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1、中国和美洲大豆胞囊线虫 rDNA-ITS-RFLP和ISSR分析 许艳丽 中国科学院 东北地理与农业生态研究所,引言 材料与方法 结果与分析 致谢,Soybean cyst nematode ,SCN 病原：Heterodera glycines Ichinohe 特点：分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多 休眠体（胞囊）存活时间长 - 极难防治的土传病害 危害:大豆主要病害 一般减产5%-10% 干旱地区20%-30% 严重70%-80% 甚至绝产,引 言,引 言,大豆胞囊线虫病防治 利用抗病品种 轮作,线虫分类鉴定 对于培育抗病品种、控制其危害意义非常重大 传统形态学鉴定： 以形态学、解
2、剖学特征、结合形态测量值为依据 缺点： 表现型特征不稳定 特征多样性少和形态特征测量值重叠 某些特征易受环境条件的影响而造成差异 需要大量线虫样品,引 言,植物寄生线虫分子诊断和鉴定技术,大豆胞囊线虫鉴定,分子生物学技术 随着现代生物技术的发展，分子生物技术逐步引入线虫分类、诊断和鉴定当中。 上个世纪80年代以来，许多学者都在试图利用分子生物学技术和方法直接检测植物寄生线虫种间和种内群体间在遗传组成上的差异、揭示线虫发育的进化关系。 以期克服形态学和生物化学方法存在的缺陷的可行途径 。,引 言,大豆胞囊线虫鉴定,限制性片段长度多态性（RFLP）技术 马铃薯金线虫和马铃薯线虫（Burrows）
3、SCN4号与3号和5号（Kalinsle和Huettle） 短体线虫的三个种(段玉玺和刘维志) 随机扩增多态性DNA（RAPD）技术 广泛用于分析大豆胞囊线虫、马铃薯金线虫和马铃薯白线虫和根结线虫不同毒性和致病型群体遗传变异 花生根结线虫Meloidogyne arenaria、南方根结线虫M.incognita、 爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫M.hapla 扩增片段长度多态性（AFLP）技术 美国和墨西哥烟草胞囊线虫属于不同组,引 言,大豆胞囊线虫鉴定,内部简单序列重复（ISSR）技术 一种新型的分子标记（1994） 主要应用于植物或真菌遗传学研究和作物品种鉴定 核糖体DN
4、A（rDNA）ITS-RFLP技术 稳定的鉴定线虫方法和分析遗传变异的有力工具 在线虫的种和亚种分类中非常有用 应用：胞囊线虫属 Heterodera、珍珠线虫属 Nacobbus、茎线虫属Ditylenchus、根结线虫属Meloidogyne、刺线虫Belonolaimus和许多小杆线虫属等,引 言,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究,材料与方法,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 线虫胞囊和卵的分离： 土样中挑出饱满胞囊-在控温控光温室（16h光、27水床)大豆上繁殖,材料与方法,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 线虫胞囊和卵的分离： 繁殖30d后取出大豆苗 高
5、压水枪强水流冲洗 收集胞囊 (20和60目) 压碎胞囊（100-200-500目） 释放卵和J2 收集到离心管中 2100g离心4min 提取DNA用,材料与方法,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 线虫DNA提取:液氮中冰冻-砸碎 引物：AB28、TW81 RFLP:限制性内切酶(17) AluI, HinfI, HaeIII, BamHI, Hind, Hind, AvaI, ClaI, EcoRI, SstI, XhoI, NcoI, SacI, MboI, AccI,RsaI和Xba。,材料与方法,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究,材料与方法,PCR扩增（50l）:P
6、TC-200 电泳检测：1.5%琼脂糖,大豆胞囊线虫ISSR研究,供试大豆胞囊线虫： 美国、加拿大、阿根廷、中国大豆田间16个群体 23个大豆胞囊线虫近亲系 PCR扩增：（50ul）PTC-200 引物:20个(单引物) 电泳检测：1.5%琼脂糖,材料与方法,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 大豆胞囊线虫rDNA-ITS的PCR扩增结果（1060bp）,结果与分析,SCN rDNA-ITS PCR扩增产物 PCR marker,Hg1, Hg2, Hg3, Hg4, Hg5, Hg6, Hg7, Hg8, Hg9, Hg10, Hg11, Hg12, Hg13, Hg14, Hg15
7、, Hg16,根结线虫，CK，PCR marker,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究,结果与分析,用限制性内切酶HinfI、ClaI、Xba和EcoRI酶切大豆胞囊线虫(H. glycines)rDNA-ITS PCR扩增产物的RFPL分布图。从左至右：用HinfI酶切的Hg1,Hg3, Hg4, Hg7, Hg12；用ClaI酶切的Hg4, Hg7, Hg12；用Xba酶切的Hg4, Hg7, Hg12；用EcoRI酶切的Hg4, Hg7, Hg12， 1000bp DNA marker。,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 AluI和AvaI酶切SCNrDNA-ITS P
8、CR产物的RFLP分布图,结果与分析,从左至右：PRC marker, 用AluI酶切 的Hg12, Hg13, Hg14, Hg15, Hg16, Hg1, Hg4, Hg7；用AvaI酶切 的Hg12, Hg13, Hg14, Hg15, Hg16, Hg1, Hg4, Hg7；PCR marker 所有的中国SCN群体（Hg12,- Hg16）的rDNA-ITS的PCR扩增产物均产生3条RFLP片断，而加拿大、阿根廷和美国所有SCN群体的rDNA-ITS的PCR扩增产物均产生2条RFLP片断,结果与分析,大豆胞囊线虫rDNA-ITS-RFLP研究 17种限制性内切酶酶切rDNA-ITS的
9、PCR产物 25条酶切片段 8种限制性内切酶没能切开 9种限制性内切酶得到了2个以上RFLP片断 其中8种内切酶分别得到了相同RFLP片断 AvaI酶切PCR扩增产物后产生了多态性,大豆胞囊线虫ISSR研究,用引物FISSR2、 FISSR5和FISSR6分别扩增不同国家的大豆胞囊线虫群体Hg3（加拿大）、 Hg8（阿根廷）、 Hg5（美国）、 Hg15（中国）得到了不同的片断,结果与分析,从左至右：1Kb DNA marker, FISSR2扩增的Hg3, Hg8, Hg5, Hg15；FISSR5扩增的Hg3, Hg8, Hg5, Hg15；FISSR6扩增的Hg3, Hg8, Hg5,
10、Hg15,采用rDNA-ITS-RFLP方法可区分中国和美洲SCN群体 限制性内切酶AvaI酶切中国和美洲的加拿大、阿根廷和美国SCN rDNA-ITS的PCR扩增产物后，产生不同的RFLP片断-用此方法可揭示中国和美洲SCN群体种内的遗传多样性 ISSR研究可区分不同地域SCN群体遗传多样性 4个引物可得到SCN不同近亲系多态性的谱带 2个引物可得到加拿大、阿根廷、美国和中国的SCN群体多态性的谱带 此分子标记方法可进行SCN群体不同地域多样性分析,结 论,致 谢,感谢中国农业科学院植物保护研究所彭德良博士的指导和帮助，感谢美国Illinois大学Niblack教授提供试验条件和美洲的大豆胞囊线虫样品，感谢中国留学生邹继军等。,请各位专家、教授批评指正,谢谢！,