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1、食药用菌液体菌球生产标准编写刘随记 二零一四年六月二十六日 目录一、封面-1二、目录-2三、标准范围-3四、本标准所引用的规范性文件和文献-3五、关键专业术语和定义-3六、液体菌球生产技术要求-6七、基本生产设施和设备-7八、液体菌球生产工艺流程图-8九、液体菌球生产技术工艺要求-8食药用菌液体菌球生产标准一、 范围本标准规定了食药用菌菌球生产厂房、各种设施、设备、品种、工艺流程、技术要求、保藏运输。本标准适用于食药用菌液体菌球的生产。二、本标准所引用的规范性文件和文献2.1 GB/T4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 2.2 GB5749-2006 生活饮用水
2、卫生标准 2.3 GB/T 5009.98-2003 食品容器及包装材料用不饱和聚酯树脂及其玻璃钢制品卫生标准分析方法 2.4 GB50073-2001 洁净厂房设计规范2.5 GB/T 29859-2013 生物信息专业术语 2.6 GB150-1998 钢制压力容器 2.7 NY/T 883-2004 家用微生物菌剂生产技术规程2.8 DB21/T 16932008 食用菌液体菌种生产技术规程三、关键专业术语和定义下列专业术语和定义适用于本标准。3.1 移动式液体培养器 mobile cultivation apparatus for edible fungus liquid spawn指
3、在液体菌球养器上安装了可移动的装置，培养器工作时能整体移动，而移动中又不影响培养器的性能。3.2 液体菌球接种器材 edible fungus-liquid interface trap inoculator指能将菌种从培养器中按无菌操作要求转接到液体菌球液体上的设备。3.3 接种量 inoculation amount指接入培养器中的菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比标示。3.4 液体菌种菌龄 period of liquid spawn running指菌种接入培养基开始计算的液体菌球生长发育时间。3.5 培养器空消 empty fermenter cultivation appa
4、ratus 指对用外源蒸汽灭菌，尚未加水投料的空培养器进行高压蒸汽灭菌。3.6 培养器实消 full fermenter cultivation apparatus 指对投料后的培养器进行高压蒸汽灭菌。3.7 投料feeding 指将配置好的培养液投放到培养器中。3.8 定容 constant volume 指培养器中加入培养液后，加水至所要求体积。3.9摇瓶液体菌种 liquid spawn in shake pot 指装在玻璃三角瓶内在摇床上恒温振荡培养的液体菌种。 3.10 起始pH initial pH value 指液体培养基配置后尚未接种时的pH值。3.11 镜检 microsco
5、pic examination 指通过显微镜观察食药菌液体菌球生长发育和有无杂菌污染的过程。 3.12 外源蒸汽灭菌 exogenous steam sterilization 指用锅炉蒸汽给培养器灭菌的方法。3.13 固体专用菌种瓶 solid special strain combination 指将检验合格的固体专用种按无菌操作要求，转移至装有无菌水的大三角瓶中，充分搅拌呈均匀的液态菌种的过程。3.14 死角 dead angle 指培养器蒸汽灭菌时未能达到彻底灭菌的地方。 3.16 恒温培养摇床thermostatic culture cradle指具有不锈钢万用夹具、数显控温、无级调
6、速和良好的热循环功能，是一种多用途的生化器，适用于菌种各种液态菌球振荡培养。3.17 回旋式振荡器cyclotron oscillator指具有外形大方，容量大，噪音低，重量轻，体积小等特点，速度可调，并带有定时装置。3.18 生物接种箱biological inoculation box指有各种形状和规格，只要操作方便，能达到无菌状态的机器设备。3.19 超净工作台clean bench指一种智能化控制操作区高洁净度工作环境的空气净化设备。3.20高压杀菌器 autoclave指用比常压高的压力，把水的沸点升至100以上的高温，而进行液体或器具灭菌的一种高压容器。3.21 试管test tu
7、be指用作于少量试剂的反应容器，在常温或加热时使用。3.22 显微镜 microscope 指主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。3.23 恒温培养箱constant incubator 指作细菌培养、育种、发酵及其他恒温试验用的机器设备。3.24 生物培养箱biology incubator 指具有制冷和加热双向调温系统温度可控的功能的机器设备。3.25 菌种culture指用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物。四、液体菌球生产技术要求4. 技术人员4.1 食药用液体菌球生产应有与液体菌球生产所需的专业技术人员。4.2工作人员卫生要求4.2.1 生产操作人员应该保持良好的个人卫生
8、，勤洗澡、勤换衣、勤理发、不保留长指甲。4.2.2 进入生产车间必须穿戴经灭菌的工作服、口罩、鞋、帽。4.2.3 严禁在生产车间内吸烟，随地吐痰和乱扔杂物。4.3 食药用菌液体菌球生产车间设计达到NY/T528-2002标准要求。4.3.1 食药用菌液体菌车间必须建在交通、水源和电源方便，无有害气体、烟雾，远离垃圾场和畜禽场舍的地方。 4.3.2 生产车间地面应具备防水、防腐蚀、防渗漏、防滑、易清洗，有适当的排水坡度（1.0%1.5%）和良好的排水设施。 4.3.3 生产车间墙壁和顶部应能防潮、防霉、防水、易清洗。4.3.4 生产车间门窗应设置有防各种蚊虫的纱网。4.3.5 生产车间入口处应设
9、置洗手、消毒和干手设施。4.3.6 生产车间要安装排风设备。4.3.7 生产车间必须设置缓冲间。4.3.8 生产车间应设置与职工人数相适应的更衣室、浴室、厕所。4.3.9 生产车间应设置封闭式废弃物专用桶。五、基本生产设施和设备 5.1 培养摇床、回旋振荡器、生物接种箱、生物培养箱、电子天平、酸度仪、空气压缩机、液体菌种接种器材、高压蒸汽灭菌锅、蒸汽锅炉、净化工作台、恒温摇床、恒温培养箱、冰箱、显微镜、磅秤、天平、自备电源（发电机）。培养器、高压灭菌锅和蒸汽锅炉应使用政府有关部门检验合格，符合国家压力容器标准的产品。5.2 生产用具玻璃三角瓶、接种器材、试管、量杯量瓶、玻璃漏斗、菌浆瓶、药棉、
10、定量定性滤纸、精度pH试纸等。5.3 基本操作车间设施配料间、杀菌间、冷却间、接种间、培养间、化验室、菌种保藏室的基础设施要配套，布局合理，要有最基本温控设施。 5.4 培养原料符合WST232-2002商业性微生物培养基质量检验规程。5.5 化学试剂类符合NY/Y528-2002食药用菌菌种生产技术规程要求。5.6 生物制剂和天然材料类符合NY/Y528-2002食药用菌菌种生产技术规程要求 。5.7 生产品种符合NY/Y528-2002食药用菌菌种生产技术规程要求和GB/T12728-2006食用菌术语相关规定。应使用经省和国家级以上农作物品种审定委员会登记的食药用菌品种。 六、液体菌球生
11、产工艺流程图固体菌种专用培养基 检验合格分离引进菌种 接种自然凝固冷却 高压灭菌121126，40min 合格菌浆菌种质量检测恒温培养1825，25d-40d 121126,30min 高压灭菌 制作培养液液体专用培养基配方 1825,5d7d 振荡培养 接种质量检测自然冷却 菌球培养二级造粒培养一级造粒培养合格液体菌球 质量检测合格液体菌球 七、 液体菌球生产技术工艺要求(一)、菌浆菌种的培养 7.1.1 菌浆菌种专用瓶使用玻璃植被瓶和棉塞，植被瓶250 ml，棉塞要使用梳棉，不应使用脱脂棉。7.1.2菌浆菌种培养基一般使用马铃薯葡萄糖琼脂通用培养基。 7.1.3 分装菌种培养基的分装量为5
12、0 ml。7.1.4 灭菌菌浆菌种培养基分装后应立即灭菌。0.11Mpa0.14 Mpa，30min。灭菌完毕后，应自然降压，不应强制降压。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。7.1.5 灭菌效果的检查灭菌后的培养基置于28恒温培养48 h后检查，并经显微镜镜检确定无微生物长出为灭菌合格。7.1.6 接种在无菌条件下用接种器材将菌种移植在菌浆菌种培养基上。7.1.7 超净工作台消毒处理方法先用75%酒精或新洁尔灭溶液进行菌种培养基外部表面擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌30min。7.1.8 无菌接种操作超净工作台上要严格按无菌操作要求接种。将引进或购买的食药用菌菌种接种到培养基上，然后再把培养基和菌种用
13、专用的工具搅拌成0.3颗粒状。接种完毕后及时贴好标签。7.1.9 超净工作台接种后的处理每次使用后，要及时清理清洁，排出废气，清除废物，台面要用75%酒精或新洁尔灭溶液擦拭消毒，然后开紫外灯灭菌30min。7.1.10 培养室消毒处理在使用培养室的前两天，要使用二氧化氯烟雾剂熏蒸消毒处理。7.1.11 培养室条件要求培养温度（ 1828），培养时间2540d,保持空气相对湿度在65%75%，注意避光。 7.1.12 培养期间的检查培养期间应定期检查，及时挑出不合格菌种。7.1.13入库完成培养的菌浆菌种及时登记入库。7.1.14 记录生产各环节应详细记录。7.1.15 留样留样的数量应以每个品
14、种3支5支，于4下贮存。（二）液体菌球菌种培养7.2 液体菌球培养基配方7.2.1.1配方1：马铃薯、葡萄糖、麦麸、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1聚氧丙稀甘油、pH值自然；7.2.1.2配方2：马铃薯、葡萄糖、麦麸、苹果汁、维生素B1、pH值自然；7.2.1.3配方3：甘薯、葡萄糖、磷酸二氢钾、pH值自然；7.2.1.3配方4：大米浸出液、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、pH值自然7.2.2 原材料符合NY/T528-2002标准要求。具体配方根据生产品种的营养需求，用水符合GB5749-2006，生活饮用水卫生标准。7.2.3起始pH值培养基调节起始pH6.56.8。7.2.4 投料与定容将
15、熬制好的液体培养液分别装入1000ml的三角瓶内，装入量为300ml,塞上特制的棉塞，用牛皮纸把棉塞包住以免受潮。 7.2.5 培养基灭菌 灭菌器内蒸汽压力达到0.105 Mpa 0.125Mpa，培养基温度达到温度121124，保持时间40min，防止灭菌死角。7.2.6 冷却降温灭菌结束使培养基自然降温至常温。 7.2.7接种把灭菌后的液体培养基、菌桨菌种、所有的接种用具放入超净工作台内用臭氧和紫外线分别消毒30分钟，然后迅速将菌种移入到液体培养基中并塞紧棉塞， 接种完毕，液体菌种进入培养阶段。7.2.8 培养温度 接种后的液体菌球菌种要放在旋转式振荡器上进行培养，培养温度1825。7.2
16、.9 培养时间 液体菌球菌种的培养时间要以品种而定，担子菌57天，子囊菌3545天。7.3 留样与检测7.3.1 留样将培养的液体菌球菌种2%取出放在4生化培养箱，进行留样保存。7.3.2 无菌检测对留存的液体菌球菌种样品应在无菌PDA平板上划线培养，在2528恒温培养2d5d，若划痕上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌球生长发育状态和有无杂菌污染。7.3.3 pH值采用酸度计测定，应在规定范围之内。7.3.4 菌液湿重采用15cm的定量滤纸，将100ml液体菌液，过滤至无水水滴滴下，称重后减去滤纸湿重。7.3.5 镜检采用显微镜，低倍、高
17、倍、油镜，观擦菌丝生长状况和有无杂菌污染。7.3.6 测试液体菌种感官指标 表1 液体菌种感官指标感官检测名称感官指标菌球菌种色泽液体菌球菌种呈白色或乳黄色，滤液呈棕色或乳黄色。菌球菌种形状菌液菌球稍粘稠，菌粒悬浮、分布均匀、4低温保藏有下沉现象，分离开的液体为黄白色或微棕色。在1825 放置一周液体表面会有厚垣菌膜形成。菌球菌种的气味有独特的菌体香味，无酸、辛、苦、臭味等异味。7.3.7 液体菌种理化检测指标 表2 理化指标液体菌球菌种理化检测名称理化指标pH值在品种正常范围内菌粒湿重（g/100ml）10显微镜下观察液体菌球菌种和杂菌鉴别菌粒内原生质分布均匀、染色剂着色深。无霉菌菌丝，酵母
18、和细菌菌体。留存样品无菌检查在上划痕处无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长。7.3.8记录与存档液体菌球菌种生产的每个环节都要有详细的生产记录，并由主管领导审核，签字后归档保存。7.4贮存运输在的冰箱中可保存3d。 （三）液体菌球的培养8造粒液体菌球培养液配方8.1.1配方1：马铃薯、玉米粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、聚氧丙稀甘油、pH值自然；8.1.2配方2：麦麸、葡萄糖、麦麸、苹果汁、维生素B1、pH值自然；8.1.3配方3：鲜苹果、葡萄糖、磷酸二氢钾、酵母膏、pH值自然；8.1.4配方4：大米、玉米粉、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、pH值自然。 8.2 原材料符合NY/T528-
19、2002标准要求。具体配方根据生产品种的营养需求，用水符合GB5749-2006，生活饮用水卫生标准。8.2.1 起始pH值培养基调节起始pH5.57.5。8.2.2 投料与定容将熬制好的液体培养液分别装入1000ml的三角瓶内，装入量为00ml,塞上特制的棉塞，用牛皮纸把棉塞包住以免受潮。 8.2.3培养基灭菌 灭菌器内蒸汽压力达到0.105 Mpa 0.125Mpa，培养液温度达到温度121124，保持时间0min，防止灭菌死角。8.2.4 冷却降温灭菌结束后使培养液自然降温至常温。 8.2.5接种把灭菌后的培养液及所有的接种用具放入超净工作台内用臭氧和紫外线分别消毒30分钟，然后迅速将菌
20、球菌种移入到液体培养液中并塞紧棉塞， 接种完毕后，菌球液体进入培养阶段。8.2.6接种量一级造粒每瓶接入量为，二级造粒每瓶接入量，菌球培养接入量。8.2.7培养温度 接种后的菌球菌液要放在摇床上进行培养，培养温度1825。8.2.8培养时间 液体菌球的培养时间为，一级造粒天，二级造粒天，菌球培养天。8.3留样与检测8.3.1留样将培养的液体菌球2%取出放在生化培养箱，进行留样保存。8.3.2无菌检测对留存的液体菌球样品应在无菌PDA平板上划线培养，在恒温培养2d5d，若划痕上没有细菌、霉菌、酵母菌菌落生长，则表明该样品无杂菌。对留样样品应在取样后及时镜检，确定菌丝生长发育状态和有无杂菌污染。8
21、.3.3 pH值采用酸度计测定，应在3.96.5之内。8.3.4 菌液湿重采用15cm的定量滤纸，将100ml液体菌球，过滤至无水水滴滴下，称重后减去滤纸湿重。8.3.5 镜检采用显微镜，低倍、高倍、油镜，观察菌球生长状况和有无杂菌污染。 8.3.6 测试液体菌球感官指标 表1 液体菌球感官指标感官检测名称感官指标菌球色泽液体菌球呈白色或乳黄色，滤液呈棕色或乳黄色。菌球形状菌液菌球呈悬浮状、分布均匀、低温保藏有下沉现象，分离菌球为白色或黄白色。在1825 放置一周液体表面会有厚垣菌膜形成。一级造粒菌球直径0.05，二级造粒菌球直径0.2，菌球直径0.40.8.菌球的气味有独特的菌香味，无酸、辛、苦、臭味等异味。8.3.7 液体菌球理化检测指标 表2 理化指标液体菌球理化检测名称理化指标pH值在品种正常范围内菌球湿重（g/100ml）一级造粒；二级造粒；菌球。显微镜下观察液体菌球和杂菌鉴别菌球内原生质为实体，染色剂着色微深。无霉菌菌落，酵母和细菌菌体。留存样品无菌检查在上划痕处无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长。8.4记录与存档液体菌球生产的每个环节都要有详细的生产记录，并由主管领导审核，签字后归档保存。8.5贮存运输在的冰箱中可保存d。 本文来源：菇讯网http:/