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1、11 重组DNA技术,11.1 重组DNA技术是基因工程的核心技术 11.2 获得需要的目的基因（外源基因） 11.3 构建重组质粒和基因克隆 11.4 转化受体细胞和转化子的筛选 11.5 转化子的分析Southern杂交,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,11.1重组DNA技
2、术是基因工程的核心技术,生物技术,获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,11.2 获得需要的目的基因（外源基因）,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,反转录人工合成互补DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题 费时费事 内含子序列,以mRNA为模板，以短的寡核苷酸（oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCT
3、P, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A（polyA）尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。接着，在大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下，再以第一条DNA为模板，人工合成另一条互补的DNA子链。这种经过mRNA反转录人工合成的双链DNA被称为互补DNA（cDNA）。在细胞分化的不同阶段，根据代谢反应的特殊需要，特异性地转录产生编码特殊蛋白的mRNA。因此，用cDNA方法获取的DNA片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应（PCR）,PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基
4、因的技术。,加入4种物质： （1）作为模板的DNA序列； （2）与被分离的目的基因两条链 各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）； （3）TaqDNA聚合酶； （4）dNTP（dATP, dTTP, dGTP和dCTP）,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,聚合酶链式反应（PCR）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30轮循环可获得 230（1.07109)个基因片段 Molecular cell biology 4.0,PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命 美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路 行驶的汽车 1988年发明了PCR技术 1993年获诺贝尔奖,