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1、用聚合酶链式反应（PCR） 进行丹顶鹤的性别鉴定,Sex Identification of Red-crowned Crane by the Polymerase Chain Reaction,December 2004 Joumal of Northeast Agricultural University V0111，No2 151-155 东北农业大学学报 2004年12月刊,LI Jian-hong1，LI Shu-ling1,2，BAO Jun1，BAI Xiu-juan1 (1Life Science College，Northeast Agricultural Universit
2、y，Harbin Heilongjiang 150030，PRC； 2College of Animal Science，Northeast Forestry University，Harbin Heilongjiang 150030，PRC),摘要,东方白鹤的性别决定基因引物被用于详述丹顶鹤W染色体的伴性基因用PCR技术进行性别鉴定。7对成年丹顶鹤和15只年轻丹顶鹤的性别被鉴定出来。通过DNA序列分析，丹顶鹤和东方白鹤的相似性达94.77%。这项研究的结果显示PCR技术在丹顶鹤的性别鉴定中的应用是可行的。 关键词：丹顶鹤；性别决定基因；性别鉴定,据估计，约一半鸟类种族的基因性别不能通过成鸟个
3、体的外观形态鉴定出来，对于幼鸟更困难。鸟类性别的鉴定从根本上是很重要的，不仅仅是因为濒临灭绝种族的繁殖，还因为基础性研究如分子生态学和发育生物学。 过去的几年，外科学和染色体检查都被用于鸟类性别鉴定，随着分子生物学和生物技术的发展，PCR技术的应用成为一种有效的途径。,在用PCR进行性别鉴定中，必须开发特定的性别标记，许多保守的与性别相关的基因已经被发现，它们能被用作标记来提供精确地性别鉴定。 性别相关基因在一些性基因上只有来自雌性或雄性基因的上的一小段能够被放大，比如哺乳动物Y染色体上的SRY(Sex deter mining region Y)gene嘲，ZFy(Zinc Finger，Y
4、)gene问 and AMGY(Amelogenin，Y)gene，雌性鸟类W染色体上的EEO6同，CHDl一W(ChromoHelicaseDNA bindingW gene181,A TPase W gene。用现在引物放大性别决定基因来进行性别鉴定在许多哺乳动物和鸟类中是可能的。,在这个研究中，与性别有关的东方白鹤的W染色体的基因引物被用于扩增丹顶鹤与性别有关的基因，以便探索一种新的用于在野生环境中鉴定这种鸟类性别的方法。,材料和方法,2.1Red-crowned crane and preparation of genomic DNA 丹顶鹤和基因组DNA 1、29只丹顶鹤，其中7对夫
5、妇，15只未成熟的鹤，单独喂养 2、每只鹤的羽毛被收集和标记起来一进行个量分析 3、基因组DNA是用三氯苯酚从羽毛裂缝1cm部分提取出来的，包藏在零下20度,2.2Primers and PCR amplification 引物和PCR扩增仪 1、东方白鹤的性别决定基因引物（Forward 5CACCCTGGATTGGACAACCTATITllC3and reverse 5 CACTCTITCCAGGAAATCAA3） 2、从鸡禽Z/W染色体纺锤体蛋白基因序列上一段相同的序列A set of primersCPEl5F(forward 5 7A AGCATAGAAACAATGTGGG AC3
6、7)CPE1 5R fre verse 5AACTCTGTCTGGAAGGACTT31，,25uL混合物，包括： 2 mmolLdNTP 0.4 umolLeach of primers 50 ng genomic DNA 1.0 U Taq polymerase(TAKARA)and onetenth volume of 10PCR buffer,扩增反应如下进行： 94下变性5min 94下35次循环变性80s 59退火90s 72延长60s 最后延长步骤在72下8min 最后在4保藏,8微升PCR产物复合物被2%琼脂凝胶分隔成100体积 用溴化乙锭染色 凝胶电泳分析系统分析,2.3Clo
7、ning and sequencing of PCR-amplified DNA fragment PCR扩增后DNA片段的克隆和测序 PCR产物被纯化后被转入JM109大肠杆菌中，然后质粒被提取出来。用双酶法来鉴定可能的克隆产物 每种克隆产物的两条单链被用来测序，DNA序列是用3.0版本的DNAMAN分析的,结果和分析,3.1 PCR amplification and sex identification PCR扩增和性别鉴定 135791113151620232425262729有两段被扩增，包括一条单独的W序列和一段内部控制序列（W/Z相同的部分） 剩余的只有一段被扩增,和哺乳动物相反
8、的是：鸟类是雌性配子异型，W和Z有一段相同序列可以被扩增，单东方白鹤的引物只是别W染色体的DNA序列，所以只有雌性的片段能被扩增 从图看出：1、3、5、7、9、11、13是雌性，2、4、6、8、10、12、18是雄性，虽然剩下的不清楚，但能够判断出15、16、20、23、24、25、26、27、29是雌性，14、17、19、21、22、28是雄性,3.2 DNA sequence analysis DNA序列分析 通过分析，得到了30bp性染色体，以前的结果说PCR产物大约300bp，我们的结果是相似的。 比较丹顶鹤和东方白鹤，有16个核苷酸是不同的，它们的相似度达94.77%，以前的研究表明
9、这些序列是保守的，现在的研究仍然正是这点，这是东方白鹤的性别决定引物能用于丹顶鹤性别鉴定的原因,29只丹顶鹤的性别能够成功鉴定归因于： 1、合适的性别有关的标记的选择：EEO.6 从禽类W染色体克隆的EcoR1片段（EEO.6）是不重复的，在Z染色体上有EEO.6的配对序列 EEO.6作为性别鉴定的靶子有一定的优势：在Carinatae and Ratitae 种族中序列是保守的，W和Z相关序列有显著的序列分歧,内部控制：从纺锤体蛋白的外显子分离出一段序列，这段序列在在所有鸟类W和Z相关序列是保守的 这个内部控制是为了防止出现假行结果：如果PCR产物不纯或者被污染，将出现次优结果或者目标部分被PCR扩增，从而出现假结果，两性中都有的纺锤体基因作为一种控制确保PCR扩增的成功,2、引物的正确应用 比较了12个物种的EEO.6序列和配对序列，选出4个前引物和3个反向引物 36个物种的性别可被成功鉴定,结论,用PCR技术和特殊的引物，丹顶鹤的性别科成功鉴定，这项技术还可用于其他形态学鸟类的性别鉴定,