一性，选择适宜的底物，并配成一定浓度的底物溶液。B：确定反应的温度、pH值等条件。C：在一定条件下，将酶液与底物混匀，适时记下反应开始的时间。D：反应到一定时间，取出适量反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。注意：若不能即时测出结果，需要及时终止反应，然后再测定。E：采用光学检测法、化学检测法等生

6、化监测技术，测定反应液中物质的变化量。终止酶反应的方法：P9页 （1-4）四、酶活力单位：1961年国际生化学会（IUB）酶学委员会建议使用统一的国际单位。酶的国际单位定义：在实验室规定的条件下，每分钟催化lumol底物转化为产物的酶量为一个酶活力国际单位(用“IU”表示，简写为U)。卡特（Kat）:在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1Kat。IU与Kat之间的换算：1Kat=6107IU习惯单位：比活力酶的比活力：指在特定的条件下，单位质量（mg）酶蛋白（或RNA）所具有的酶活力单位数。酶比活力酶活力（单位）/mg酶蛋白（或RNA）同种酶制剂，比活力可以反应酶的纯度和活

7、力的高低。第一篇 酶的生产酶的生产：通过各种方法获得所需酶的技术过程。酶的生产方法可以分为：提取分离法、生物合成法、化学合成法。其中提取法是最早采用的而沿用至今的方法，生物合成法是五十年代以来酶生产的主要方法，而化学合成法仍在实验室阶段。第二章 酶生物合成的基本理论第三节 酶生物合成的调节（A）根据生物合成类型可把酶分为两类：组成型酶和适应型酶组成型酶：有的酶在细胞中的量比较恒定，环境因素对这些酶的合成速率影响不大，这些酶称为组成型酶。适应型酶或调节型酶：有些酶在细胞中的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。一、原核生物中酶生物合成的调节机制转录水平的调节，又称为基因的调节是原核生物

8、中酶生物合成的主要调节。操纵子：基因表达的协调单位，是由调节基因、启动子、操纵基因和结构基因组成的一个完整的基因表达单位，其功能是转录mRNA。如：乳糖操纵子1、酶生物合成的诱导作用：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用，简称诱导作用。诱导物一般是酶催化作用的底物、其底物类似物或者是酶催化反应的产物。酶催化作用的底物、其底物类似物诱导。如：利用大肠杆菌采用发酵法生产B-半乳糖苷酶时，可在培养基中加入该酶的作用底物乳糖或其底物类似物IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）作为诱导物，诱导B-半乳糖苷酶的合成。酶催化反应的产物诱导：有些酶可以由其催化反应的产物诱导

9、产生。如：半乳糖醛酸是果胶酶催化果胶水解的产物，它可以作为诱导物，诱导果胶酶的生物合成。2、分解代谢物阻遏作用：是指有些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。产生原因：细胞内cAMP消耗量增多：某些物质（如葡萄糖）经分解代谢放出能量，一部分能量储存在ATP中。ATP的形成需要消耗AMP，而AMP的形成需要消耗cAMP，导致细胞内cAMP消耗量增多。细胞内cAMP合成量减少：葡萄糖分解代谢的降解物使腺苷酸环化酶（合成cAMP所需的酶）的活化受到抑制，从而使cAMP的生成受阻。以上两方面的作用导致细胞内cAMP的浓度降低。3、酶生物合成

10、的反馈阻遏作用：又称为产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。阻遏物一般是酶催化反应的产物或使代谢途径的末端产物。例如：无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单酯水解的产物，它的过量存在会阻遏碱性磷酸酶的生物合成；色氨酸在大肠杆菌细胞的合成需要四种酶，色氨酸作为色氨酸合成途径的终产物。它的过量积累会导致这4种酶的生物合成受阻。解除方法：控制末端产物的浓度，即控制阻遏物的浓度。注意：酶催化反应的产物可能使诱导物也可能是阻遏物。不同的酶情况不同。二、真核生物酶生物合成的调节1、细胞分化改变酶的生物合成真核生物个体发育的不同阶段和不同类型的分化细胞中，基因的表达存

11、在很大差异。随着细胞的分化，酶的生物合成由于受到不同的调节控制而发生显著变化。如：端粒酶存在于人类胚胎细胞中，人体正常细胞检测不到端粒酶活性。（1）端粒酶：催化端粒合成和延长的酶。 端粒酶是一种核糖核蛋白包含蛋白质和RNA两种基本成分。其中RNA组分中含有构建端粒重复序列的核苷酸模板序列。（2）端粒酶的催化过程：结合：端粒酶分子的RNA重复序列与DNA端粒末端按照互补原则结合。延伸：以端粒酶分子的RNA为模板，通过反转录作用，使DNA分子上的端粒延伸。移位：端粒酶移动到延伸后的端粒末端。重复上述过程，反复进行，使端粒不断延伸。2、基因扩增加速酶的生物合成基因扩增是通过增加基因的数量来调节基因表

12、达的一种方式。发生原因：细胞急需某种酶时，作为应急手段，使某种酶的合成大量增加。发生时间：个体发育的某一阶段或细胞分化的某一过程。3、增强子促进酶的生物合成增强子又称为调变子，是一段能高效增强或促进基因转录的DNA序列。作用：在酶的生物合成过程中，高效增强某些酶基因的表达。4、抗原诱导抗体酶的生物合成1、抗体酶又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体酶的特点：具有抗体的高度特异性；具有酶的高效催化能力。 人工设计的2、抗体酶的制备（1）修饰法：对抗体进行分子修饰，在抗体上引入催化集团，而成为具有生物催化活性的抗体。（2）诱导法：在特定抗原诱导下合称抗体酶的方法。第三章 酶的生物

13、合成法生产第一节 产酶细胞的选择（A）一、用于酶生产的细胞（优良的产酶细胞）必需具备的特点： （1）酶的产量高 （2）容易培养和管理 ：生长速率高、营养要求低。（3）产酶稳定性好 （4）利于酶的分离纯化：最好是胞外酶。 （5）安全可靠,无毒性二、主要产酶微生物：细菌：大肠杆菌；枯草杆菌放线菌：链霉菌霉菌：黑曲霉；米曲霉；红曲霉；青霉；木霉；根霉；毛霉酵母：啤酒酵母；假丝酵母第二节 培养基的配制（C）培养基一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等几大类组分。不同细胞对氮源的要求不同动物细胞：有机氮源；植物细胞：无机氮源；微生物：一般使用混合氮源第三节 产酶工艺条件及其调节（A）酶生产的工艺流程 课

14、本P33 图3-1一、细胞活化与扩大培养1、细胞活化：在细胞的应用过程中，保藏的细胞必须接种于新鲜的培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复，这个过程称为细胞活化。2、扩大培养：二、产酶工艺条件的优化及其控制（一）pH值的调节控制1、进行pH调控的原因：（1）不同细胞其生长繁殖的最适pH有所不同。（2）细胞产酶最适pH与其生长最适pH往往有所不同。（3）有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，可以改变各种酶之间的产量比例。（4）随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的pH往往会发生变化。因此，在产酶的过程中必须根据变化的情况进行必要的pH调节

15、控制。2、调解pH的方法：改变培养基的组分或其比例；也可以使用缓冲液来稳定pH；或者在必要时，通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。（二）温度的控制 1、进行温度调节的原因（1）不同细胞有各自不同的最适生长温度。枯草杆菌 34-37；植物细胞 22-28（2）有些细胞产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。要在不同阶段控制不同的温度，即在细胞生长阶段，温度控制在细胞生长的最适温度范围；在产酶阶段，温度控制在产酶最适温度范围。 （3）细胞在生长和产酶过程中，由于新陈代谢，会不断放出热量，使培养基的温度升高；由于热量的扩散，会使

16、培养基的温度不断降低。两者综合的结果，决定了培养基的温度。必需及时调节培养基温度，使其维持在适宜的范围内。2、调节温度的方法：热水升温、冷水降温(三)溶解氧的控制1、进行溶解氧调控的原因：在酶的生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很多差别，因此必需根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。2、溶解氧的调控调节通气量通气量：单位时间内流经培养液的空气量。在其他条件不变的情况下，增大通气量，可以提高溶氧速率；减少通气量，则溶氧速率降低。调节氧的分压：提高氧的分压，可以增加氧的溶解度，从而提高溶氧速率。方法：增加发酵容器中的空气压力；增加通入空气中的氧的含量

17、。调节气液接触时间：气液两项的接触时间延长，可以使氧气有更多的时间溶解在培养基中，从而提高溶氧速率。方法：增加液层高度、降低气流速度、在反应器中增设挡板、延长空气流经培养液的距离等调节气液接触面积增加气液两项接触面的面积，提高溶氧速率。方法：在发酵容器底部安装空气分配管，使气体分散成小气泡进入培养液；装设搅拌装置或增设挡板，以进一步打碎气泡。改变培养液性质培养液粘度大，在气泡通过培养液时，尤其在高速搅拌的条件下，会产生大量泡沫，降低氧溶解率。方法：通过改变培养液组分或浓度降低培养基粘度；通过设置消泡装置或添加适当消泡剂来消除泡沫。在生产过程中，应尽量控制溶氧速率等于耗氧速率第四节 微生物发酵产

18、酶 一、微生物发酵产酶的方式（B）1.固体培养发酵:特别适合于霉菌培养 2.液体深层发酵:目前酶发酵生产的主要方式 3.固定化细胞发酵:需要特殊的固定化细胞反应器 4.固定化原生质体技术：适用于胞内酶的生产 二、 提高酶产量的措施（A）首先要选育或选择使用优良的产酶细胞，保证正常的发酵工艺条件并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。此外还可以采取以下措施：1、添加诱导物酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物，也不是酶的反应产物，而是可以与酶结合又不能被酶催化的底物类似物。2、控制阻遏物浓度阻遏作用分产物阻遏和分解代谢物阻遏二种。阻遏物可以是酶反应产物、代谢途径末端产物和分解代谢物。减少分解代谢物

19、阻遏的方法：（1）控制培养基中葡萄糖等容易利用的C源浓度；（2）采用其它较难利用的C源（如淀粉等）；（3）采用分批流加C源的方法；（4）在分解代谢物存在的情况下，添加一定量的环腺苷酸（cAMP），可迅速解除分解代谢物阻遏作用。 解除产物阻遏的方法：控制末端产物的浓度，即控制阻遏物的浓度。3、添加表面活性剂 表面活性剂作用：它们可积聚在细胞膜上，增加细胞的通透性，有利于胞外酶的分泌，所以可以增加酶产量。添加适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。4、添加产酶促进剂产酶促进剂：可以促进产酶，但作用机理并未阐明清楚的物质。 添加

20、产酶促进剂往往对提高酶产量有显著效果。三、酶发酵动力学（一）酶生物合成的模式（A）1、同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系， 又称为生长偶联型。特点：属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反应产物阻遏。这类酶所对应的mRNA很不稳定。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。2、延续合成型 特点：酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还

21、可以延续合成一段较长时间。可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。 所对应的mRNA相当稳定。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。3、中期合成型 特点：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。 所对应的mRNA是不稳定的。4、滞后合成型 特点：此类型酶在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。受到阻遏物的阻遏作用。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。许多水解酶的生物合成都属于这一类型

22、。总结：影响酶生物合成模式的主要因素：mRNA的稳定性、培养基中阻遏物的存在。 酶生产中最理想的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于其它的产酶模式如何提高产酶量：同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度 。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。（二）细胞生长动力学（C）细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出

23、了表述微生物细胞生长的动力学方程。莫若德生长动力学模型：课本56页(二) 产酶动力学（B）产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响。细胞产酶动力学与细胞比生长速率和细胞浓度以及细胞产酶模式有关。一般产酶动力学方程可表达为：式中 X细胞浓度(g /L) U细胞比生长速率(h-1) a生长偶联的比产酶系数(IU/g) B非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh) E酶浓度(IU/L) t时间(h)生长偶联型：同步合成型、中期合成型，其方程为：部分生长偶联型： 滞后合成型，其方程为： 非生长偶联型：延续合成型，其方程为： 第五节 植物细胞培养产酶一、植物细胞的特性（C）（1）细胞体积大

24、；（2）生长速率和代谢速率比微生物低，生长倍增时间、生长周期比微生物长；（3）营养要求较为简单；（4）细胞生长需要一定的光照时间；（5）对剪切力敏感；（6）主要用于生产色素、药物、香精和酶等次级代谢产物。 二、植物细胞培养的特点（C）1、植物细胞培养的优点：1）提高产率。2）缩短周期 3）易于管理，减轻劳动强度 4）提高产品质量2、植物细胞培养的缺点 1）与微生物相比，植物细胞培养具有对剪切力敏感、生长周期长等缺点。2）许多植物细胞培养需要光照。三、植物细胞培养的工艺条件及其控制（C）（1）温度控制：一般在25左右 （2）pH控制：配制培养基时pH为5.5-5.8（3）溶解氧的调节控制：通风与

25、搅拌 （4）光照的控制：根据植物生长阶段和次级代谢产物生产过程中对光照的不同需求，选择不同波长的光、不同光照强度和光照时间。（5）前体的添加前体：处于目的代谢物代谢途径上游的物质。添加前体可以提高代谢物产量。（6）刺激剂的应用刺激剂的作用：强化次级代谢物的生物合成。常用刺激剂：微生物细胞碎片、果胶酶、纤维素酶等微生物胞外酶。四、植物细胞培养产酶的过程（B） 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例(1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入

26、含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。 (2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux

27、，12h/d光照条件下震荡培养18d。(3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。第六节 动物细胞培养产酶 （B）一、动物细胞的特点（C）1、没有细胞壁 2、体积大（是微生物细胞的几千倍，稍小于植物细胞）3、在细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性、功能全能性4、营养要求复杂：需添加5%-1%的血清二、动物细胞培养的特点（C）课本69页三、动物细胞培养方法 （C）(1)悬浮培养 (2)贴壁培养 (3)贴附悬浮培养： 微载体培养、 包埋和微囊培养 结团培养四、培养条件的影响与控制（C）（1）温度：一般控制在36.5.（2）pH值：一

28、般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。（3）渗透压: 应与细胞内渗透压相同。（4）溶解氧：根据情况随时调节。五、动物细胞培养产酶的工艺过程（B）以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）为例1、培养基配制：采用已商业化的Eagle培养基。2、细胞培养（1）制备细胞悬浮液将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理、分散，用pH7.4的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液。（2）悬浮培养将细胞悬液接种至含培养液的无菌反应器中。于37的CO2培养基中培养至长成单层细胞。（3）继代培养倾去培养液，用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2-3次。换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养3-4天

29、。取出培养液进行tPA的分离纯化。3、组织纤溶酶原激活剂的分离纯化在培养液中加入一定量的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，过滤去沉淀，适当稀释后，采用亲和层析技术进行分离，得到tPA溶液。经过浓缩、葡聚糖G-150凝胶层析、冷冻干燥得到tPA干粉。第四章 酶的提取与分离纯化一、细胞破碎（A）细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等。表3-1 细胞破碎方法及其原理分 类细胞破碎方法 细胞破碎原理机械破碎法捣碎法研磨法匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

30、化学破碎法添加有机溶剂添加表面活性剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎二 酶的提取（A）酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。提取目标：a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。提取原则：a. 相似相溶。b. 远离等电点的pH值，溶解度增加表4-2 酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26

31、的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶（二）影响酶提取的主要因素1、温度： 一般采用低温下（010）操作。在不影响酶活性的条件下，适当提高温度。2、pH值： 在等电点条件 下，酶的溶解度最小。 提取时pH值应该避开酶的等电点。3、提取液的体积：提取液的总量一般为原料体积的35倍。三.沉淀分离（A）沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。表4-3 沉淀分离方法沉淀

32、分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使

33、酶与杂质分离盐溶与盐析：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶。而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。四、离心分离（C） 密度梯度离心 等密度梯度离心梯度介质通常用蔗糖 通常用CsCl离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止， 使各组分沉降到其平衡的密度区，短时间，低速度 长时间，高速度分离依据密度相近，但沉降系数不同 沉降系数相近，但密度不同五、过滤与膜分离（C）过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜

34、等。根据过滤介质的不同, 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。六.层析分离（B）层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物

35、分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离七、电泳分离（C）带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。按其使用的支持体的不同，可以分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳等。八、萃取分离（C）萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。九、结晶（B）结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。纯度：通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。浓度：结晶时酶液浓度应当控

36、制在介稳区，即酶浓度处于稍微过饱和的状态。1、盐析结晶法：在适当的温度和pH值等条件下，于接近饱和的酶液中缓慢增加某种中性盐的浓度，使酶的溶解度慢慢降低 ，达到稍微过饱和状态，而析出酶晶体的过程。 方法：向酶液中缓缓加入饱和盐溶液，使酶液呈现浑浊状态，并在低温（1-10）条件下放置一段时间，待其慢慢析出结晶。 通常采用的中性盐是硫酸铵 2、有机溶剂结晶法有机溶剂结晶是在接近饱和的酶液中慢慢加入某种有机溶剂，使酶的溶解度降低，而析出酶晶体的过程。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇、甲醇、异丙醇、甲基戊二醇、二甲亚砜等。3、透析平衡结晶法：将酶液装进透析袋，对一定浓度的盐溶液进行透析，使酶液逐步达到过饱和状态而析出结晶的过程。 4、等电点结晶法：通过缓慢改变浓酶液的pH值，使之逐渐达到酶的等电点，而使酶析出结晶的过程。十、浓缩与干燥（B）（一）浓缩 浓缩：从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度酶液的过程。 常用蒸发浓缩 （二）干燥 干燥：将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。