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1、样品前处理技术基础理论,Waters Chemistry Operations,培训概要,样品前处理的重要性,重要性 样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样品制备方法和技术是一个重要问题。 由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。,为何需要样品前处理?,色谱分析的误差来源,为何需要样品前处理?,样
2、品前处理所消耗时间,对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器, 适当的样品前处理对于减少基质干扰和富集组分至关重要！,为何需要样品前处理?,60%以上的工作和费用花费在样品前处理上 三个目的: 除去样品基质中的干扰物 富集组分 增强仪器的性能,样品前处理原则,原则 制备过程中避免组分发生化学变化； 要防止和避免欲测定组分的沾污； 尽可能减少无关化合物引入制备过程； 尽可能简单易行。,样品处理一般性步骤,样品预处理技术,样品预处理的目的,除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 溶剂置换,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例 样品预
3、处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,常见样品前处理方法,常见样品前处理包括:,液液萃取,稀释,固相萃取,离心,过滤,样品前处理,沉淀,样品前处理的各种方法,方法 选择性基础 沉淀 溶解度 液液萃取 样品在两相中的分配 固相提取 样品在吸附剂上的吸附与分配 渗析/超滤 分子量与体积 电泳 电荷/淌度 蒸馏/蒸发 沸点与蒸气压,传统的样品前处理方式 液液萃取 (LLE),根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物从一相提取至另一相中。,装置简单 操作容易 常被认定
4、为成本低廉 费时费力 常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显著偏差(常在10%20%之间) 若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。 注: 大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影响，并可带来火灾隐患,有机层,水层,传统的样品前处理方式 蛋白质沉淀法 (PPT),1- 吸取200 L血浆 2- 加入400-600 l乙腈 3- 高速混合 4- 离心取上清液 5- 以水稀释后进样,在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除,简单快速 可被自动化，适用于高通量分析 若检测
5、限要求不高时较适用 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（此为LC/MS分析时遭遇离子抑制的根源!） 分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分析重现性不佳),固相萃取技术 (SPE) 先进的样品前处理方法,可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品 分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精
6、密度提高(偏差常 5%) 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求,依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）,概 念,固相提取（Solid Phase Extraction，SPE)是一种重要的样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展起来的。利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。,原理及特点,利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小差异实现净化分离。与传统的液液萃取相比具有明显的优势。,应用领域,已被广泛的应用于： 化学、化工行业
7、 制药行业 临床医学研究 食品安全领域 烟草行业 环境保护 中草药研究 ,固相提取技术 Solid Phase Extraction (SPE),色谱填料颗粒填装小柱 1978年由Waters首次推出商品化产品：,“Sep-Pak Cartridges” Sample Enrichment & Purification 非常成熟的技术 数千化合物的参考文献,梨的色谱分析：SPE的作用 不同提取过程的结果比较,固相提取技术 Solid Phase Extraction (SPE),两相 液相与固相 容易分离 多种吸附剂可供选择 反相最常用！ 正相 离子交换 具有高选择性的新型吸附剂 溶剂消耗少
8、与液液提取相比 减少人力与时间 容易自动化 液相色谱基础,HPLC 与SPE之区别,分离效率比较 - HPLC与SPE,常见固相提取小柱的构造,SPE 产品常见形式,萃取小柱: 小柱体积 135ml, 吸附剂重量 10mg6g 为中等数量样品设计 食品安全、环境分析和研究实验室,96-孔板: 吸附剂重量260mg 为高通量分析设计（DMPK/BA/BE实验室） Elution板用于微量样品和高灵敏度分析,在线SPE净化柱: 柱芯式(需Sentry Guard套件) 和标准柱 由切换阀和软件控制，无需人工操作,固相提取技术的基本要求,样品必须呈液态 驱动力(Driving Forces)操作方式
9、 重力 压力 真空,SPE技术的驱动力：重力,重力,SPE技术的驱动力：压力,压力,SPE技术的驱动力：压力,压力,Resevoir with Adapter,SPE技术的驱动力：真空,SPE技术填料颗粒基质,硅胶基质键合各种官能团 如，C18, C8, NH2, QMA . 不规则填料 小柱(Cartridges)： 40 - 80 m Disks：8 -10m 活性碳(AC2) 表面衍生剂涂层 (DNPH) 聚合物基质 (最新技术) Oasis 球形填料 30/60m,SPE填料的类型,正相填料 溶剂：正己烷 填料：硅胶（ Silica ）氧化铝, Florisil, 氨基, 二醇基, 反
10、相填料 溶剂：MeOH/水 填料：C18/C8/Oasis HLB 离子交换填料 溶剂：缓冲液/盐流动相 填料：Accell CM/Accell QMA/Oasis MCX/MAX/WAX/WCX,SPE各种填料,分离模式,反相 正相 离子交换 复合模式,分离模式,反相萃取 （极性液体相，非极性改良固体相） 疏水性相互作用 非极性非极性相互作用 范德华力或色散力 硅胶键合C18,C8, C4，C2,-苯基等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。,分离模式,正相萃取 （非极性液体相，极性改良固体相） 亲水性相互作用 极性极性相互作用 氢键 -相互作用 偶极偶极相互作用 偶极诱导偶
11、极相互作用 极性键合相，如硅胶键合NH2、CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。,正相溶剂洗脱强度,己烷 异辛烷 四氯化碳 氯仿 二氯甲烷 四氢呋喃 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙腈 异丙醇 甲醇 水,溶剂极性图,反相溶剂洗脱强度,分离模式,离子交换 带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面 按键合的离子基团的性质分类： 阳离子交换柱 阴离子交换柱 按在水溶液中解离的程度： 强酸性(SCX, Strong cation exchange) 弱酸性(WCX,We
12、ak cation exchange) 强碱性(SAX, Strong anion exchange) 弱碱性(WAX, Weak anion exchange),分离模式,反相吸附原理 离子交换原理,复合模式,Oasis 系列固相萃取吸附剂的演变: 从纯反相保留模式到复合保留模式(IE+RP),Oasis HLB Water wettable Stable across pH 1-14 No silanol interactions,Hydrophilic Retention of Polars,Lipophilic RP Retention,OH,N,CH,3,CH,3,普萘洛尔,H H,
13、+,反相作用,强阳离子交换作用,（碱性药物）,MCX吸附剂,N,O,SO-,3,SO-,3,Mixed Mode Cation eXchanger,Oasis MCX 吸附剂上碱性化合物的作用模式: Mixed-Mode Cationic-eXchanger,pKa 1,Oasis MCX SPE 吸附剂 净化和富集碱性化合物的强有力工具,pH,0,2,4,6,8,10,12,14,k,Acids (HA),Neutral,Bases (BH+),A-,B,(Oasis MCX 在所有pH下均带负电),O,对乙酰氨基酚,反相作用,强阴离子交换作用,（酸性药物）,MAX 吸附剂,CH3,CH2N
14、(R3)Cl -,CH2N(R3)Cl -,+,+,Quatenary amine,Oasis MAX 吸附剂上酸性化合物的作用模式: Mixed-Mode Anionic-eXchanger,pKa 18,Oasis MAX SPE 吸附剂 净化和富集酸性性化合物的强有力工具,pH,0,2,4,6,8,10,12,14,k,Acids (HA),Neutral,Bases (BH+),A-,B,(Oasis MAX 在所有pH下均带正电),若想在Oasis MCX/MAX吸附剂上净化和富集永久性带电的物质 (如季铵碱及其盐，有机磺酸及其盐，有机膦酸及其盐)，能否成功?！,永久性带电分析物带来
15、的挑战,k,Acids (HA),Neutral,Q. Base (Q+),A-,Q. Base (Q+),带永久性正电的季铵盐在Oasis MCX上时,pH,k,Neutral,Bases (BH+),B,RSO3-,带永久性负电的有机磺酸盐在Oasis MAX上时,Bases (BH+),B,A-,Acids (HA),RSO3-,Oasis WCX & Oasis WAX (2004) 专为永久性带电分析物所设计的吸附剂,Oasis WCX: Mixed Mode Weak Cationic Exchanger,Oasis WAX: Mixed Mode Weak Anionic Exc
16、hanger,阳离子交换作用,反相作用,戊沙溴铵 （季铵盐）,COO -,COO-,季铵盐在Oasis WCX吸附剂上的作用模式,羧酸的pKa 5,pH 3 吸附剂为电中性状态 pH 7 吸附剂呈完全负电状态,Oasis WCX,Mixed-Mode Weak Cation eXchanger,Oasis WCX SPE 吸附剂 净化和富集季铵盐和碱的最佳工具,pH,0,2,4,6,8,10,12,14,k,Neutral,Bases (BH+),Q+,B,Q+,WCX 带负电,WCX 不带电,Acids (HA),A-,WAX sorbent,Mixed-Mode Weak Anion eX
17、changer,阴离子交换作用,反相作用,哌嗪基团的pKa 6,pH 8 吸附剂为电中性状态 pH 4 吸附剂呈完全正电状态,磺酸盐 (Strongly Acids),有机磺酸盐在Oasis WAX吸附剂上的作用模式,Oasis WAX SPE 吸附剂 净化和富集磺酸盐、磷酸盐的最佳工具,pH,0,2,4,6,8,10,12,14,k,Neutral,Bases (BH+),RSO3-,B,WAX 不带电,WAX 带正电,Acids (HA),A-,RSO3-,固相提取技术的色谱基础,液相色谱如何实现分离？,如何在反相色谱条件下获得保留？,固相提取过程的一般步骤,一般性分析操作步骤,活化:依次
18、用强溶剂、弱溶剂（缓冲溶液）进行活化； 上样：用能够溶解样品的弱溶剂携带样品上柱，既要保证样 品分析物的有效溶解，又要确保溶剂强度不至于把被分析化合物从柱上洗脱下来； 淋洗：用具有一定强度的混合溶剂淋洗去除干扰杂质，确保杂质被洗脱，而被分析化合物有效的保留在柱上； 洗脱：用较强的溶剂把被分析化合物从柱上替换洗脱下来。,SPE技术对流速的一般要求,活化及平衡 5 -10 mL/min 上样 0.5 - 5 mL/min - 液流不能成线 清洗 1 - 5 mL/min 洗脱 0.5 - 5 mL/min- 液流不能成线 与SPE产品的规格及色谱类型有关,净化条件的确定：,根据化合物理化性质选择使用的SPE类型 制作化合物净化洗脱曲线，强溶剂-弱溶剂以不同比例，由弱 强逐渐增加洗脱强度，通过仪器测定的回收率来确定最佳的淋洗和洗脱溶剂组成和比例 在确定的洗脱溶剂比例条件下，进一步优化洗脱体积。,SPE使用注意事项及关键控制点,根据分析目标物的理化性质选择合适的SPE柱； 一般SPE柱要防止干涸； 注意控制柱载量，防止穿透过载； 严格控制上样液和洗脱液滴速； 防止混浊样品堵塞柱子； ,Questions ?,